NCBI基本功能与引物设计ppt.ppt

NCBI常用功能与引物设计 2010级博士 谢鹏 导师 邹晓庭 Yoursitehere 为何要接触NCBI 如何使用NCBI 如何设计引物 Yoursitehere NCBI简介 NCBI NationalCenterforBiotechnologyInformation美国国家信息技术中心 http www ncbi nlm nih gov 1992年10月 NCBI承担起对GenBankDNA序列数据库的责任 NCBI工作人员通过来自各个实验室递交的序列和同国际核酸序列数据库 EMBL和DDBJ 交换数据建立起数据库 Genebank是遗传序列数据库 一个所有可以公开获得的DNA序列的注释过的收集 GenBank以指数形式增长 核酸碱基数目大概每14个月就翻一个倍 最近 GenBank拥有来自47 000个物种的30亿个碱基 Subtitle NCBI常用功能 查找核酸 氨基酸序列 序列相似性分析 引物验证 Yoursitehere 一 查找核酸 氨基酸序列 1 以鸡FAT CD36为例 search 2 调整右侧检索目录 tree list Yoursitehere 3 浏览信息 下载序列 并以Genebank FASTA格式保存 点击Genebank 氨基酸序列 Genebank核酸序列 FASTA格式的核酸序列 Yoursitehere 二 序列相似性分析 序列相似性分析 就是将待研究序列与DNA或蛋白质序列库进行比较 用于确定该序列的生物属性 也就是找出与此序列相似的已知序列是什么 完成这一工作只需要使用两两序列比较算法 常用的程序包有BLAST FASTA等序列同源性分析 是将待研究序列加入到一组与之同源 但来自不同物种的序列中进行多序列同时比较 以确定该序列与其它序列间的同源性大小 这是理论分析方法中最关键的一步 完成这一工作必须使用多序列比较算法 常用的程序包有DNAMAN CLUSTAL等 Blast简介 BLAST 局部相似性基本查询工具 BasicLocalAlignmentSearchTool 的缩写 是由NCBI开发的一个基于序列相似性的数据库搜索程序 主要的Blast程序 Blast序列相似性分析 1 修改测序结果 剔除克隆载体序列 在测序结果中找到上下游引物对应位置 剔除引物外的多余部分 以鸽子的I FABP片段为例 GCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATTAGGAAGTTAGGAGCCCACGATAATCTGAAGATCACTATTCAACAAGATGGAAACAAATTTACGGTCAAAGAATCAAGCAACTTCCGTACTATAGATATTGAATTCACTCTGGGAGTCAATTTTGACTACAGTCTCGCTGACGGAACGGAAATCTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGT 上游引物 5 AGRAARYTDGSAGCYCAC 3 下游引物 5 TCHGTYCCRTCWGCBAGA 3 TAGGAAGTTAGGAGCCCACGATAATCTGAAGATCACTATTCAACAAGATGGAAACAAATTTACGGTCAAAGAATCAAGCAACTTCCGTACTATAGATATTGAATTCACTCTGGGAGTCAATTTTGACTACAGTCTCGCTGACGGAACGGA Yoursitehere 2 进入NCBI3 点击BasicBLAST中的nucleotideblast选项 Yoursitehere Yoursitehere 4 寻找相近物种 比较相似性 Yoursitehere 点击score 获得相似性比较具体信息 NCBI官方说明 http www ncbi nlm nih gov BLAST tutorial Altschul 1 html Yoursitehere 引物设计与简并PCR RT PCR原理与技术简介引物设计过程简并PCR技术后续研究 Yoursitehere RT PCR原理与技术简介 DNAmRNA蛋白质 酶活力Westernblot Northernblot半定量RTPCR定量RTPCR Yoursitehere RT PCR原理与技术简介 1 2 Yoursitehere 常规引物设计 引物设计原则Primer5和Oligo6进行引物分析 2020 3 18 21 可编辑 Yoursitehere 引物设计原则 引物的长度一般为15 30bp 常用的是18 27bp 但不能大于38 因为过长会导致其延伸温度大于74 即Taq酶的最适温度 引物3 端的序列要比5 端重要 引物3 端的碱基一般不用A 因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高 另外引物间3 端的互补 二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败 5 端序列对PCR影响不大 引物的GC含量一般为40 60 以45 55 为宜 过高或过低都不利于引发反应 PCR引物的GC AT比率应当等于或高于所要放大的模板的GC AT比 G值 自由能 反映引物与模板结合的强弱程度 一般情况下 引物的 G值最好呈正弦曲线形状 即5 端和中间 G值较高 而3 端 G值相对较低 且不要超过9 G值为负值 这里取绝对值 引物二聚体及发夹结构的能量一般不要超过4 5 否则容易产生引物二聚体带 Yoursitehere 以鸡的I FABP为例 设计常规引物 1 输入I FABP的已知序列 点击primer Yoursitehere 2 点击search进行引物条件设置 3 Searchcriteria筛选 Yoursitehere 4 选择最优引物 5 手动修改 调整引物 Yoursitehere Blast引物验证 最为重要的环节 对自己设计的引物或文献报道的引物进行测试 1 登陆NCBI Blast Primer BLAST http blast ncbi nlm nih gov Yoursitehere 以文献报道鸡的MUC2的引物为例 Yoursitehere Yoursitehere Yoursitehere 简并引物设计 Moreofanartthanascience降低简并度 500以下 例如 上游DYNLFDLL下游PVNGNGKQ根据密码子表建立引物系列http www kazusa or jp codon 谨慎使用次黄嘌呤 GAYTAYAAYYTNTTYGAYYTNYTN CCNGTNAAYGGNAAYGGNAARCAR SymbolDefinitionBnotADnotCHnotGIInosineKGorT UMAorCNA C GorT URAorGSCorGVnotT UWAorTYCorT U 简并引物 在常规引物的某些位点上以简并核苷酸代替 Yoursitehere 简并引物设计过程 传统方法 适用于保守度高序列 应用BLAST进行同源序列搜索应用DNAMAN选择保守区域 氨基酸或核苷酸 简并引物设计原则Primer5和Oligo6进行引物分析CODEHOP法 适用于保守度低序列 Yoursitehere 应用BLAST进行同源序列搜索 剪切然后粘贴DNA或蛋白序列 使用FASTA格式的序列 FASTA格式的序列以一个单行的说明开始 说明行以其开始处的一个大于号 与序列数据区分开 说明行以下是序列数据 简单使用访问编号 RefSeq或Genebank序号 http www ncbi nlm nih gov Yoursitehere Yoursitehere DNAMAN分析序列保守区 对Gallus Taeniopygia Mus Ruttus的I FABP的CDS进行分析得到保守区序列 Yoursitehere CODEHOP 原理方法 http bioinformatics weizmann ac il blocks codehop html Yoursitehere 简并PCR技术 RNA cDNA cDNA 反转录 合并产物 分装产物 actin 样品 PCR Yoursitehere 简并PCR技术 使用标准的反应体系并适当增大引物浓度 1 3 M 退火温度是最关键点