HA-HI试验ppt.ppt

病毒的红细胞凝集实验 HA 和凝集抑制实验 HI 一 实验目的 1 掌握HA实验和HI实验和操作方法 2 掌握病毒凝集价 抗原效价 和凝集抑制价的判断 3 掌握鸡心脏和翅静脉采血法 4 掌握不同浓度红细胞悬液的制备 二 实验原理 某些病毒表面含有血凝素 能与鸡红细胞表面的粘蛋白受体结合 使红细胞发生凝集 称为病毒的红细胞凝集现象 简称血凝现象 这种病毒的红细胞凝集现象 可以被特异性免疫血清所抑制 称病毒的红细胞凝集抑制现象 HI 简称血凝抑制现象 通过HA HI试验 可用已知血清来鉴定未知病毒 也可用已知病毒来检查被检血清中的相应抗体和滴定抗体的含量 该试验适合于血清中新城疫 禽流感及减蛋综合征抗体效价的检测 三 在生产中的应用 1 检测血清中的抗体水平 根据抗体效价的水平确定免疫时机 2 免疫后及时监测 确认免疫效果 3 辅助诊断病毒性疾病病毒凝集红细胞的特性能被对应的抗体抑制 四 实验材料 以新城疫抗体效价检测为例仪器 96孔V型微量反应板 振荡器1台 振荡96孔V型板 微量移液器等 材料 新城疫浓缩抗原 1 的鸡红细胞悬液 生理盐水 待检鸡的血清 1 红细胞悬液制备 1 抗凝血的制备采集3只非免疫成年健康鸡血液 由翅静脉或心脏采血 按3 8 柠檬酸钠与血液1 4混合制成 2 1 红细胞悬液制备将抗凝血加入离心管内 用生理盐水洗涤5次 每次2000r min离心5min 将血浆 白细胞充分弃去 最后一次离心时间为10min 离心结束后 弃去上清液 根据剩下的红细胞体积 用生理盐水配制成1 红细胞悬液 五 实验方法与步骤 1 加稀释液用微量移液器向反应板的第1 12孔各加生理盐水50微升 2 首先用灭菌的生理盐水将鸡新城疫浓缩抗原作5倍稀释 然后用微量移液器吸取5倍稀释的抗原50微升于第一孔中 并反复吹打4 5次 混匀后吸出50微升至第2孔 依次倍比稀释到第11孔 从第11孔吸出50微升弃去 第12孔不加抗原作为红细胞对照 一 血凝实验 HA 抗原稀释倍数 3 加1 的鸡红细胞悬液用微量移液器向1 12孔各加1 红细胞悬液50微升 4 置于微量振荡器上 振荡1分钟 5 室温静置15 20分钟后观察结果 6 结果观察 方法1 从平面观察 红细胞为一小圆点沉于孔底者 表明红细胞未被或不完全被病毒凝集 如果孔底的红细胞铺平孔底 凝成均匀薄层 说明红细胞被病毒所凝集 如下图 方法2 将反应板倾斜45度角 沉于孔底的红细胞沿着倾斜面向下呈线状流动者 表明红细胞未被或不完全被病毒凝集 如果孔底的红细胞铺平孔底 凝成均匀薄层 倾斜后红细胞不流动 说明红细胞被病毒所凝集 如下图 7 判定结果 1 病毒凝集价 抗原效价 的判断 能使鸡红细胞完全凝集的病毒最大稀释倍数 称为该病毒凝集效价 以2的指数表示 病毒凝集价为28 2 4单位抗原的配制凝集价稀释倍数中所含病毒量为1个凝集单位的病毒 凝集价前面第二孔所含病毒量为4单位病毒 抗原应稀释的倍数 血凝滴度 4例 上图抗原效价为28 也就是说在第8孔中病毒的含量为1个凝集单位 那么第6孔中病毒的含量为4个凝集单位 则4单位抗原应将原抗原作26 64 倍稀释 即取0 1毫升抗原 加入6 3毫升生理盐水 2020 3 18 14 可编辑 五 实验方法与步骤 1 加稀释液用微量移液器向反应板的第1 12孔各加生理盐水25微升 2 倍比稀释被检血清用微量移液器吸取待测血清液25微升于第一孔中并反复吹打4 5次 混匀后吸出25微升至第2孔 依次倍比稀释到第11孔 弃去25微升 12孔不加血清作抗原对照 二 血凝抑制实验 HI 血清稀释倍数 3 加4单位抗原1 12孔各加25微升 4 置于振荡器上 振荡1分钟 室温静置20分钟 5 加1 的鸡红细胞悬液用微量移液器向1 12孔各加1 红细胞悬液25微升 6 置于振荡器上 振荡1分钟 室温静置20 25分钟后观察结果 7 结果观察 方法1 从平面观察 如果红细胞为一小圆点沉于孔底者 表明红细胞未被病毒凝集 即凝集现象被抑制 如果孔底的红细胞铺平孔底 凝成均匀薄层 说明红细胞被病毒所凝集 即凝集现象未被抑制 方法2 将反应板倾斜45度角 沉于孔底的红细胞沿着倾斜面向下呈线状流动者 表明红细胞未被病毒凝集 即凝集现象被抑制 如果孔底的红细胞铺平孔底 凝成均匀薄层 倾斜后红细胞不流动 说明红细胞被病毒所凝集 即凝集现象未被抑制 8 判定结果 1 血清抗体效价的判断 能够使4单位病毒凝集鸡红细胞的作用完全被抑制的血清最高稀释倍数 称为该血清的抗体效价 以2的指数表示 上图 血清抗体效价依次为28 27 28 29 28 27 27 26 孔号 123456789101112 2 判定标准 1 一般认为鸡的免疫临界水平为25 成鸡 或26 雏鸡 2 鸡血清的凝集抑制价 全部高于26可适当推迟新城疫免疫时间 全部低于24以下 应马上进行新城疫疫苗接种 七 注意事项 1 制作1 红细胞悬液所采用的鸡 应为未接种过新城疫疫苗的健康鸡 有抗体鸡提供的红细胞需要更多次数洗涤 2 每加一种样品都要换一个移液器的滴头 以影响实验结果 3 1 红细胞悬液4 保存 使用时轻轻摇匀 做同一次实验或测同一批样品不能更换更换红细胞 正常保存3天的红细胞不影响实验结果 七 注意事项 4 温度对试验结果也有影响 一般要求在室温25 37 进行实验 当温度低于4 时红细胞有时会发生自凝现象 冬季做该实验时由于环境温度过低 最好将反应板置于30 温箱中 5 96孔V型微量反应板是否洗净 是否光滑也会影响实验结果 96孔微量反应板的清洗方法 将浸泡有75 乙醇的棉签放入微量反应板的每个孔内旋转 用自来水冲洗反应板5次 再用蒸馏水冲洗3次以上 置37 温箱中干燥 思考题 1 如何进行禽流感H5 H9的抗体测定 如果检测被检血清中禽流感H5 H9的抗体效价 只需将新城疫抗原换为禽流感H5 H9抗原即可 检测方法完全相同 2 怎样通过HI试验鉴别新城疫和禽流感 八 实验后用具的处理 1 用过的反应板 微量滴头先用流水冲净 然后泡在清洁液中 24小时后捞出 甩掉清洁液 放入流水中冲洗干净后 在蒸馏水中冲洗一遍 甩干 摆