重组人白介素-18诱导表达.ppt

重组人白介素 18诱导表达 纯化与免疫印迹鉴定 药用蛋白的基因工程路线 获得目的基因 质粒重组 构建工程菌 目的蛋白表达 纯化蛋白 免疫印迹 生物活性测定 药理活性 药剂学 临床应用 实验技术路线 诱导培养 细胞破碎 电泳检验 纯化蛋白 转膜反应 免疫鉴定 显色反应 诱导培养 取2mL种子液接入100mL培养液 加入Amp 100mg mL 至终浓度50ug mL 在250ml摇瓶中于37 剧烈培养1h 吸出1mL未经诱导的培养物放在一个Ep管中 按下面步骤5和6所述进行处理 在剩余培养物中加入IPTG 100mmol L 至终浓度1mmol L 37 继续通气培养 在诱导的不同时间 如0 5 1 1 5 2和3 取1mL样品放于Ep管中 室温高速 12000rpm 离心2min 沉淀悬于100uL的1 SDS凝胶加样缓冲液 沸水浴加热5min 点动离心 冰上放置 待全部样品处理完后上样 细胞破碎 培养到3h后 收集剩余培养物 于4 下4000rpm离心10min 倒置离心管 尽量去掉上清培养液 用10ml去离子水重悬菌体 超声破碎细胞 仪器设置 功率600W 破碎5s 空闲5s 重复200次 冰浴试管 在超声破碎的时候始终保持低温 4 下4000rpm离心10min 将上清转移到新的离心管 用10mL去离子水重悬沉淀 取50ul沉淀重悬液留样 4 下10000rpm离心20min 将上清液经0 45um的滤膜 去除细胞碎片 将过滤液转移到新的离心管中 储存于4 冰箱待用 取50uL上清液留样 用10ml去离子水重悬沉淀 取50uL重悬液留样 纯化蛋白 用结合缓冲液平衡5个柱床体积 流速2ml min 将10mL上清液上样 流速为1mL min 用另一离心管承接样品 反复上样1h 取最终流出液体50ul留样 用结合缓冲液再洗5个柱床体积 流速2ml min 用25mmol L的咪唑洗脱液洗脱 洗脱5个柱床体积 流速为2mL min 收集洗脱峰50ul留样 用50mmol L的咪唑洗脱液洗脱 洗脱5个柱床体积 流速为2mL min 收集洗脱峰50ul留样 用100mmol L的咪唑洗脱液洗脱 洗脱5个柱床体积 流速为2mL min 收集洗脱峰50ul留样 用300mmol L的咪唑洗脱液洗脱 洗脱5个柱床体积 流速为2mL min 收集洗脱峰50ul留样 用400mmol L的咪唑洗脱液洗脱 洗脱5个柱床体积 流速为2mL min 收集洗脱峰50ul留样 将所有留样样品内加入50uL的2 SDS凝胶加样缓冲液 混合 沸水浴加热5min 点动离心 准备上样 用去离子水洗5个柱床体积 再用20 乙醇洗3个柱床体积 流速为2mL min 将柱子封存于4 冰箱保存 电泳检验 凝胶配方 单板凝胶 凝胶点样 转膜反应 取纯化的目的蛋白上样20ul 电泳上样 120V 电泳1h 停止电泳 要先将玻璃板撬掉才可以剥胶 将浓缩胶轻轻刮去 最后将溴酚蓝的前沿切下 将取下的凝胶放入转移缓冲液中 浸泡15min 按照取下凝胶的大小 剪取等大的硝酸纤维素膜 也浸泡在转移缓冲液中15min 将凝胶与硝酸纤维素膜重合 在左上角剪个小口做标记 再剪取同样大小的两张厚滤纸 使用之前要在转移缓冲液中浸泡一下 滤纸不要比凝胶和膜大 以免短路 将转移电泳槽中的夹子打开 也浸泡在转移缓冲液中 白色一面在底下 在上面垫一张海绵垫 用玻璃棒来回擀几遍以擀走里面的气泡 在垫子上垫滤纸 一手固定滤纸 一手用玻璃棒擀去其中的气泡 接着放上硝酸纤维素膜 再放上凝胶 凝胶之上再放滤纸 滤纸 膜 凝胶和滤纸之间要对整齐 最后盖上另一个海绵垫 擀几下就可以合起夹子 整个操作在转移缓冲液中进行 将夹子放入转移槽中 要使夹子的黑面对应阴极 夹子的白面对应阳极 电转移时会产热 将转移电泳槽下端接上自来水 冷凝循环 打开电源 200mA 1 5h 将硝酸纤维素膜取出放在平皿中 加入适量丽春红染色液 在摇床上染色5分钟 后用流水冲掉染液 观察现象 免疫反应 将膜用TBST浸湿后 移至含有封闭液的表面皿中 室温下 用封闭液在摇床上摇动封闭过夜 正面朝上 从封闭液中取出膜 在含有TBST的表面皿中洗涤5min 反复3次 将膜 正面朝上 放入含有一抗的自封袋中 放入37 摇床温育1h 从封闭袋中取出膜 在含有TBST的表面皿中洗涤5min 反复3次 将膜 正面朝上 放入含有二抗的自封袋中 放入37 摇床温育1h从封闭