实验报告 天花粉蛋白的分离纯化.doc

天花粉蛋白的分离纯化一实验目的1、掌握蛋白分离纯化的步骤；2、掌握紫外吸收法定量测定蛋白质含量的原理和方法；3、了解紫外分光光度计的构造原理，掌握它的使用方法。二实验原理天花粉蛋白(Trichosanthin,TCS)是从葫芦科栝楼属植物栝楼的根块中提取出来的一种碱性蛋白,属于型核糖体失活蛋白。由247个氨基酸组成，分子量为27000，具有抗艾滋病的效果。由于蛋白质中络氨酸、色氨酸的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在280nm波长处，核酸分子吸收高峰在波长260nm处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值（O.D280）与其含量呈正比关系，可用作定量测定。利用紫外吸收法测定蛋白质含量由于受到核酸分子中嘌呤、嘧啶等吸收紫外线物质的干扰，而导致此方法准确度较差。三实验方法步骤1、将低浓度盐溶抽提5小时，离心4000rpm，10分钟的天花粉蛋白沉淀用0.1mol/l KCl 50ml提取1小时，离心4000rpm，10分钟。2、通过查硫酸铵饱和度常用表，加硫酸铵53.46g至40%饱和度，放置3h，离心4250rpm，15分钟，再收集上清液（取一毫升上清液待测）。准确测量上清液体积为240ml，补加硫酸铵58.8g至75%饱和度静放置1h，离心4000rpm，10分钟，收集沉淀。用约0.5ml测定蛋白质含量，并用免疫扩散法鉴定。3、4下将蛋白溶液对水透析3小时，搅拌、换水2次，再对0.05m pH6.4磷酸缓冲液透析过夜，取样测定蛋白质含量。4、 称取DEAE-纤维素50g装柱，用0.05m pH6.4磷酸缓冲液平衡，将已透析的蛋白溶液上柱分离，以平衡缓冲液淋洗。用紫外检测仪监测，收集穿透峰部分。取样测定蛋白质含量。配制含0.5mNacl的0.05m pH6.4磷酸缓冲液300ml，淋洗DEAE纤维素柱，收集洗脱峰部分并取样测定含量。5、 量取50ml琼脂糖装柱，用0.05m pH6.4磷酸缓冲液平衡，将收集的DEAE-纤维素柱分离的穿透峰部分上样，用平衡缓冲液淋洗杂质，分部收集。淋洗液紫外吸收组分取样测定含量，至杂质全部淋洗出后，换用0.3m Nacl的磷酸缓冲液洗脱，收集洗脱峰取样测定蛋白含量及用免疫双扩散法检定，蛋白溶液用聚乙二醇浓缩后保存。6、 取石英比色杯2只，分别装好对照物和蛋白质样品在280nm和260nm波长测定吸收值，确定这2值的比值。并以此比值在表中查出校正因子，最后得出蛋白含量。4 实验结果1.紫外检测仪记录（多出来的部分为撕纸过程留下的）2、蛋白质含量测定数据透析液穿透峰洗脱峰总体积21ml98ml7.4ml稀释倍数10106O.D.2801.0580.0800.349O.D.2600.8900.0460.168O.D.280/O.D.2601.1891.7392.077五数据分析与讨论 通过紫外检测仪的记录图可以看出，峰高而窄，说明我们选的量程过小，淋洗速度过快没有控制好流速。同时，图谱还有拖尾漂移的现象。在本实验当中，我们实验组得出的O.D280/O.D260比值分别为1.189、1.739、2.077。理论上要先计算出O.D280/O.D260的比值后，从表中由对应的比值查出校正因子计算出该溶液的蛋白质浓度。而一般纯蛋白的光吸收比值（A280/A260）约为1.8，而纯核酸的比值约为0.5。那么得出的透析液中蛋白质含量为21mg/ml，穿透峰蛋白质含量为2.1mg/ml。由于洗脱峰比值大于2.0，那么其计算采用消光系数，为A280/0.696，得出其值为3.01mg/ml。实验结果基本上和我们的实验初衷吻合，完成了实验任务，达到了我们实验目的。但是由于我们采用的校正因子是查表而非自己通过梯度稀释校正拟合得出的，会存在很大误差。同时，天花粉蛋白的分离纯化实验本身步骤比较繁琐，在样品的提取、沉淀、洗脱过程当中，重复出现的离心、静置、透析也会因为实验条件和实验操作有差异。总体感觉人为因素影响比较大。就比如在离心过程中时间或转数按照书上的要求去做的话沉淀效果就不明显从而影响接下来的实验，我们的定量利用紫外线吸收法测定蛋白质含量，迅速、简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。但是测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，而且不同的蛋白质和核酸的紫外线吸收是不相同的，即使经过校正，测定结果也还存在一定的误差。此次试验学习中，让我觉得课前预习是很重要的，我本科阶段没有做过接触过生物实验，对于这个实验非常陌生，它每一步骤的目的和意义没怎么搞懂，就像无头苍蝇一样没有一点头绪，师兄师姐说什么我们就做什么，等再回过头的时候就觉得一些重要的点又没记下来，光跟着做实验了。所以只有在课前进行了认真的预习，才能在课上更好的学习，收获的更多、掌握的更多。在实验中需要注意的事情很多，但也是因为这些事情让我们能体会到，实验需要的是严谨的思维，需要认真的去想，每一步都要做的很严谨，不然就会产生不该产生的误差影响最终的数据结果，导致实验失败。一些很小的细节都会决定实验的成功与否。