临床基因扩增检验质量保证PPT课件.ppt

临床基因扩增检验的质量保证 卫生部临床检验中心李金明 1 质量保证 QualityAssurance QA 为一产品或服务满足特定质量要求提供充分可信性所必要的有计划的和系统的措施 2 室内质量控制 InternalQualityControl IQC 的概念 由实验室工作人员 采取一定的方法和步骤 连续评价本实验室工作的可靠性程度 旨在监测和控制本实验室工作的精密度 提高本室常规工作中批内 批间样本检验的一致性 以确定测定结果是否可靠 可否发出报告的一项工作 可概括为 1 执行者 实验室技术人员 2 目的 监测实验室测定的重复性 3 功能 决定了当批测定的有效性 报告可否发出 是对实验室测定的即时性评价 3 室间质量评价 ExternalQualityAssessment EQA 为客观比较一实验室的测定结果与靶值的差异 由外单位机构 采取一定的办法 连续 客观地评价实验室的结果 发现误差并校正结果 使各实验室之间的结果具有可比性 这是对实验室操作和实验方法的回顾性评价 而不是用来决定在实时的测定结果的可接受性 当EQA用来为执业许可或实验室认证的目的而评价实验室操作时 常描述为实验室能力验证 Proficiencytesting PT 在以前的文献中 EQA常描述室间质量控制 4 批 Run 在相同条件下所获得的一组测定 5 定义 正态分布 Gaussiandistribution 当一质控物用同一方法在不同的时间重复多次测定 当测定数据足够多时 如以横轴表示测定值 纵轴表示在大量测定中相应测定值的个数 则可得到一个两头低 中间高 中为所有测定值的均值 左右对称的 钟形 曲线 亦即正态分布 又称高斯分布 6 正态分布的基本统计学含义可用均数 X 标准差 s 和概率来说明 7 临床基因扩增检验实验室常规测定步骤 标本收集 选择测定项目 标本收集和保存 实验室测定 标本接收 贴标签 样本处理 核酸扩增 产物检测 测定的有效性和临床诊疗价值 报告和解释 结果发出 结果解释和临床管理 8 质量保证 室内质控和室间质评之间的关系 9 临床标本收集 运送 保存及其质量控制 标本收集标本保存标本运送 10 标本收集 标本采集时间对扩增检测结果的影响标本采集部位的准备标本的类型和采集量采样质量的评价采样及运输容器标本采集中的防污染 11 标本采集时间对扩增检测结果的影响 在疾病发展过程中 标本采集过早或过晚都可能会给出假阴性结果 12 标本采集部位的准备 血液标本采集分泌物标本 采集部位的清洁消毒可去掉污染的微生物或其它杂物 但应适度 过度清洁消毒有可能会去掉或破坏靶微生物 故标本采集部位的准备应由训练有素的人员进行 13 标本的类型和采集量 标本的类型 血清 浆 分泌物 痰 粪便 尿和脑脊液等 标本的采集量 应根据所测病原体而定 一般来说 如果标本的量对病原体培养够用的话 则其量亦足以用于核酸提取及其后的扩增检测 对于定量测定来说 对标本的收集要求更为精确 14 采样质量的评价 血清 浆 标本 溶血 脂血等 分泌物 痰 评价内容包括细胞组成 所需类型细胞的数量和核酸总量 评价方法 包括肉眼观察 显微镜下观察和化学分析等 15 采样及运输容器 标本的采集材料如棉签应为一次性使用 采样及运输容器应为密闭的一次性无菌装置 采样所用的防腐剂 抗凝剂及相关试剂材料不应对核酸扩增及检测过程造成干扰 16 标本采集中的防污染 采集中要特别注意污染 防止混入操作者的头发 表皮细胞 痰液等 如使用玻璃器皿 必须经高压灭菌 以使可能存在的RNase失活 17 标本保存 靶核酸 尤其是RNA 易受核酸酶的作用而迅速降解 因此标本的保存对于核酸扩增测定的有效性极为重要 使用GITC作为稳定剂保存标本 标本可在室温下稳定约7天 18 标本保存 临床体液标本长期保存应在 70 下 如为提取核酸后用于DNA扩增分析的样本 可于10mmol LTris 1mmol LEDTA pH7 5 8 0 缓冲液中4 下保存 用于RNA扩增分析的样本 则应于上述缓冲液中 80 或液氮下保存 核酸的乙醇沉淀物则可于 20 下保存 19 标本运送 样本一经采集 则应尽可能快的送至检测实验室 样本中如加入了适当的稳定剂 如用于RNA测定加入GITC的血清 浆 样本和用于DNA测定的EDTA抗凝血等 则可在室温下运送或邮寄 实验室应根据待测靶核酸的特性 对各种临床样本的运送条件作出相应的规定 20 临床基因扩增检验的室内质量控制 测定前的质量控制核酸样本的制备及其质量控制统计学质量控制质量控制的评价 21 测定前质量控制 实验室设施 仪器设备及管理理想的试剂和操作方法人员培训 22 实验室设施 仪器设备及管理 临床基因扩增检验实验室应有充分合理的空间 良好的照明和空调设备 实验室仪器设备应保养良好 实验用品要达到相应的要求 加样器的校准 带滤塞吸头的使用及质检 离心机 热循环仪 水浴箱和 或恒温干浴仪 酶标仪和洗板机 23 理想的核酸扩增实验室设计A 24 理想的核酸扩增实验室设计B 25 核酸扩增检测实验室设计的一般原则 各区独立注意风向因地制宜方便工作 十六字口诀 26 A B 27 28 29 30 传递窗 传递窗 传递窗 31 无基因 或 无核酸 概念的重要性 32 基因扩增仪器设备的质控 33 带滤芯吸头的使用及质检 首先制备一个含1 2 甘油及色素 如甲基橙 的水溶液 如果吸头的最大体积为100 l 则将加样器吸取体积调至110 120 l 再套上吸头后吸取上述有色液体 如果吸头质量好 则有色液体不应出现在滤芯之上 否则说明滤芯不严 34 核酸提取用离心管质检 离心管PCR抑制物质检其他 35 扩增仪孔间温度的重复性和均一性的检测方法 一是使用一种热电偶探针 微伏转换器和自动图示记录仪组成扩增加热模块孔内温度监测记录系统 当孔间温度变异超出1 时 其可测出来 具体做法是将装有TE缓冲液并上加石蜡油的扩增反应管放置于扩增仪各孔中 热电偶探针透过扩增反应管盖插至缓冲液中 然后按程序进行一个常规的PCR扩增 加热模块如为96孔 则至少要测定12孔不同位置孔内的温度 在整个扩增过程中 可移动热电偶探针至上述不同孔中监测温度 但每一孔内温度监测至少要有一个扩增周期 36 扩增仪孔间温度的重复性和均一性的检测方法 第二种方法并非直接测定孔内温度 而是通过扩增功能来间接获知孔间的均一性 即将加有一已知的含一定浓度的阳性质控样本的扩增反应管置于扩增仪各孔中按常规进行扩增检测 观察结果的一致性程度 如果有某一个或几个孔结果有问题 则应确定这一个或几个孔是否会重复性地得到假阴性结果 如果是 则表明相应孔的热传导有损坏 37 理想的试剂和操作方法 试剂盒的质检定量测定的精密度是测定组成步骤的变异和的平方根 SD 上式中SDa SDb SDc是步骤a b c等 例如试剂准备 标本采集 核酸提取 扩增和产物检测等 的标准差 38 理想的试剂和操作方法 改善测定精密度的措施必须首先着重在最不精密的步骤上 应对试剂准备 标本收集 核酸提取 测定方法和仪器操作写出 标准操作程序 SOP 39 实验室质量管理体系的建立 质量手册质量体系程序文件标准操作程序 SOP 相关记录表格 报告 40 存在问题 SOP 形式 缺乏可操作性记录 检查型 多而杂 质控 形式或没有分析 缺乏 41 实验室质量管理的内涵 写你所应做的做你所写的记录你已做的分析你已做的 42 看得见的看不见的 43 44 45 好习惯是生产力习惯即命运思维习惯与行为习惯罗马不是一天建成的 Romewasnotbuiltinaday 46 质量体系文件的三大特性 法规性 唯一性和适用性 法规性 是指文件一旦制定完成并批准实施 就必须认真执行 按照相应的文件去完成日常检验工作 也就是前面所说的做你所写的 并且文件的修改不能随意 只能按规定的程序进行 唯一性 则是指 1 一个实验室只能有一个质量体系文件系统 2 一项检验活动只能有唯一的操作程序 3 一项规定只能有唯一的理解 不产生歧义 4 只能使用文件的有效版本 无效版本在实验室的任何地方都不能使用 适用性 是指质量体系文件无统一格式 无标准文本 怎么做怎么写 切合实际 具有可操作性 不拘一格 所有文件的规定均应保证在临床实际检测工作中能完全做到 当发现文件有不适合情况时 则应立即按规定程序对文件进行修改 47 SOP等于试剂盒说明书吗 48 怎样编写SOP 49 SOP 5W和1H 谁来做 Who 责任人做什么 What 适用范围何时 When 适用范围何地 Where 适用范围为什么做 Why 目的如何做 How 操作步骤 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 实验记录表格的设计 71 存在问题 表格种类繁多重复记录表格无实用性 用于检查的痕迹很重 72 73 74 75 记录表格设计的基本原则 信息充分简单明了临床标本的检测信息能有机联系起来融入LIS系统 76 临床PCR检验流程记录表检验日期检验项目 扩增仪中保存文件名 使用说明 1 本记录表须严格遵循试剂准备区 标本制备区 扩增区 产物分析区 单一流向移动 严禁逆向移动 2 各项工作执行后 在相应叙述前的 内打 3 本记录表最后与相应的标本接收记录等归档保存于扩增区的专用文件柜内 以备查找 实验前准备 试剂在有效期内 扩增仪 加样器和温度计在校准的有效期内 生物安全柜的滤膜在使用有效期内 消毒溶液在有效期内 洗眼器内无菌生理盐水在有效期内 离心管 带滤芯吸头已经过质检合格操作者 77 试剂准备区 1区 实验前 打开通风设备 实验台面清洁 水或70 酒精擦拭 冰箱温度 冷藏室 2 8 冷冻室 18 2 实验室温度 允许范围 10 30 相对湿度 允许范围 30 80 PCR试剂来源 可直接列出有关厂家名称 批号 XXXXXXX检验项目 本次实验用量 人份 剩余量 人份 其他有关试剂配制 按XXX 将有关SOP编号列出 SOP配制1 含氯消毒液毫升 按XXX 将有关SOP编号列出 SOP配制4 NaOH溶液毫升 按XXX 将有关SOP编号列出 SOP配制0 1 焦磷酸二乙酯毫升 按XXX 将有关SOP编号列出 SOP配制毫升 其他 仪器设备使用 离心机 正常 不正常振荡器 正常 不正常超净台 正常 不正常实验后 按XXX 将有关SOP编号列出 SOP清洁实验室台面 地面 加样器和离心机 并进行紫外照射30分钟以上 按XXX 将有关SOP编号列出 SOP处理实验废弃物 操作者 78 标本制备区 2区 实验前 打开通风设备 实验台面清洁 水或70 酒精擦拭 冰箱 柜 温度 冷藏室 2 8 冷冻室 18 2 实验室温度 允许范围 10 30 相对湿度 允许范围 30 70 阳性室内质控物来源 浓度及批号 扩增位置 阴性室内质控物来源 批号 扩增位置 所取理的标本 对应标本接收的唯一编号 及拟扩增位置 191725334149 2101826344250311192735435141220283644525132129374553614223038465471523313947558162432404856核酸提取及加样过程 按XXX 列出编号 SOP进行 仪器设备使用 生物安全柜 正常 不正常恒温仪温度校准 离心机 正常 不正常振荡器 正常 不正常实验后 按XXX 将有关SOP编号列出 SOP清洁实验室台面 地面及仪器设备 按XXX 将有关SOP编号列出 SOP处理实验废弃物 操作者 79 80 另外两个存在较多问题的档案记录 人员的技术档案 一人一个档案 包括个人基本情况 学历 学位 任职资格 培训证 上岗证 荣誉证书等的复印件 论文 著作 成果等的目录和必要的证明文件复印件 培训考核的记录等 仪器设备的技术档案 一台仪器一个档案 包括仪器基本情况 如仪器设备名称 型号 序列号 生产厂家 购置日期 启用日期 目前放置地点 责任人等 仪器校准的记录 本次校准日期和下次应校准的日期 校准证书或数据 维修维护的历史记录 仪器使用说明书 注册证等的复印件 合格证书 配备的小配件如保险丝 灯泡等 81 人员培训 方法原理核酸扩增检测的关键环节仪器设备使用 维护和校准结果的分析 报告及进一步处理质控的分析知其然又知其所以然 82 实验室人员内部培训的重要性 外部培训提供的是 理念 是被动的 更多的是 学习 内部培训是主动的 源于实践 高于实践 更多的是 思考 83 人员培训 84 如何培训的举例 新购仪器设备的操作培训 在仪器购买合同中 加入培训的内容 厂家提供培训计划培训计划应包括 培训教材 含具体培训内容 如仪器操作及维护校准的SOP 安全性 培训者资质证明 培训所需时间与次数 需要接受培训方准备的条件 人员 用具和场地等 培训合格的考核方法及判断标准等 培训后保存所有有关记录 85 核酸样本的制备 扩增检测及其质量控制 一般核酸提取试剂促使靶核酸从细胞内释出的原理核酸的分离纯化靶核酸提取的质量临床标本及核酸提取中可能存在的抑制和干扰物质核酸样本制备及扩增检测的质控产物检测的质控 86 核酸的分离纯化 核酸的分离纯化就是要将蛋白 脂类等干扰核酸扩增的物质去除 经典方法硅吸附法对于商品核酸提取试剂盒 临床实验室在使用前 必须对其核酸提取纯度和效率进行评价 87 临床标本及核酸提取中可能存在的抑制和干扰物质 临床标本中 血清或血浆中的血红素及其代谢产物 痰中酸性多糖和糖蛋白成份 降解靶核酸的核酸酶等 核酸提取中 许多试剂如乙二胺四乙酸 EDTA 去垢剂如十二烷基硫酸盐 SDS 和chaotrope试剂如异硫氰酸胍和盐酸胍等 酚 氯仿 乙醇等有机溶剂 88 对临床标本中可能存在的抑制 干扰物的质控措施 质控措施 采用内质控 internalcontrol IC 通常称为内标 的方法内标有两种 即竞争性的和非竞争性的内标 89 核酸提取及扩增有效性的质控 已知弱阳性质控样本 基质与待测标本相同 至少带1份 其最后的检测结果 应是核酸提取和扩增检测的有效性的综合反映 已知阴性质控样本 基质与待测标本相同 至少带1份 扩增测定的结果可以判断核酸提取过程中是否发生污染 90 室内质控方法 非统计学方法统计质控方法 91 非统计学方法 在检测血液标本的同时 检测一定数量 与临床样本的数量相适应 的已知弱阳性 与试剂宣称的测定下限相适应 和阴性的质控样本检测有效的质控判断方法 阳性检测为阳性 反应性 阴性检测为阴性 非反应性 92 统计学质量控制 理想的室内质控样本的条件测定中质控样本的设置 数量及排列顺序统计学质控的特点统计质控方法 93 理想的室内质控样本的条件 基质与待测样本一致 所含待测物浓度接近试验的决定性水平 稳定 靶值或预期结果已定 无已知的生物传染危险性 单批可大量获得 价廉 94 测定中质控样本的设置 数量及排列顺序 标本量不大 如少于30份 定性测定有1份接近cut off的弱阳性和1份阴性质控样本应可以满足要求 样本量大 则可按比例增加 定量测定则要根据试验的测定范围 采用高 中 低三种浓度的质控样本 核酸提取时 质控样本要随机放在临床标本中间 至于在测定中的排列顺序 可排于标准品或校准品之后 临床样本之前 95 临床基因扩增检验室内质控的独特性 即监测污染发生的阴性质控的设置 可包括1份阴性原血清样本 1份在标本核酸提取过程中带入的一个空管和仅含扩增反应混合液的管 96 阴性原血清质控样本的功能 监测实验室的以前扩增产物的污染 由实验操作所致的标本间的交叉污染 扩增反应试剂的污染 97 在标本核酸提取过程中带入的一个空管的功能 监测实验操作过程中的实验室污染和标本间交叉污染 不能取代原血清阴性样本 98 仅含扩增反应混合液的管的功能 监测扩增试剂是否发生污染 具有较强的污染鉴别性 99 实验室是否发生污染的鉴别 可将一个或多个空管打开静置于标本制备区30 60分钟 然后加入扩增反应混合液同时以水替代核酸样本扩增 如为阳性 而上述仅含扩增反应混合液的管为阴性 则说明实验室以前扩增产物的存在 100 统计学质控的特点 检验误差有两类 一是系统误差 一是随机误差 系统误差通常表现为质控物测定均值的漂移 是由操作者所使用的仪器设备 试剂 标准品或校准物出现问题而造成的 这种误差可以通过前述的措施方法加以控制 是可以排除的 随机误差则表现为测定SD的增大 主要是由实验操作人员的操作等随机因素所致 其出现难以完全避免和控制 101 统计学质控的功能 统计学质控的功能就是发现误差的产生及分析误差产生的原因 采取措施予以避免 开展统计质量控制前 应将可以控制的误差产生因素尽可能地加以控制 这不但是做好室内质控的前提 也是保证常规检验工作质量的先决条件 102 统计质控方法 基线测定质控规则的表达方式及定义Levey Jennings质控图方法Levey Jennings质控图结合Westgard多规则质控方法累积和 CUSUM 质控方法 即刻法 质控方法 103 基线测定 最佳条件下的变异 Optimalconditionsvariance OCV 和常规条件下的变异 Routineconditionsvariance RCV 当RCV与OCV接近 或小于2OCV时 则RCV是可以接受的 以上为批间变异 批内变异的测定 室内质控物的测定准确度的评价 104 临床基因扩增检验IQC统计计算问题 可使用质控样本扩增后的IU ml来进行统计计算 也可用其对数值进行 由于基因扩增结果的原始数据通常很大 故使用其对数值来进行质控统计分析可能要更为方便一些 105 质控规则的表达方式及定义 质控规则的表达方式质控规则的功能常用质控规则的符号及定义 106 质控规则的表达方式 通常质控规则以符号AL来表示 其中A为质控测定中超出质量控制限的测定值的个数 L为控制限 通常用均值或均值 1 3SD来表示 当质控测定值超出控制限L时 即可将该批测定判为失控 常用的13S质控规则 其中1为原式中的A 3s为原式中的L 表示均值 3s 其确切的含义为 在质控测定值中 如果有一个测定值超出均值 3s范围 即可将该批测定判为失控 107 质控规则的功能 简单地说就是用于判断测定批的失控还是在控 108 常用质控规则的符号及定义 符号定义12S一个质控测定值超出 2s控制限 13S一个质控测定值超出 3s控制限 22S两个连续的质控测定值同时超出 2s或 2s控制限 R4S同一批测定中 两个不同浓度质控物的测定值之间的差值超出4s控制限 41S四个连续的质控测定值同时超出 1s或 1s控制限 7T七个连续的质控测定值呈现一个向上或向下的趋势变化 10X十个连续的质控测定值同时处于均值 X 的同一侧 109 Levey Jennings质控图方法 也称Shewhart质控图 是由美国的Shewhart于1924年首先提出 并用于工业产品的质量控制 二十世纪五十年代初 Levey Jennings将其引入临床检验的质量控制 经Henry和Segalove的改良 即为目前常用的Levey Jennings质控图 110 Levey Jennings质控图 111 112 Levey Jennings质控图基本的统计学含义 稳定条件下 在20个IQC结果中不应有多于1个结果超过2SD 95 5 可信限 限度 在1000个测定结果中超过3SD 99 7 可信限 的结果不多于3个 如以 3s为失控限 假失控的概率为0 3 113 114 假阳性 的统计学室内质控方法 基于日常检验的阳性率比值 呈正态分布 直接概率计算方法 不呈正态分布 115 即刻 质控方法 即刻法 的实质是一种统计学方法 即Grubs异常值取舍法只要有3个以上的数据即可决定是否有异常值的存在 116 室内质控数据的评价 IQC为一集体活动 除实际测定者外 还应有另外一人对测定数据进行质检 不能将IQC作为一个监察方法 当发现一次测定未达到质量标准时 应以建设性的而非批评的方式去探查失控的原因 除了将IQC数据作为日常质控外 还应定期评价累积数据以监测在测定操作中的长期变化趋势 评价应定期进行 117 分析你已做的 每次实验结果的分析表象与真象多次实验结果的综合分析趋势的内在含义仪器设备的使用情况分析维护与校准周期的有效性 118 弱阳性质控样本常见的失控原因 核酸提取中的随机误差 如核酸提取中的丢失 有机溶剂的去除不彻底 标本中扩增抑制物的残留等 仪器的问题 如扩增仪孔间温度的不均一性 孔内温度与所示温度的不一致性等 试剂的问题 如Taq酶和 或逆转录酶的失活 探针的纯度及标记效率和核酸提取试剂的效率等 119 120 阴性质控样本的失控原因 主要为扩增产物的 污染 和 或临床标本的核酸提取过程中发生的标本间的交叉 污染 121 122 一个临床PCR实验室对全年室内质控结果的分析举例 123 124 125 126 127 128 IQC的局限性 IQC可能测不出的误差测定前测定中测定后样本鉴定不对样本吸取不对结果记录错误样本贮存中变质试剂加入不对此类误差的发生率在不同的实验室有所不同 一般要求小于0 1 且应均衡地分布于测定前 测定中和测定后的不同阶段 129 影响临床基因扩增检验结果的最关键因素 产物 污染 Carry over 测定人员的操作 标本混淆 贴错标签 核酸提取等试剂 130 避免基因扩增检验假阳性结果的措施 严格的实验室分区 使用带 滤芯 的吸头 设立 阴性 质控 与标本同时处理 使用防 污染 含UNG 的PCR试剂 临床 假阳性 问题 病原微生物如结核杆菌经药物治疗后已死亡 但PCR仍可为阳性 故治疗结束后至少两周内不宜做PCR检测 131 避免基因扩增检验假阴性结果的措施 避免由于来自于标本的血红蛋白 肝素 某些激素或来自标本处理中的去垢剂 有机溶剂的抑制作用的措施 1 纯化核