《细胞工程》实验指导书.doc

细胞工程实验指导书 实验指导书课程细胞工程授课专业生物工程、生物技术主编徐艳实验一实验室的概况与培养基母液的配制 一、实验目的熟悉植物细胞工程实验室的基本结构、必须的基本设备及其用途与作用方法，掌握配制培养基母液的基本技能。 二、材料与用具 1、药品生长调节类物质、无机盐类、有机化合物等。 2、用具分析天平、移液管、量筒、培养瓶、烧杯、冰箱、母液瓶等。 三、教学时数4课时。 四、实验内容（一）实验室的基本结构及主要设备 1、洗涤室水槽、工作台、蒸馏水器等功能器皿及材料洗涤；蒸馏水制备。 2、消毒室高压蒸汽灭菌锅、烘箱等功能器皿的干燥；器皿及培养基的消毒。 3、试剂室试剂柜、冰箱功能存放试剂及器皿。 4、准备室工作台、天平、水浴锅、电炉、显微镜及各种玻璃仪器、金属仪器等功能培养基药品称量、配制、分装、灭菌；材料预处理；培养材料的观察分析。 5、接种室（含缓冲室）超净工作台、接种箱等功能无菌操作。 6、培养室培养架、摇床等功能培养物的控制培养。 7、驯化移栽室如温室、大棚等功能试管苗的驯化移栽。 （二）培养基母液的配制 1、MS基本培养基母液各成分单独称量、单独溶解后混合定容大量元素母液10倍，1L注意CaCl2.2H2O易与其他成分反应产生沉淀；微量元素母液100倍，0.5L铁盐母液100倍，0.5L注意两者等体积溶解后混合，且需80水浴1h充分螯合，等待冷却后定容；有机母液100倍，0.5L母液种类成分规定用量(mg/L)扩大倍数称取量(mg)母液定容体积(ml)配1LMS培养基吸取量(ml)大量元素KNO3NH4NO3MgSO4.7H2O KH2PO4CaCl2.2H2O I900I6503701704401019000165003700170044001000100微量元素MnSO4.4H2O ZnSO4.7H2O H2BO3KI Na2MoO4.2H2O CuSo4.5H2O CoCl2.6H2O22.38.66.20.830.250.0250.02510022308606208325252550010铁盐Na2-EDTA FeSO4.7H2O37.327.81003730278050010有机化合物烟酸甘氨酸Vit.B1Vit.B6肌醇0.51.00.10. 510010050100105010000500102、激素类母液的配制1mg/ml的6BA50ml先用0.1molL的HCL或NaOH溶解后再加水定容；0.1mg/ml的NAA50ml先用少量0.1molL的NaOH溶解后再加水定容。 注精度要求精确到小数点后三位。 （三）培养器皿的洗涤 1、对污染的培养器皿先进行消毒灭菌处理； 2、清除残渣，用清水洗净，浸泡于合成洗涤剂中6-24小时； 3、用洗涤刷洗涤，并用自来水冲洗干净； 4、用烘箱烘干或晾干，存放于防尘橱内备用。 五、实验相关记录 1、母液制备表培养基成分规定用量（mg/L）浓缩（扩大）倍数制备（定容）体积理论称取量（g）实际称取量（g）配1LMS培养基吸取量(ml) 2、试剂标签例母液名称浓缩倍数制备培养基取用量制备日期制备人激素母液名称母液浓度制备日期制备人MS大量10100ml/Lxx-3-3007园林 （1）组NAA0.1mg/mlxx-3-3007园林 （1）组实验二培养基的配制与灭菌 一、实验目的了解培养基灭菌的原理，熟悉培养基的组成和要求，掌握固体培养基配制和灭菌的基本技能。 二、材料与用具 1、药品各种母液、琼脂、白糖、NaOH、PH试纸等。 2、用具分析天平、移液管、量筒、电炉、灭菌锅、培养瓶等。 三、教学时数8课时。 四、实验内容（一）培养基的制备 1、按配方要求称好6-10g/L琼脂放入锅中，加入2/3-3/4终体积的水，加热煮化，一般先用旺火烧开，再用文火煮溶，并注意经常搅拌，防止糊底； 2、按配方要求称好15-30g/L糖，待琼脂加热溶化后加入； 3、根据培养基配方，按照各种母液顺序和规定量，用移液管吸或量筒取母液，放在烧杯中，待琼脂和糖充分溶解后加入； 4、加水定容，并充分混匀； 5、用0.1mol/L的HCl或NaOH调整PH至规定范围； 6、将培养基分装至培养容器内，每瓶培养基深度保持在1cm左右； 7、封口，并准备灭菌。 （二）培养基的灭菌培养基分装完后应在24h内灭菌 1、打开锅盖，加水至水位线； 2、把已装好培养基的培养瓶，连同蒸馏水及接种用具等放人锅内，装时不要过分倾斜培养基，以免弄到瓶口上或流出，且物品体积不大于锅内总体积的80%； 3、盖上锅盖，对角旋紧螺丝，接通电源加热； 4、打开安全阀和排气阀排放冷气，至大量白色蒸汽冒出时关闭加压升温，或者关闭安全阀和排气阀，当压力升至005MPa时，打开放气阀放气至大量白色蒸汽冒出时关闭加压等温； 5、当气压上升到1210C时，保持在121-1250C之间灭菌20min左右，停止加热； 6、由慢到快缓慢排气，当气压回0后打开锅盖，取出培养基，放于无菌空间的平台上冷凝备用。 注意冷空气必须充分排尽，否则灭菌不彻底，容易污染；灭菌时间应根据器皿体积严格控制，否则易破坏PH值及化学物质，产生有害物质且培养基不易凝固；灭好的培养基不要放置时间太长，最多不能超过2周。 五、实验相关记录培养基制备表培养基配方母液名称MS大量MS微量MS铁盐MS有机BA NAA母液浓度培养基体积取用母液量（ml）实验三外植体的灭菌与接种 一、教学目的了解外植体灭菌的原理，熟悉无菌空间的灭菌方法，掌握外植体的灭菌方法步骤及无菌操作技术。 二、材料与用具 1、药品75的酒精、95的酒精、0.1的升汞（或漂白粉）、无菌水等 2、用具超净工作台、灭过菌的培养基、接种器械（主要指解剖刀、剪刀、镊子等）、酒精灯、培养材料（根、茎、叶或种子等）等。 三、灭菌原理植物外植体都是带菌的，在接种前必须进行消毒处理，通过化学消毒剂灭菌，可在不杀死植物材料的前提下获得无菌材料进行组织养。 四、教学时数4课时。 五、实验内容（一）无菌空间的灭菌 1、定期进行气体熏蒸（100ml甲醛+5g高锰酸钾）/20m2范围，熏蒸后实验室封闭3-5天以防止其对人体产生危害； 2、使用之前进行紫外线照射每次使用前照射15-30min； 3、使用之前开动超净工作台须提前开动10-20min以保证台内的无菌环境。 注意防止尘埃堵塞超净工作台过滤器，并定期检查台面风速；使用之前先将需用物品放入台内，中途不宜拿进，且摆放东西不易太多，尤其不能堆放太高以防挡风。 （二）植物材料修剪与准备 1、取材选取带菌量少且生理年龄较小的母株，采取生长正常、无病虫害的组织材料，除去多余部分，然后将材料成适当大小放入烧杯中； 2、预处理先用洗涤剂清洗后再用尼龙网或脱脂纱布覆盖杯口，然后将其置于自来水管下冲洗30-120分钟。 （三）无菌操作于超净工作台内进行 1、台面及器械消毒对台面及人手采用75%酒精进行擦拭消毒，对无菌操作的器械进行灼烧灭菌，并放于支架上待凉； 2、外植体灭菌于超净工作台内，用70%-75%的乙醇处理15-60秒，立即除去乙醇；在烧杯中加入消毒剂（如0.1%-0.2%升汞），同时可滴1-2滴吐温，将烧杯振荡或搅拌灭菌处理3-10分钟；弃去消毒液，用无菌水清洗3-4次，每次1-3分钟；将灭菌后的材料置于垫有无菌纸的培养皿中晾干备用。 3、外植体的切割与接种将材料剪成1cm长或切割成1cm2大小左右，根据极性或具体要求接种到培养基上。 注意接种后的培养瓶必须及时放入培养室进行控制培养，否则影响外植体生长。 六、实验相关记录接种一周后，观察接种材料的污染情况，并进行相关记录，分析污染原因。 试验号总瓶数日期污染瓶数死亡瓶数萌动瓶数总计瓶数比率（%）实验四马铃薯的茎尖脱毒培养 一、教学目的了解植物茅舍尖脱毒的基本原理，掌握马铃薯茎尖脱毒的实验过程及方法，学习运用指示植物法对马铃薯病毒进行鉴定。 二、材料与用具 1、材料带芽马铃薯块茎，指示植物等。 2、药品75的酒精、95的酒精、0.1的升汞（或漂白粉）、无菌水等。 3、用具超净工作台、灭过菌的培养基及培养皿、接种器械（主要指解剖刀、剪刀、镊子等）、酒精灯、解剖镜、光照培养箱等。 三、实训原理植物病毒在寄主植物体内的分布具有不均匀性，茎尖（或根尖）等分生组织不含或很少含有病毒粒子，通过植物分生组织离体培养可获得无病毒植株。 此外，某些植物病毒对热不稳定，在较高温度（35-40）条件下会被钝化而失活，其增殖速度会减缓或停止，采取适当的高温处理也可在很少或不伤害植物的情况下获得无病毒植株。 四、教学时数4课时。 五、实验内容 1、高温预处理待马铃薯芽长至2cm时，放入38的光照培养箱中，光照12h/d，处理2周左右。 2、材料剪取与灭菌剪取马铃薯茎尖1-2cm，采用自来水冲洗0.5h，剥去外部叶片，置于超净工作台上进行常规消毒（75%酒精5-15s，0.1%升汞8-10min，无菌水3-8次），置于消毒过的培养皿中备用。 3、茎尖剥离与接种将已装有消毒茎尖的培养皿置于解剖镜下，逐层剥去幼叶，露出圆滑的生长点，切取0.1-0.5mm的带1-2个叶原基的茎尖，直立接种到固体培养基上。 4、离体培养通过继代、生根培养等，获得完整植株。 5、病毒检测带根植株通过驯化移栽，取其汁液接种至指示植物千日红或苋色藜上，观察其脱毒效果。 6、脱毒试管苗的扩繁对脱毒试管苗进行试管内扩繁，或利用保护地进行隔离快繁，获得大量商品植株。 六、实验相关记录接种一周后，观察接种材料的污染情况，并进行相关记录，分析污染原因。 试验号总瓶数日期污染瓶数死亡瓶数萌动瓶数总计瓶数比率（%）实验五继代与生根培养（可与实验三交换进行以利于锻炼无菌操作技术） 一、教学目的通过实验，掌握无菌操作技术和植物快速繁殖的基本方法和过程，能熟练的进行独立操作。 二、主要试剂和仪器超净工作台、7075的酒精、解剖刀、剪刀、镊子、母苗瓶等。 三、教学时数4课时。 四、实验内容 1、准备实验所需东西并摆放到位，打开无菌操作室的紫外灯及超净工作台的紫外灯和鼓风机，15-20min后，关闭紫外灯； 2、用水和肥皂洗净双手，穿上灭菌过的专用实验服、帽子与鞋子，在关闭紫外灯15-20min后进入接种室； 3、用7075的酒精擦拭工作台和双手，把解剖刀、剪刀、镊子等器械浸泡在95酒精中，在火焰上灭菌后，放在器械架上待凉； 4、取下接种器械，取出无菌纸； 5、打开母苗瓶口，用火焰烧瓶口，转动瓶口使瓶口各部分都烧到，取出母苗放在无菌纸上，根据需要进行切割； 6、打开新培养基瓶口，把培养材料接入培养瓶，盖上瓶口； 7、接种结束后，清理和关闭超净工作台； 8、将接种后的培养瓶及时放入培养室进行控制培养。 注意接种过程中不能说话及随意走动，以防止污染；操作期间应经常用70酒精擦拭工作台和双手，接种器械应反复在95的酒精中浸泡和在火焰上灭菌；接种器械必须凉透才可进行材料切割，否则易烫死烫伤材料；酒精棉球不可带太多酒精，以防烧手；接种时应注意达到无菌操作规范，动作熟，切割准确，分布合理，台面洁净。 五、实验相关记录主要包括污染率、增殖倍数及生长情况等。 实验六组培苗的驯化移栽 一、教学目的了解组培苗由室内至室外环境条件的变化，掌握生根苗的驯化移栽技术。 二、材料与用具 1、药品多菌灵等消毒杀菌剂。 2、用具镊子、水盆或桶、喷雾器、竹签、栽培基质（蛭石和珍珠岩）、栽培容器（育苗杯、盘）、生根苗瓶、驯化室（温室或大棚）等。 三、教学时数4课时。 四、实验内容 1、练苗将生根的组培苗从培养室取出，放在自然条件下13天，然后打开瓶口，再放置13天； 2、基质灭菌将蛭石和珍珠岩分别用聚丙烯塑料袋装好，在高压灭菌锅中灭菌20分钟，灭菌后冷却备用； 3、育苗杯、盘准备取干净的育苗杯或盘，将基质（蛭石和珍珠岩按11）混合均匀，然后倒入育苗杯或盘中，用木板刮平，将育苗杯或盘