用16S rDNA方法鉴定细菌种属.doc

. 用16S rDNA方法鉴定细菌种属一、实验目的1. 掌握16S rDNA对细菌进行分类的原理及方法；2. 掌握DNA提取、PCR原理及方法、DNA片段回收等实验操作。二、实验原理细菌rRNA（核糖体RNA）按沉降系数分为3种，分别为5S、16S和23S rRNA。16S rDNA是细菌染色体上编码16S rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌染色体基因中。16SrDNA鉴定是指用利用细菌16SrDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。包括细菌基因组DNA提取、16SrDNA特异引物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA测序、序列比对等步骤。是一种快速获得细菌种属信息的方法。16S rDNA是细菌的系统分类研究中最有用的和最常用的分子钟，其种类少，含量大（约占细菌RNA含量的80），分子大小适中，存在于所有的生物中，其进化具有良好的时钟性质，在结构与功能上具有高度的保守性，素有“细菌化石”之称。在大多数原核生物中rDNA都具有多个拷贝，5S、16S、23S rDNA的拷贝数相同。16S rDNA由于大小适中，约1.5Kb左右，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。16SrRNA的编码基因是16SrDNA，但是要直接将16SrRNA提取出来很困难，因为易被广泛存在的RNase降解，因而利用16S rDNA鉴定细菌，其技术路线如下：细菌培养液基因组DNA16S rDNA片段连接克隆载体阳性克隆鉴定测 序片段回收DNA提取PCR扩增细菌基因组的提取：得到胞内可溶物质菌体破碎纯化DNA分离出DNAPCR的基本原理 ：PCR技术的基本原理 类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的 寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成： 模板DNA的变性：模板DNA经加热至93左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； 模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引 物与模板DNA单链的互补序列配对结合； 引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制 链重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。二、操作步骤1、细菌基因组DNA提取；2、PCR扩增；3、细菌基因组DNA及PCR产物的电泳检测；4、扩增片段回收；5、DNA片段测序。三、结果处理与分析在回收扩增片段时，紫外灯下条带呈现绿色荧光，将凝胶中绿色荧光部分切割分离出来，放入已称重的2ml离心管中，空的离心管为1.02g，放入回收的凝胶后为1.42g，则凝胶为400mg，因此加入的Binding Buffer为1200l。我们小组选用B1 16S sequence，以下为制作进化树过程：1、根据B1 16S 基因序列，到NCBI 上比对，确定其种属（1）NCBI 主页（/）依次点击进入BLAST （2）选择nucleotide BLAST（3） 将B1 序列复制到文本，框里Choose Search Set 处点复选按钮others，最后点BLAST（4） 点击BLAST后，数据进行提交。BLAST 结果如下：图中“Evalue” 指标与其他指标不同，它的数值越小相似程度越高，其他几个（如Totle score）都是数值越高相似度越高。我组将数据按照Query cover从100%开始从大到小排列，从不同相似度一共选出14组数据。（5）导出数据数据导出格式选择FASTA：（6） 选择大肠杆菌作为外属，导出大肠杆菌（7） 下载MEG并安装，我组使用的是MEGA5.02，并将B1序列导入MEG（8） 通过Edit中的Copy及Paste将B1序列和大肠杆菌序列导入我们选中的14个序列中（9） 选择W 中Align DNA，然后点击OK（10）选择Date中的MEGA Format，生成meg文件（11） 打开.meg文件（12） 生成进化树（13） 导出文件，我组导出PDF格式2、 进化树B1应该属于Proteus（变形杆菌属）电泳图谱：从右数第四个条带为本组电泳条带，条带清晰且明亮，无明显拖尾以及弥散，表明DNA提取和PCR扩增非常顺利，所得目的片段完整，数量较多。四 交流与讨论1.细菌中包括有三种核糖体RNA，分别为5S rRNA、16S rRNA、23S rRNA，rRNA基因由保守区和可变区组成。16S rRNA对应于基因组DNA上的一段基因序列称为16S rDNA。5S rRNA虽易分析，但核苷酸太少，没有足够的遗传信息用于分类研究；23S rRNA含有的核苷酸数几乎是16S rRNA的两倍，分析较困难。而16S rRNA相对分子量适中，又具有保守性和存在的普遍性等特点，序列变化与进化距离相适应，序列分析的重现性极高，因此我们选择16S rRNA进行提纯测序2.用试剂盒提取RNA，一定要注意盒内药品名称，不要弄错3.提取DNA过程中，加入GA缓冲液后，一定要小心吹打混匀，但要注意不要产生气泡。4.制作PCR扩增产物的过程中，第一步要先加水，因为DNA液和其他药品太少，不事先加水，会是使其他样液加到离心管壁上或根本加不进来，造成样液损失。5.我组的DNA电泳虽然亮度略低，但是PCR产物条带清晰明亮，同时并无拖尾现象，说明我组DNA扩增之后含量很高，而且质量也很好6.PCR反应五要素：引物(PCR引物为DNA片段，细胞内DNA复制的引物为一段RNA链）、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+作为聚合激活剂）。通过这次实验我学到了鉴定细菌种属的一种方法，16Sr DNA法，虽然按照试剂盒进行实验操作非常简单，但这次实验的目的并不在于完成一次实验得到实验结果，而在于通过这一次实验学会举一反三，切实地应用到以后的科研实验中去。关于试剂盒的使用，我们不仅要明白如何使用，更要清楚其原理，明白用代称命名的一些试剂的用途以及可能成分，这非常有利于以后的科研工作。同时，操作过程中严格按照步骤进行，注意试剂的使用不要出错。电泳图谱中第一块胶是提完DNA之后、进行PCR之前的样品所跑的电泳条带，能看出条带的表明提取到