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二代测序 Illumina 及其在无创产前检测中的应用 目录页 二代测序的基本原理 二代测序的测序流程 在无创产检中的应用 CONTENTSPAGE 二代测序的基本原理 Illumina测序的技术原理是采用可逆性末端边合成边测序反应 首先在DNA片段两端加上序列已知的通用接头构建文库 文库加载到测序芯片Flowcell上 文库两端的已知序列与Flowcell基底上的Oligo序列互补 每条文库片段都经过桥式PCR扩增形成一个簇 测序时采用边合成边测序反应 根据四种不同的荧光信号确认碱基种类 经过多个循环后 完整读取核酸序列 测序流程 1 文库制备 文库制备流程 1 杂交到flowcell表面 自动簇生成 2 Flowcell表面结合一层oligo接头 单分子DNA片段杂交在flowcell表面后 oligo引物就会在聚合酶作用下延伸 双链分子变性分开 模板链被洗掉 新合成链以共价键的形式紧紧连接在flowcell表面 在flowcell上形成共价结合的单链DNA片段 Eachpiecehasauniquesequence 单链弯曲杂交在相邻的oligo引物上形成一个桥式结构 杂交引物在聚合酶作用下延伸 双链的桥式结构变性打开 形成2个copy的以共价键结合在flowcell的单链模板 单链弯曲杂交在相邻的oligo引物上形成一个桥式结构 杂交oligo引物在聚合酶作用下延伸 桥式扩增一直循环重复 直至形成5000 10000copies 双链DNA桥变性分开 Reversestrands被剪切然后洗掉 仅仅留下由forwardstrands组成的簇 测序引物被杂交到接头序列上 3 测序 在无创产检中的应用 原理 无创产前检测是通过采集孕妇外周血 提取游离DNA 采用新一代高通量技术 结合生物信息分析 得出胎儿患染色体非整倍体 21 三体又称唐氏综合征 18 三体 13 三体 的方法 该方法最佳检测时间为孕早 中期 具有无创取样 无流产风险 高灵敏度 准确性高的特点 来源 1胎儿细胞通过胎盘渗透到母血中 被母体免疫系统破坏 胎儿DNA残留下来 2胎儿细胞凋亡 3胎盘滋养层细胞的凋亡基本特点 1含量有一定的变化规律 妊娠第4周开始可检出胎儿游离DNA 随着孕周增加而增加 存在个体差异 平均浓度 2分娩后短时间内消失 平均半衰期为16 3min 4 30min 2h就无法检出 再次妊娠不影响检测结果 3DNA片段较小 平均166bp左右 常规技术很难检测 胎儿DNA来源和特点 Uniquereads 单一序
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