急性犬瘟热感染组织脏器的研究.doc

急性犬瘟热感染组织脏器的研究临床中的犬瘟热病毒感染多为急性和亚急性型，犬年龄在6月龄左右，其症状和病毒复制的脏器都与慢性病例有很大区别。临床上急性病例的主要病变集中在肺脏和淋巴组织，组织病理学观察到犬淋巴结炎和多核巨细胞性肺炎。1材料与方法1.1材料1.1.1病料新沂市城区肉狗养殖基地，急性犬瘟热病死犬4只，心脏、肝脏、肺脏、肾脏、淋巴结、膀胱、大脑和脾脏。1.1.2主要试剂二甲苯I、二甲苯II、ph6.0、0.01的柠檬酸溶液、100%乙醇II、95%乙醇、75%乙醇、3%过氧化氢、pbs液等。1.1.3主要仪器组织切片机、恒温培养箱、光学显微镜等。1.2方法1.2.1组织病理学检测临床剖检，采集脏器包括心脏、肝脏、肺脏、肾脏、淋巴结、膀胱、大脑和脾脏。制作组织切片，使用10%的福尔马林中和缓冲液固定组织，石蜡包埋，切成5txtn的切片，用常规的苏木精和伊红染色，在光学显微镜下观察。1.2.2免疫组织化学方法(1)脱蜡脱水：组织学切片在经二甲苯I一=甲苯II各60min脱蜡，100%乙醇I、100%乙醇II、95%乙醇、75%乙醇逐级脱水，每级5min。(2)抗原修复：ph6.0，0.01的柠檬酸溶液高压煮沸3min。(3)封闭内源性酶：在组织切片上，滴加3%过氧化氢，以组织完全覆盖为宜，在室温下处理20min。以封闭内源性过氧化物酶。pbs洗涤3次，5rain/次。(4)封闭：滴加5%山羊血清于组织切片上，在37下反应30min，封闭非特异性结合位点。(5)一抗孵育：滴加最佳稀释度的单抗(1:200)37复温45min，弃去单抗，pbs洗涤3次，5min/次。(6)二抗孵育：滴加辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠二抗(1:500)，在37中反应45min洗涤6次，5min/次。(7)显色：滴加DAB反应液，室温下反应510mhl，显色后充分洗涤，终止反应。(8)复染：苏木精溶液染色30-,60s，乙醇盐酸分色2s，水中冲洗5mhl。(9)脱水封片：经75%、95%、100%各级乙醇，每级3rain。入乙醇和二甲苯(1：1)溶液2rain，入二甲苯中5min至透明，加中性树胶后盏盖玻片，封片，镜检。2结果2.1组织病理学观察2.1.1大脑大脑白质和灰质中病理病变不明显，在部分大脑灰质区域观察到小胶质细胞靠近神经元胞体的现象一嗜神经现象。神经元胞体中尼氏小体正常，无明显组织病理学变化。2.1.2肺脏泡腔中有大量的炎性细胞浸润，纤维素性渗出，血管充血，出血，肺泡腔中出现多核巨细胞，胞浆深染，胞浆中有5-7个细胞核排列在胞体的周边，诊断为典型的犬瘟热多核巨细胞性肺炎。2.1.3淋巴结光学显微镜下观察，低倍镜下可见，可见到淋巴结结构疏松，淋巴细胞减少，被膜下淋巴窦增宽，质区染色浅，淋巴小结结构不明显。高倍镜下，观察到皮质区被膜F淋巴窦和皮质淋巴窦中，有大量吞噬异物的巨噬细胞，网状内皮细胞增生，淋巴结髓质区大最淋巴小结被破坏，渗断为淋巴节炎。2.1.3膀胱膀胱粘膜完整，在400倍光学显微镜下可以观察到，在犬膀胱粘膜变移上皮中出现犬瘟热病毒包涵体。2.2免疫组织化学结果2.2.1大脑光学显微镜下观察免疫组化切片，大脑白质和灰质的神经元细胞、小胶质细胞、锥状细胞和星形胶质细胞内均没有观察到有犬瘟热病毒抗原特异性染色。2.2.2肺脏光学湿微镜下观察免疫组化切片，在肺脏的支气管上皮细胞和巨噬细胞中观察免疫标记呈阳性，但是阳性细胞量较少。2.2.3淋巴结光学显微镜下观察免疫组化切片，在淋巴结皮质的淋巴小结中有强免疫标记阳性反应。而在髓质区则表现为免疫标记呈阴性反应。2.24膀胱在膀胱黏膜上皮中没有观察到包涵体免疫标记阳性反应。3讨论本次试验所选4只病犬年龄均小于3个月，属于急性犬瘟热感染病例。在肺炎致死的病犬的免疫组织化学结果可以观察到在肺脏的部分支气管上皮免疫标记呈阳性，但是在肺泡中很少观察到犬瘟热病毒免疫标记阳性的细胞。当犬瘟热病毒感染机体后，可以增加血管的通透性，破坏机体免疫组织器官中淋巴细胞的生成，抑制体液免疫和细胞免疫作用的发挥，产生免疫抑制作用，肺脏是动物机体与外界联通的脏器，容易受到各种微生物的感染，发生多种细菌和犬瘟热病毒混合感染的情况。同时，观察到病犬血液循环中的细胞因子的浓度减少，细因子的分泌合成受到抑制，导致动物生理功能紊乱，使动物肺炎加剧，最终导致死亡。即动物往往死于严重的肺炎，犬瘟热病毒是导致其死亡的间接因素。这和本观察到的结果相吻合，免疫组织化学观察结果显示，犬瘟热病死犬的肺脏并不是犬瘟热病毒繁殖数量最多的脏器，也就不是最适合作为分离病料的组织脏器。此外，病料组织在处理过程中也会释放一些细胞毒性因子，在将这些处理材料用于接种细胞时，其内的细胞毒性因子产生了不利于细胞的作用。另有试验表明，在犬瘟热感染的急性病例中，早期犬瘟热病毒主要在巨噬细胞中繁殖，随后在肺泡二型细胞和肺细胞中复制。组织病理学观察结果表明，在犬膀肤粘膜上皮中可以观察到病毒包涵体。但是在免疫组织化学染色结果并没有染出犬瘟热病毒包涵体。认为犬瘟热病毒包涵体并不都对犬瘟热病毒的抗体免疫阳性反应，有可能是因为犬瘟热病毒包涵体中包括的是大量的病毒元件，这有可能会阻碍了特殊的单克隆抗体和病毒的抗原的结合。国外文献记录了使用犬瘟热病犬的尿液作为临床诊断犬瘟热病毒的样本，确定了犬瘟热病毒通过尿液排毒，进行传播的一个重要途径。淋巴结组织病理学观察结果表明，淋巴结皮质区T细胞和B细胞的消耗，同时伴随有淋巴结髓质区网状细胞增生，淋巴小结消失，由增生的巨噬细胞和网状细胞增生填充，淋巴结髓质中仅残存少量淋巴小结，诊断为淋巴结炎。采用免疫组织化学分析，结果发现在淋巴结的皮质部淋巴小结和皮窦中有大量免疫标记呈阳性的细胞。其密度和阳性反应强度均高于其他组织器官，与本实验观察到的结果相一致。B细胞在淋巴小结和边缘被膜下淋巴窦中数量最多。而T细胞则主要集中在皮质深部的厚层弥散淋巴组织一副皮质区。犬瘟热抗原物质主要聚集在T细胞聚集的区域。这与本实验观察的结果相一致，犬瘟热病毒在感染早期和急性病例中会主要感染T细胞和B细胞，同时使巨细胞和淋巴细胞坏死破裂，造成免疫抑制。4结论在犬瘟热急性病例中，淋巴组织是犬瘟热病毒最好的分离脏器。神经组织例如大脑作为常用的犬瘟热病毒分离材料，但在免疫组织化学染色和组织病理学检查结果显示其病变并不明显。实验中剖检的6只临床急性犬瘟热病犬全部出现了神经症状包括：抽搐、后肢瘫痪和共济失调等，但是组织病理学观察结果显示