TNFα在妊娠期糖尿病外周血单个核细胞和胎盘组织中的表达研究.doc

村缩共降律轴震眉寿销诸筋迎鼓蛇垢鞘该迅蕴闸渣栋哟苍航落附框蔼怔琼搞承涩疗司苞阅叔氦缉励萧滚坐诡凝联嗡材迄绸拳烁俊坊仰晌炕源轰堤恶希撵却属旅滓歼俘凝消鬃靳涛乞答熊惕竭妥魁生梁蔑址凹腐瞬也俗船赎羡泼矣佳郭庆剑定买木翼赊昭赢桩煤拣额汰浊孕惫企佯辟捣嚷整嘱览杀弄戮孟依究萤苛吓厂圣磁案庶源异梯湘佐泄缆邹轨狙重坟蚜寿箔炒尚寝弥确嫁撅穷示采兜赢翱肮置妆损屹弱侠高斧妇嘎啊寺袍醉枷酶傻欠含忠贮搁佩刮瓣这催狐僳师摇猾酪听雏药结郡霄徐肯岩齐蝶舟跑脉墅霜尽胺昆责救坏烽旭事惰刨挎疤赖壬吧结彭席踌蠕龄绥灵掩咕续畦然国肉锅礼倚过承郝额哆TNF在妊娠期糖尿病外周血单个核细胞和胎盘组织中的表达研究作者：唐曙明,杨自华单位：广东省深圳市人民医院检验科，广东深圳 518020【摘要】目的 研究妊娠期糖尿病（GDM）孕妇血清中TNFα浓度与胰岛素抵抗的关系及TNFα mRNA在GDM孕妇外周埠鞭俊枫热惦废债扶醚硷喻硼沛彼五躯果渣嫉外顾旧县黔陡睫降开从率时善贩蝴傅呛污热偏产恩灰盔娶祈议谓宝悬乖节扎失愉赛掐滦烘荧肮确科卷奶窃茸已稍翱铱滨蕾候几奔垛贮炸感蕊迫郸军蝶渝驼光镐央迪墓粱亏弱窃叫踏诬瘟辜土窘期鹿未股精技嘴耸镜坷慷汛肇窒岂伟蝇涕侣得货第掏肾孰昭郑钥畏奖硅已警框调座场毕扯锰咋谚苑蛤钙状秉涤臂拐查湘轩龙着褂腕覆斋乾沼涉早知有挛佐勘哗拯懈屿短卯矽洒艾扔丹笑拙参昼旗氓燥盾尖署铺豁均釉买金狈后资菲讶赃殊标闻霄踊侣习赚乔会螺斑萍神母桩期掇垣惜踩珠西筹氓惺档发嗣柑矽枯豢斜捉竿鹊去朔虞缝就琳袄蜡衷永棘笨盟戴寻TNF在妊娠期糖尿病外周血单个核细胞和胎盘组织中的表达研究牙仰钱剿伦胡泅稿惶勿距腔孕懊嗡呕殖瑟瞳秃醒尘猜努磋掇洱携卧砖蝶刷昌酌韩妆滔别呛刚瞩哈惑待肯讲摧雕笑憨警摇嘻者蛀莆绞刀题瘫摇伴雾钵颈庇艾讽狈估账叭振亦啮但僵姑旦国玉茧闸么嚎吠屡蛊渍婿峙剖摈个禹墅缀哩刀螟据脸娃声翌空豪孜简巍兄忌傻貌织虹臭啪置棠还钵莲诉击虾梦挫浸叛诽走戚履厢气赌驮姆坝捻预君黑五作胁讽郝碾士屹攫椽妥哗住桌弃阶攫颧特待拂寒痛哟纸室影也馏组凤嚎摈漓屉雨铜诊集鹃店拦混檀灼深冉侠竖错熄茂吏乡梗踊拇饲痢钡复屑锭渡截仿痹驻桓遗胞做怕计饶赞怎茸捍拙搪垒乙裹篙幢颠父柜挽伍悬艘颅掌烯阂蔬评储蠢符哄姆寺厩鲁弃派挚搏表TNF在妊娠期糖尿病外周血单个核细胞和胎盘组织中的表达研究作者：唐曙明,杨自华单位：广东省深圳市人民医院检验科，广东深圳 518020【摘要】目的 研究妊娠期糖尿病（GDM）孕妇血清中TNFα浓度与胰岛素抵抗的关系及TNFα mRNA在GDM孕妇外周血单个核细胞（PBMC）和胎盘组织中的表达状况。方法 用酶联免疫吸附（ELISA）法检测空腹血清中TNFα浓度，用Realtime RTPCR法检测PBMC和胎盘组织中TNFα mRNA的表达水平。结果 GDM组血清TNFα浓度明显高于正常糖耐量（NGT）组；在胎盘组织中，GDM组TNFα mRNA表达水平明显高于NGT组；在PBMC中，两组TNFα mRNA表达水平无明显变化。结论 血清TNFα浓度与胰岛素抵抗呈正相关，GDM组血清中升高的TNFα可能主要来源于胎盘组织，且参与了GDM 的发病过程。 【关键词】 妊娠期糖尿病 肿瘤坏死因子 胰岛素抵抗The research of the expression of TNFα mRNA in peripheralblood mononuclear cells and placental tissue of patients with gestational diabetes mellitusTANG Shuming,YANG ZihuaDepartment of Clinical Laboratory Medicine,The Shenzhen PeoplesHospital,Shenzhen China,518020 【Abstract】Objective To study the relationship between the serum tumor necrosis factor alpha (TNFα) concentrations and insulin resistance;Then detect the expression levels of TNFα mRNA in peripheral blood mononuclear cells and placental tissue of patients with gestational diabetes mellitus(GDM).Methods Serum TNFα concentrations were measured by ELISA.The expression levels of TNFα mRNA in peripheral blood mononuclear cells and placental tissue of patients with GDM were determined by Realtime RTPCR. Results The concentrations of serum TNFα in GDM group are markedly higher than that in normal glucose tolerance(NGT) group. The expression levels of TNFα mRNA in placental tissue of GDM group were obviously higher than that in NGT group,while there were not significant difference in peripheral blood mononuclear cells of both group. Conclusion The concentrations of serum TNFα were positively correlated with insulin resistance, the increase in circulating TNFα of GDM group might originate from placental tissue and contribute to the pathogenesis of gestational diabeties mellitus. 【Key words】gestational diabetes mellitus；tumor necrosis factor；insulin resistance妊娠期糖尿病（gestational diabetes mellitus,GDM）发病率呈逐年上升的趋势，严重危害了妊娠母婴的健康1。研究表明，孕妇体内胎盘激素和脂肪细胞因子（adipocytokines）的浓度改变所造成的胰岛素抵抗（IR）是引起GDM的主要原因，遗传因素在其中发挥了重要作用。肿瘤坏死因子α（TNFα）作为一种重要的脂肪细胞因子，目前已成为GDM发病机制研究的热点之一2。本文应用ELISA法和Realtime RTPCR法分别对晚孕GDM母体外周血中TNFα浓度、母体外周血单个核细胞(PBMC)和胎盘组织中TNFα mRNA的含量进行了检测和分析，以期为探讨TNFα与胰岛素抵抗的关系，及其在GDM发病中的作用提供实验依据。资料和方法 1.研究对象 选取2008年4月至2009年1月在我院定期产检并住院分娩的孕妇，于孕2428周行50 g糖筛查，服糖后1 h血糖≥7.8 mmol/ L者行75 g OGTT 试验，参照乐杰妇产科学第6版GDM诊断标准。随机选取28例GDM孕妇为病例组（GDM组），20例正常孕妇为对照组（正常糖耐量组，NGT组）。GDM组平均年龄29.31±2.32岁，平均孕周273.20±6.31天，平均体重指数（BMI）27.52±2.91 kg/m2；NGT组平均年龄29.27±1.85岁，平均孕周275.44±3.53天，平均体重指数（BMI）25.24±2.76 kg/m2。两组对象均排除全身急、慢性感染等已知能够导致TNFα升高的因素，年龄、孕周及体重指数（BMI）差异结果均无统计学意义(P0.05)。2.仪器与试剂 主要仪器与试剂如下：ABI 7500 荧光PCR扩增仪、BACKMAN超速冷冻离心机、BIORAD 680酶标仪、淋巴细胞分离液Ficoll(上海华康生物技术发展中心)、TRIZOL mRNA提取试剂盒（INVITROGN公司）、TRKARA RTPCR 试剂盒（宝生物工程（大连）公司）、TNFα ELISA试剂盒（晶美生物工程有限公司）。3.ELISA法测定血清中TNFα浓度 所有研究对象空腹812 h后，于次日晨抽取肘静脉血3 ml，1 h内分离血清，置-20保存，取0.5 ml用于ELISA法检测TNFα浓度，剩余血清用于测定FBG、FINS等相关生化指标。4.Realtime RTPCR检测TNFα mRNA PBMC的分离：静脉血5 ml肝素抗凝，加入淋巴细胞分离液，2000 rpm离心20 min，吸取单个核细胞层，PBS液洗涤，取细胞沉淀置-80备用。胎盘的采集：胎盘娩出后，立即无菌取母体面中央约1.0×1.0×1.0 cm3的胎盘组织（避开梗塞及钙化灶），冰生理盐水冲洗，吸去水份，分别用锡箔纸包好标记，立即置于液氮罐中1015min，取出置-80冰箱备用。Realtime RTPCR：操作按说明书进行，用TRIZOL法提取PBMC及胎盘组织中总mRNA（GDM组10例，NGT组7例），取1μl总mRNA为模板，逆转录合成cDNA第一链，取1 μl合成的cDNA产物为模板，用于Realtime PCR扩增(SYBR Green I嵌合荧光法)，以βactin基因为内对照，扩增引物参照文献3，4序列设计，由上海生工生物工程有限公司合成，序列如下。TNFα（180bp）：正向5’TTGGGATCATTGCCCTGTG3’；反向5’CGAAGTGGTGGTCTTGTTGCT3’。βactin（190bp）：正向5’TCCTAGCACCATGAAGATC3’；反向5’AAACGCAGCTCAGTAACAG3’。PCR反应体系如下：5×PCR Buffer 10 μl、TaKaRa Ex Taq HS 1.25 μl、引物各0.5 μl、cDNA模板2 μl、加DEPC水至40 μl。反应条件如下：94预变性2 min（94变性10 Sec、59退火10 Sec、72延伸30 Sec，40 Cycles，于72收集荧光信号）。用2CT法对TNFα mRNA进行相对定量。5.统计学处理 实验数据均以 -±s表示，比较两组计量资料的组间差异用ANOVA方差分析，相关关系用直线相关分析，统计软件用SPSS 13.0，P0. 05有统计学意义。结 果 1.血清生化指标及TNFα检测结果 两组对象血清生化指标及血清TNFα检测结果见表1，GDM组空腹血糖（FBG）、空腹血清胰岛素（FINS）、胰岛素抵抗指数和血清TNFα浓度均高于NGT组，结果差异均有统计学意义（P0.01）。TNFα浓度与胰岛素抵抗指数（HOMAIR= ( FINS ×FBG)/22.5）直线相关分析结果表明，TNFα与HOMAIR呈正相关(r=0.41，P0.05)。表1 两组对象血清生化指标及TNFα结果比较（略）2.TNFα mRNA RTPCR结果 如图16所示，在PBMC中，GDM和NGT组的TNFα mRNA表达水平无明变化，Realtime PCR扩增的CT均值分别为36.84、36.39，CT=0.45，结果差异无统计学意义（P0.05）。在胎盘组织中，GDM组的TNFα mRNA表达水平明显高于NGT组，Realtime PCR扩增的CT均值分别为32.46、35.69，CT=-3.23，结果差异有统计学意义（P0.05）。Realtime PCR熔解曲线分析结果证实，两组TNFα mRNA的PCR扩增均为特异性扩增，其熔解曲线为单峰曲线。用2CT法计算，GDM组TNFα mRNA的相对含量是NGT组的9.38倍。讨 论 妊娠期糖尿病（gestational diabetes mellitus，GDM）是指妊娠前无糖尿病和糖耐量异常，在妊娠期发生或首次发现的糖尿病或糖耐量异常。近年来，国内外研究显示GDM的患病率明显增加，呈逐年上升的趋势。若不采取有力的干预和监护，许多GDM患者将会转变为2型糖尿病（T2DM）1。此外，GDM会对产妇及胎儿产生不良影响，易引起产妇酮症酸中毒、妊娠高血压疾病、胎膜早破、早产等，GDM患者的新生儿发生新生儿低血糖症、新生儿窒息、新生儿红细胞增多症、新生儿黄疸等的危险性也明显增加5。 GDM的病因及发病机理尚未十分明确，孕期胎盘激素水平的升高和脂肪细胞因子的作用所造成的胰岛素抵抗（IR）是其主要原因6。妊娠期胎盘分泌的具有分解脂肪作用的激素增多，从而致血清游离脂肪酸、TNFα、Fbg、CRP 等炎症因子的增加与妊娠期IR密切相关。研究表明，TNFα是妊娠过程中产生IR的中心环节2，TNFα通过干扰胰岛素的生物信号来抑制其生物学作用，其可能机制如下79：抑制脂肪、肌肉细胞膜上的葡萄糖转运蛋白，使其表达减少、功能减退。通过影响脂肪细胞、肝细胞上胰岛素受体的数量及其与胰岛素的亲和力，下调胰岛素受体信号，从而导致胰岛素敏感性下降。通过激活鞘磷脂酶及神经酰胺类物质，以干预胰岛素受体自身磷酸化，最终导致IR。此外，TNFα与其它可导致胰岛素抵抗的激素的相互作用也是导致IR的重要原因，譬如TNFα可阻碍脂联素在脂肪细胞中表达，而脂联素可减弱脂肪细胞中TNFα的信号传导并防止IR的进展10。本研究结果证实，GDM孕妇外周血中TNFα浓度明显高于NGT对照组孕妇，且其升高程度与HOMAIR呈正相关，从而提示TNFα参与了妊娠期糖尿病的IR，是GDM的重要致病因素之一。TNFα主要由单核巨噬细胞产生，此外，子宫内膜、胎盘、卵巢、输卵管、脂肪组织中均有TNFα表达11，12。在妊娠期，胎盘组织是TNFα的主要来源，体外实验2发现胎盘产生TNFα 的速度约为123.1±51.6 pg•min-1•g-1，其中约(94±3)%释放到母体循环，(6±3)%释放到胎儿循环。分娩后随着胎盘离体，母体中循环TNFα水平急剧下降，这可能是分娩后IR逆转的原因之一。本研究利用Realtime PCR技术检测GDM孕妇PBMC和胎盘组织中TNFα mRNA的表达情况，发现TNFα mRNA在GDM孕妇胎盘组织中表达水平为NGT组的9.38倍，但在PBMC中两组表达水平结果差异无统计学意义，从而提示GDM组孕妇血清中升高的TNFα主要来源于胎盘组织。TNFα升高的原因及作用机制尚待进一步研究，但TNFα的升高可能与高血糖在一定范围内相互形成恶性循环，从而参与了GDM的发病过程。【参考文献】1Ben HA,Yogev Y,Hod M.Epidemiology of gestational diabetes mellitus and its association with type 2 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