DNA甲基化与二型糖尿病.doc

. 博士 兽医硕士专业学位 硕士 农业推广硕士专业学位 同等学力在职申请学位 中职教师攻读硕士学位 工程硕士专业学位 高校教师攻读硕士学位 风景园林硕士专业学位西 北 农 林 科 技 大 学研 究 生 课 程 考 试 试 卷 封 面（课程名称： （研） ）学位课 选修课 补修课研 究 生 年 级、姓 名 2015级 王香明（2015050492） 所 在 学 院 动物科技学院 所 在 专 业 遗传育种与繁殖 任 课 教 师 姓 名 考 试 日 期 考 试 成 绩 评 卷 教 师 签 字 处 DNA甲基化与型糖尿病摘要：型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus, T2DM)是由于遗传与环境因素共同作用而引起葡萄糖代谢紊乱的疾病。越来越多的研究表明，表观遗传学亦在型糖尿病的发病机理中起着重要的作用。本文的目的在于对国外近期的型糖尿病与DNA甲基化的研究进行总结，以期为型糖尿病的诊断和治疗提供参考。 关键词：DNA甲基化，型糖尿病，胰岛素 型糖尿病是一个复杂的代谢疾病，因胰岛胰岛B细胞胰岛素分泌不足或肝脏、骨骼肌、脂肪组织等靶组织的胰岛素敏感性下降，令患者表现为长时间的高血糖水平1。遗传和环境因素在型糖尿病的发生中均发挥着作用，肥胖是世界范围内受型糖尿影响人群迅速增加的主要因素之一2。有趣的是，在型糖尿病的发生中，遗传和基因因素间的相互作用大都包含表观遗传修饰3。 早在1992年，Hales 和Barker就提出表观遗传学在代谢疾病（包括型糖尿病在内）的发生中起着关键的作用，在当时，他们就描述了一个人幼年的生活如何影响成年之后的健康状况4。这个假说被数个研究改变的胚胎环境、早产和幼年成长环境对型糖尿病和胰岛素抵抗影响的流行病学所证实。 DNA甲基化是目前研究的比较多的一种表观遗传修饰5。DNA甲基化即DNA核苷酸胞嘧啶部位甲基的增加。一个严格调控的DNA甲基化模式对于动物的正常发育必不可少。DNA甲基化在组织特异性基因的调控和转录中起着关键的作用。与稳定的DNA序列相比，表观遗传修饰是动态的，并且具有可逆性。1.胰岛B细胞与DNA甲基化对于葡萄糖的应答，胰岛胰岛B细胞产生和分泌胰岛素的能力，对于维持正常血糖水平至关重要。在型糖尿病的发生过程中，升高的胰岛素抵抗，导致机体对于胰岛素需求往往升高。因此，探索影响胰岛胰岛B细胞功能的机制（例如：细胞活力、胰岛素产生和分泌的潜能），对于寻找治疗糖尿病的新途径来说，至关重要。在最近的研究中，Dayeh6调查了从已故捐赠者身上获取的人胰岛细胞的全基因组DNA甲基化模式。在来自型糖尿病和来自非糖尿病捐献者的胰岛细胞中，Dayeh发现853个基因中有1649 个CpG位点的DNA甲基化水平存在差异。这些基因中包括已知的型糖尿病基因，例如：TCF7L2, KCNQ1, THADA, FTO, IRS1和PPARG。同时，这些基因在癌症、轴突导向和MAPK信号通路中均呈现富集状态。此外，表现出甲基化差异的102个基因，在型糖尿病和非糖尿病捐献者中亦呈现出不同的mRNA表达水平。与非糖尿病捐献者相比，型糖尿病捐献者中的这些基因中的大部分，表现为DNA甲基化水平升高并且基因表达降低。对这些基因进行功能分析发现：Cdkn1a和Pde7B在胰岛B细胞中过表达会造成胰岛素分泌功能受损；Cdkn1a (p21)过表达会造成胰岛B细胞的增殖减少。Exoc3l编码胞外复合体中的一个蛋白元件，若在胰岛B细胞中对其进行沉默，会造成其胞外分泌的减少。在糖尿病组和非糖尿病组中，胰岛B细胞的内容物没有显著差异，这表明：其发现的表观遗传差异并不是由于细胞类型组成的改变造成的。Dayeh的研究提供了人胰岛细胞DNA甲基化的详细信息，着重突出了表观遗传调控在型糖尿病发病机理中的重要作用。Volkmar7等人也对人胰岛细胞的DNA甲基化进行了研究。与Dayeh等人的研究相比，此研究研究了很少的人胰岛细胞，报道了较少的CpG位点，但在型糖尿病和非糖尿病捐献者胰岛细胞表现为DNA甲基化差异的254个基因启动子中，仍然能够检测到276 个CpG位点。这些基因涉及细胞的功能发挥和存活，进一步支持了DNA甲基化在型糖尿病发病机理中的关键作用。2.糖尿病相关基因及转录因子近年来的研究发现，过氧化物酶体增殖物激活受体辅激活因子（Peroxisome proliferative activated receptorcoactivator 1A，PPARGC1A）、钾离子通道亚单位1(Potassium voltage-gatedchannel, KQT-like subfamily, member 1, KCNQ1)、胰 岛 素编码基因 (Insulin,INS)、胰腺十二指肠同源盒基因(Pancreatic and duodenal homeobox 1, PDX1)、胰高血糖素样多肽1（Glucagon-like peptide 1 receptor，GLP1R）等的DNA甲基化修饰也与型糖尿病密切相关。 2.1 PPARGC1A 在早期的一项以PPARGC1A（Peroxisome proliferative activated receptorcoactivator 1A，过氧化物酶体增殖物激活受体辅激活因子）作为候选基因，研究DNA甲基化的研究中，Ling 8发现和非糖尿病组相比,型糖尿病患者胰岛细胞的PPARGC1A 基因上游区域的甲基化发生了改变。型糖尿病患者胰岛细胞DNA甲基化的升高，伴随着PPARGC1A mRNA表达水平的降低和来自葡萄糖刺激的胰岛素分泌减少。PPARGC1A是一个氧化磷酸化相关基因的主要转录调控因子，因此，其降低会造成线粒体ATP的产生减少，损坏因葡萄糖刺激产生的胰岛素分泌。2.2 KCNQ1KCNQ1的印记位点是型糖尿病的另外一个候选基因区域，其被认为是在胰岛素功能受损中发挥作用。通过对成人胰腺和胎儿胰腺进行分析，Travers9等人发现，一个在KCNQ1位点中变化的遗传危险，与儿童调控序列的DNA甲基化有关；与成年人包含PLAGL1位点的一个区域有关。然而，两者对基因表达水平并没有显著影响。这些结果都强调了DNA甲基化的动态特征，其在不同的发育阶段发挥不同的调控作用。2.3 INS研究型糖尿病的一个比较明确的靶基因是胰岛素基因(INS)及其调控。事实上，两项研究已经表明INS启动子的DNA甲基化涉及人胰岛素细胞和胰岛B细胞的胰岛素基因表达。Kuroda10等人研究表明，INS启动子在胰岛B细胞内是特异性脱甲基化的，在体外，此区域的甲基化会抑制INS的基因表达。与非糖尿病者相比，糖尿病者胰岛细胞的INS启动子的4个CpG位点的DNA甲基化水平较高。这些CpG位点的DNA甲基化水平以及此区域的另外9个位点，同INS的基因表达呈负相关，说明胰岛素基因受表观遗传的调控。Yang11的发现进一步验证这个说法：高血糖症直接改变了体外培养的胰岛B细胞系的胰岛素基因甲基化水平。而且经流式细胞术（FACS）挑选的细胞INS的DNA甲基化水平要比胰岛B细胞高，说明INS的甲基化调控细胞基因的表达。此外，来自糖尿病患者的胰岛细胞显示出胰岛素水平及葡萄糖刺激的胰岛素分泌减少。2.4 PDX1PDX1(pancreaticandduodenalhomeobox1)，胰腺十二指肠同源异型盒）是一个对于胰岛细胞发展和胰岛B细胞的成熟及功能很重要的转录因子。Yang12发现，与非糖尿病组相比，糖尿病组的位于近端启动子的3个CpG位点和一组位于PDX1增强子的7个CpG位点，表现为DNA甲基化水平升高。有趣的是，所有位于增强子区域的9个CpG位点，都显示出与PDX1 的mRNA水平呈负相关。而在近端启动子区域和远端启动子区域都只有1个CpG位点，与PDX1 的mRNA水平呈负相关。这说明，对 PDX1 的表观遗传调控主要是通过增强子区域发挥的。通过运用荧光素酶，Yang在功能上证明，PDX1 增强子的甲基化降低了其转录活性。而且，PDX1 的mRNA水平与INS的 mRNA水平以及葡萄糖刺激的胰岛素分泌显著相关。2.5 GLP1R肠促胰岛素对于饮食及用于糖尿病模拟物刺激的胰岛素释放来说，至关重要。GLP1R编码肠促胰岛素的一个受体（Glucagon-like peptide 1 receptor，胰高血糖素样多肽1），并在胰腺细胞内表达。当调查GLP1R基因的表观遗传调控元件，Hall13发现，与来自非糖尿病组的胰岛细胞相比，糖尿病患者的胰岛细胞表现出较高的DNA甲基化水平（很小但是不显著）。GLP1R的另一个CpG位点（包含SP1和SP3 转录因子结合区域的位点），与GLP1R 的表达呈负相关，与HBA1c 和BMI成正相关。已有证据表明，型糖尿病患者胰岛细胞的非编码RNA的水平发生了改变。 Kameswaran14等人鉴别出了胰岛B细胞特异表达的一组miRNAs的印迹位点，其在型糖尿病患者中的表达表现为下调。有趣的是，这和启动子区域的过甲基化有很强的关联。DLK1-MEG3的基因座，已被证实和各种各样的癌症相关。此研究亦证实了涉及糖尿病和胰岛B细胞功能的miRNAs（例如miR-7）的差异表达。3体外模拟：3.1高葡萄糖处理胰岛细胞 Volkmar15等人将来自非糖尿病者的胰岛细胞置于高葡萄糖水平，发现异常的DNA甲基化可能是疾病发生的原因或者结果。他们检测的16个CpG位点均没有表现出显著的DNA甲基化差异，说明来自型糖尿病患者胰岛细胞的甲基化模式改变不是高血糖症产生的原因。长期的高血糖（也就是大于通常时间72小时）是否可能造成和已知的糖尿病及其并发症不一样的结果，这还是未知的。3.2棕榈酸处理的人胰岛细胞Hall 16用棕榈酸处理人胰岛细胞，并对其全基因组DNA甲基化模式进行了研究。棕榈酸处理是用来模仿型糖尿病病人体内升高的自由脂肪酸含量。棕榈酸处理的人胰岛细胞全基因组DNA甲基化水平（即分析的483,844 个CpG位点平均水平）显著高于对照组。此外，棕榈酸处理改变了46,977 个CpG位点的DNA甲基化水平（p 0.05），这几乎是期望值的两倍，并且显著性亦高于预期。然而，经过多重试验之后，研究者发现，没有单个的CpG位点DNA甲基化在棕榈酸处理之后发生了显著的差异。与对照组相比，在因榈酸处理而发生表达水平显著改变的1860个基因中，包括型糖尿病的易感基因（例如TCF7L2和 GLIS3）在内的 290个基因，有一个或者多个CpG位点的DNA甲基化发生了很小的差异。尽管此研究表明，胰岛细胞在接受棕榈酸处理后，会发生表观遗传改变，但还需要进一步的研究来确认长期的高游离脂肪酸（常见于型糖尿病患者）是否会对DNA甲基化模式造成更深远的影响，以及表观遗传因素和型糖尿病的关联程度到底有多大。4小结：随着最近几年研究表观遗传修饰方法的显著改进，健康和疾病组织的表观基因组谱已经描绘出来。本综述特意比较了糖尿病和非糖尿病者的胰岛细胞表观基因组差异，着重比较了胰岛细胞特定基因的DNA甲基化差异。血液中型糖尿病相关基因甲基化的改变表明，一些表观遗传改变在型糖尿病发生的早期阶段就已经发生。然而，将实验的对象从培养的细胞系和动物转移到人的临床研究仍是很有必要的。本综述所提及的结果表明，表观遗传对于型糖尿病有重大意义。5展望：用于研究全基因组DNA甲基化的芯片，对于我们理解表观基因组提供了很大的帮助，而亚硫酸盐基因组测序却可以通过提供贯穿整个DNA序列的每个DNA甲基化位点，从而进一步加深我们对表观基因组的理解。随着越来越多的全基因组表观遗传数据的出现，我们将对DNA甲基化和组蛋白修饰复杂的相互作用有一个更好的理解，两者（DNA甲基化和组蛋白修饰）均对遗传变异和染色体结构有影响。这将为新的型糖尿病治疗策略的制定提供很大的帮助。参考文献：1Drong AW, Lindgren CM, McCarthy MI. The genetic andepigenetic basis of type 2 diabetes and obesity. Clin Pharmacol Ther.92(6): 707,715(2012).2Wu Y, Ding Y, Tanaka Y, Zhang W. Risk factors contributing to Type 2 diabetes and recent advances in the treatment and prevention. Int. J. Med. Sci. 11(11), 11851200 (2014).3Ling C, Groop L. Epigenetics: a molecular link between environmental factors and Type 2 diabetes. Diabetes. 58(12),27182725 (2009).4Hales CN, Barker DJ. Type 2 (non-insulin-dependent)diabetes mellitus: the thrifty phenotype hypothesis.Diabetologia .35(7), 595601 (1992).5Laird PW. Principles and challenges of genomewide DNAmethylation analysis. Nat. Rev. Genet. 11(3), 191203(2010).6Dayeh T, Volkov P, Salo S et al. Genome-wide DNAmethylation analysis of human pancreatic islets from Type 2 diabetic and non-diabetic donors identifies candidate genes that influence insulin secretion. PLoS Genet. 10(3), e1004160(2014).7Volkmar M, Dedeurwaerder S, Cunha DA etal. 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