基因工程(基因工程的主要技术与原理-核苷酸序列分析)PPT课件.ppt

基因工程 生物技术专业核心课程 淮阴师范学院高清松 1 基因功能的研究是生命科学中的主要课题 基因测序是基因操作中最基本的技术之一 其首要条件是获知目的基因的核苷酸排列顺序 即基因测序 2 第四节DNA核苷酸序列分析 Nucleotidesequenceanalysis 3 基因测序方法 Maxam Gilbert化学降解法 双脱氧链终止法 Sanger酶解法 4 一 Maxam Gilbert化学降解法 1977年 A M Maxam和W Gilbert首先建立了DNA片段序列的测定方法 由于该方法是用特定化学试剂修饰不同碱基 并在相应碱基处切断DNA片段而进行系列分析的 故称之为Maxam Gilbert化学降解法 5 将一个DNA片段的5 端磷酸基作放射性标记 一 基本原理 分别采用不同的化学试剂修饰和裂解特定碱基 从而产生一系列长度不一而5 端被标记的DNA片段 通过凝胶电泳分离这些以特定碱基结尾的片段群 再经放射自显影 就可确定各片段末端碱基 从而得出目的DNA的碱基序列 6 核心原理 利用特定的化学试剂对不同碱基进行特异性切割 硫酸二甲酯 G哌啶甲酸 G和A肼 NaCl C肼 T和C 7 待测DNA G A G C T C 放射性标记5 末端 限制性酶切 R 变性 放射性自显影只显示标记的单链 特异性切割 8 G A G C T C 凝胶电泳分离 放射自显影确定末端碱基 9 1 标记 将待测DNA片段的5 端磷酸基作放射性标记 二 基本步骤 2 裂解 修饰和裂解特定碱基 随机产生一端被标记的 起始位点相同的 不同长度的 以不同碱基结尾的DNA片段群 3 分离 通过凝胶电泳分离片段群 4 推导 再经放射线自显影 确定各片段末端碱基 从而得出目的DNA的碱基序列 10 G A G C T C CTTTTTTGGGCTTAGC 凝胶电泳分离 放射线自显影分析 3 5 5 3 11 Maxam Gilbert化学降解法的测序长度大约为250个碱基 适合G C含量较高及较短的寡核苷酸片段的测序 三 化学降解法的应用 从DNA两端分别测定同一条DNA核苷酸序列 相互参照测定结果 可以得到准确的核苷酸序列 Maxam Gilbert化学降解法不需要进行酶催化反应 因此 不会产生由于酶催化反应而带来的误差 12 操作繁琐 Maxam Gilbert化学降解法的缺陷 化学试剂毒性较大 放射性同位素标记效率偏低 放射自显影曝光时间长 人工读取数据费时费力 13 二 双脱氧链终止法 1977年 英国的F Sanger充分利用DNA复制的生物学特性 设计了一种通过DNA复制来识别4种碱基的方法 即双脱氧链终止测序方法 dideoxychaintermination 或称Sanger酶学法 14 5 磷酸核苷酸的基本结构 15 一 基本原理 在DNA聚合酶的作用下 双脱氧核苷酸分子可以象正常核苷酸一样参与DNA合成 但是 由于它自身3 位置 OH的缺失 至使下位核苷酸的5 磷酸基无法与之结合 从而导致反应终止 并产生长度不一的DNA片段 通过凝胶电泳分离 放射自显影确定DNA片段末端的碱基 进而推断DNA的核苷酸序列 16 ddNTP掺入到DNA合成反应后导致反应终止 正常的DNA合成反应 17 基于双脱氧核苷酸的这种特性 Sanger于1977年建立了以双脱氧链终止反应为基础来测定DNA序列的方法 该方法以待测DNA为模板 在DNA聚合酶的催化作用下合成新的DNA链 反应体系中除含有四种脱氧核苷酸 dATP dCTP dGTP和dTTP 外 加入了一种双脱氧核苷酸 ddATP或 ddCTP或 ddGTP或 ddTTP 18 在DNA合成过程中 标记的 ddNTP将与相应的dNTP竞争掺入到新合成的DNA互补链中 如果是dNTP掺入其中 DNA互补链则将继续延伸下去 如果是 ddNTP掺入其中 DNA互补链的合成则到此终止 而双脱氧核苷酸的掺入是随机的 故各个新生DNA片段的长度互不相同 19 H ddNTP 20 ddATP ddCTP 21 通过聚丙烯酰胺凝胶电泳能分辨出小至一个碱基长度差异的DNA片段 从而将混合产物中不同长度DNA片段分离开 22 再通过放射自显影曝光 根据片段尾部的双脱氧核苷酸读出该DNA的碱基排列顺序 23 模板变性 dnaturetemplate 将待测DNA模板与引物混合 通过加热使模板变性 退火 annealing 将变性的模板与引物混合物缓慢降温 使引物与模板结合 标记 labeling 利用放射性同位素标记核苷酸或引物 延伸 extension 和终止 termination 反应体系中新生核苷酸的合成和随机终止过程 电泳分析和数据读取 聚丙烯酰胺凝胶电泳 放射自显影 读取DNA的碱基排列顺序 二 序列分析的基本步骤 24 3 G CATNNNNNNNNNNNNNNN 5 待测模板 5 C GTA 3 引物 ddATP ddTTP ddGTP ddCTP 延伸终止反应 25 电泳方向 链终止反应的测序结果 26 链终止反应的测序结果 5 CCCGTAGTAGTCGTGCCCGCTACCGCTAGGACCCAGAAAGCCA 3 27 链终止法和化学修饰法的缺点 需要放射性同位素作为标记物对序列胶的要求较高操作步骤繁琐 效率低 速度慢判读时即花时间又乏味 28 三 DNA序列分析的自动化 该测序方法是1987年 由美国Perkin Elmer公司应用生物系统部门 AppliedBiosystem 的研究人员首先设计开发出来的 并设立了相关的测序程序和试剂盒以及ABI系列自动测序仪 其核心技术在于使用荧光染料标记代替同位素标记 29 基本原理 基于Sanger双脱氧链终止法的原理 只不过不用同位素标记ddNTP 而是用四种不同的荧光染料分别标记ddATP ddTTP ddCTP ddGTP 这四种荧光染料在激光激发下发出不同波长的荧光 因而每一种荧光代表一种碱基 30 延伸中的DNA互补链分别终止于不同荧光标记的ddATP ddTTP ddCTP ddGTP 四种连终止反应可在一个试管中进行 并在同一条泳道中检测 反应产物在聚丙烯酰胺凝胶电泳或毛细管电泳中按相差1个核苷酸大小的DNA片段长度顺序向下泳动 当到达检测器时 激光探测仪发出激光 激发DNA片段发出荧光 荧光信号传输至计算机便可自动排列出DNA的核苷酸序列 31 激光激发 荧光信号 A G T G C C A C G T 电泳 链终止反应 32 序列结果 红色代表T 绿色代表A 兰色代表C 黑色代表G 测序仪ABIPrism310Geneticanalyzer实际测得的一段DNA序列结果 33 ABIPrismDNASequencer3130 ABIPrismDNASequencer3730 34 使用毛细管凝胶电泳分离链终止反应产物 可大大增加测序的通量 根据毛细管的数量的不同 一台仪器可同时完成96个样品或更多样品的分析 全自动测序具有较高准确性和安全性 操作相对简单 可供大规模操作 而且 一次测序反应提供的数据也增大 一般同位素标记的测序只能读出200 300个核苷酸序列 而荧光标记测序则可读出500 800个核苷酸序列 35 问题 利用双脱氧链终止法测定DNA序列时 需要一段已知序列的寡核苷酸引物 因此 对于一段未知序列的DNA片段 如何选择测序引物 一次测序只能读出800个核苷酸 对于较长的DNA片段 如何测序 36 1 通用引物指导未知序列的测定 对于一段未知序列的DNA片段 可以将其装载在载体上 这样 待测DNA片段的两端就相当于添加了已知序列 因此 可根据载体序列设计通用引物测定待测DNA核苷酸序列 37 2 引物步移测定大片段DNA核苷酸序列 在待测DNA片段中 如果知道部分核苷酸序列 就可以根据该已知序列设计引物来测定其相邻部位的序列 并可依次类推 直至测出全部待测序列 这种方法称为引物步移 PrimerWalking 38 四 DNA序列的信息分析 寻找开放阅读框 预测外显子和内含子 分析调控序列 在公共基因数据库中寻找相似的序列以及相似性比较等 1 基因序列的信息分析 预测RNA二级结构 计算折叠数等 2 RNA结构分析 预测蛋白质的二级结构 三级结构及功能等 3 蛋白质序列的信息分析 39 GenBank 美国 基因数据库及分析工具 基因数据库 EMBL 欧洲 DDBJ 日本 40 NCBI 美国国家生物技术信息中心 http www ncbi nlm nih gov 基因分析工具 EMBL 欧洲生物信息学研究所 http www ebi ac uk Sanger中心 基因组测序中心 http www sanger nlm nih gov ExPASy 瑞士生物信息学研究所蛋白质分析系统 http www expasy