实验药理期末总结.doc

一、抗糖尿病药物研究思路与方法 糖尿病是一种由遗传基因决定的全身慢性内分泌代谢性疾病。由于体内胰岛素的相对或绝对不足而引起糖、脂肪和蛋白质代谢的紊乱。胰岛素抵抗：正常剂量的胰岛素产生低于正常生物效应的一种状态。糖尿病分型：1型糖尿病（细胞破坏，导致胰岛素绝对缺乏）A.免疫介导性的（急进型和缓发型） B.特发性的2型糖尿病（胰岛素抵抗为主伴相对胰岛素不足或胰岛素明显缺乏伴胰岛素抵抗）特殊型糖尿病妊娠糖尿病一、寻找抗糖尿病新药的途径(一)降血糖1、类似1型糖尿病的动物模型（1）四氧嘧啶高血糖动物模型原理：Alloxan是一种胰岛细胞毒剂，通过超氧自由基选择性地破坏细胞，使细胞内的DNA损伤，mRNA功能受损，合成前胰岛素减少，导致胰岛素绝对缺乏，引起实验性糖尿病。给药途径：静脉注射（iv）&腹腔注射（ip）剂量：动物敏感性不同，剂量不同特点：水溶液不稳定；对光敏感；血浆半衰期12 min；不能引起豚鼠糖尿病；大鼠形成模型后可自行缓解（部分）；猫犬形成永久性糖尿病。（2）链脲霉素高血糖动物模型原理：STZ结构中的亚硝基脲是细胞毒，去氧葡萄糖部分使之易进入细胞。STZ通过自由基损伤细胞，造成胰岛素缺乏。一次大剂量注射可致细胞坏死而无胰岛炎，小剂量连续注射，可产生胰岛炎及相关的糖尿病，后者涉及T细胞参与的自家免疫机制。特点：水溶液极不稳定；0.1M柠檬酸缓冲液（pH 4.0-4.5)配制；腹腔注射 静脉注射；大鼠 5580 mg/kg；能引起豚鼠糖尿病。,2、自发性遗传性1型糖尿病模型原理：有自家免疫等病因参与，胰岛细胞受损，因而胰岛素缺乏，动物不肥胖。常用于1型糖尿病病因、病理生理的研究。动物：中国地鼠、BB大鼠、NOD小鼠、3、类似2型糖尿病的动物模型实验性肥胖及糖尿病动物模型：遗传基因高糖或高脂饲料（如C57） 实验性肥胖及糖尿病大鼠模型：小剂量STZ高热量饲料4、自发性2型糖尿病动物模型动物：进口或引进，饲养条件要求高，价格昂贵。大约有20余种：db/db小鼠、KK小鼠、ob/ob小鼠、OLETF 大鼠、Zuker（fa/fa）大鼠、Wistar fatty大鼠等。5、正常动物（大鼠、小鼠）根据研究的目的或切入点不同，也可以选用正常动物作为模型。如在研究促胰岛素分泌药物作用时，选正常动物较合适又经济。观察指标 ：血糖（葡萄糖氧化酶法）；糖耐量 （葡萄糖耐量、蔗糖耐量、淀粉耐量）；糖化血红蛋白(HbA1c)（HPLC、琼脂凝胶电泳法、等电点聚焦法、亲和色普微柱法）；果糖胺；胰岛素6、离体模型：细胞模型、酶活性（a-葡萄糖苷酶活性抑制）（二）改善胰岛素抵抗动物模型：抗胰岛素激素诱发的动物模型、MSG肥胖动物模型观察指标：胰岛素耐量、胰岛素敏感指数、正常血糖高胰岛素钳夹技术（三）调节脂质代谢异常动物模型 ：高胆固醇乳剂诱发的大鼠、小鼠模型；Triton WR 1339 (iv)；乙硫胺酸诱发（P.O.）；高胆固醇饲料诱发家兔高血脂模型；STZ金黄地鼠高血脂模型观察指标：血甘油三酯（TG） 、胆固醇（Chol）、游离脂肪酸（FFA）、HDL肝TG、Chol （四）防治慢性并发症动物模型：糖性白内障大鼠模型、观察指标：抗氧化（脂质过氧化物质；抗氧化酶：SOD、过氧化氢酶）；AGEs；神经传导速度；晶体混浊度二、抗糖尿病药物作用机制的探讨胰岛素分泌，胰岛素受体，受体后效应其它：减少过量的肝糖生成增加葡萄糖刺激的胰岛素分泌作用于胰岛素信号转导通路的特异分子二、薄层色谱、高效液相色谱法在药理学中的应用往年考题：高效液相色谱法及薄层色谱法在生物样品分析中，各有哪些优缺点。（？看课件）薄层色谱法与高效液相色谱法比较 薄层色谱 高效液相色谱色谱系统 开放式 闭路展开方式 展开 洗脱流速控制 吸附剂的毛细管作用 由泵调节平衡时间 短 不定分析样品 同时分析多个样品 每次一个样样品量 高 低板高（um） 30 2-5 有效板数 600 5000检测方式 静态，可用的手段较多 动态，多采用紫外检测器溶剂用量 少 多溶剂更换 易 难固定相 一次弃去 反复使用前处理 简单 较复杂三、免疫组织化学实验方法免疫组织化学：利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 （荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学。酶标抗体法：通过共价键将酶结合在抗体上制成酶标抗体，再借酶对底物的特异性催化作用，生成有色的不溶性产物，于显微镜下进行细胞或组织表面或内部某种抗原成分定位观察。常用的酶-辣根过氧化物酶（HRP），碱性磷酸酶（ALP）及葡萄糖氧化酶（GOD）等。优点：与免疫荧光技术相比，终产物可在普通光镜下观察，切片能够长久保存，经锇酸处理后，电子密度增强，可用于电镜观察。抗生物素-生物素-过氧化物酶技术(avidin-biotin peroxidase complex ABC)原理：利用抗生物素分别连接生物素标记的第2抗体和生物素标记的酶。其第1抗体不为标记物所标记，生物素标记的第2抗体与ABC复合物相连接。ABC复合物是将过氧化物酶结合在生物素上，再将生物素-过氧化物酶连接物与过量的抗生物素蛋白反应而制备的。常用： ABC-HRP 辣根过氧化物酶：最通用的系统，使用范围广 ABC-ALP 碱性磷酸酶：灵敏度比较高，染色密度较低 ABC-GOD 葡萄糖氧化酶：灵敏度较低，适用于组织内源性HRP或者AP含量比较高的组织，常与HRP或者AP系统配合进行双染ABC法的特点： 敏感性强 特异性强，背景染色淡 方法简便，节约时间 可用于双重或多重免疫染色。双重免疫荧光标记法-在同一组织切片上检测多个抗原免疫金染色原理：免疫金染色技术使用胶体金耦联抗体，然后在光学显微镜下检测抗原。解决了免疫组化里内源性酶干扰的问题。整个检测过程中无需酶的参与，因此不必预先处理样本以消除内源性酶的活性。四、药物代谢酶研究方法药物代谢酶的组成I 相酶：以细胞色素P450（Cytochrome P450, CYP 450s）为代表，主要催化底物的氧化、还原、水解反应，使其代谢激活或灭活。II相酶：尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UDP-glucuronyltransferase, UDPGT)、谷胱甘肽巯基转移酶（Glutathione S transferase, GST）等则主要参与结合反应，加速药物或化学毒物本身及代谢产物以结合物的形式排出体外。CYP450的特性光谱特性：含量测定，结合类型膜结合特性：分离纯化底物特异性：同工酶鉴定多态性：生物转化机制可诱导性：调控和药物相互作用CYP450调控诱导：与核受体或阻遏蛋白结合基因调控区，促进合成蛋白稳定作用抑制蛋白激酶对P450的磷酸化 Ah受体(aromatic hydrocarbon receptors)-P1孤儿受体 (orphan receptors-内源性、生理配体不清)CAR：组成型雄烷受体，PB和亲脂类化合物等（2B）PXR：孕烷核受体，天然和合成的甾醇类等（3A ）PPAR：过氧化物酶体增殖因子活化受体，非基因毒性 致癌物等(4A)mRNA稳定作用(2E)抑制：竞争分子氧或底物1. 诱导内源物代谢 干扰机体内环境，导致疾病。如苯妥英或利福平引起的甲低、骨软化。外源物代谢 （1）肝毒性：PB加重APAP的肝坏死，乙醇诱导NDMA的致癌性。（2）药物：代谢增加而失效，药物相互作用，毒性和不良反应。如诱导剂增加环孢素的用量，华法令的半衰期缩短，利福平使避孕药失效。2. 抑制（酶蛋白水平）可逆性抑制：快速、可逆的结合，竞争活性中心，抑制程度取决于抑制剂的浓度和亲和力，强度-Ki1mol。准不可逆抑制: 可逆但作用时间长，形成中间代谢复合体（M1复合体），中间代谢产物形成时间长，解离速度慢。不可逆抑制：活性丧失，不可逆的共价结合，抑制程度取决于抑制剂总量、酶的数量和抑制剂在酶与其他生物大分子之间的分配比。意义：制备理想的研究体系内外源物与CYP450的相互作用药物相互作用与临床用药药物代谢酶研究方法：1.CYP450测定：还原状态下可与CO 结合，在波长450nm出现吸收峰，用于含量测定。2. 肠道和肝脏的首过效应（代谢稳定性）3.代谢稳定性4. 参与代谢的药酶鉴定5.药酶诱导与抑制五、大动物心肌缺血及心力衰竭模型建立方法一、目前常用的心肌梗塞指标有哪几种？答：目前常用的心肌梗塞指标有以下几种：1、心电图：肢体导联或胸前导联缺血性ST段抬高或降低，T波异常变化及病理性Q波出现。2、心外膜心电图：在开胸犬前壁放置7-36个电极引出心外膜心电，常以结扎冠状动脉左前降支后，心外膜电图ST段升高的电极数表示心肌梗塞范围的大小，以ST段升高的总量反应心肌损伤的严重程度。3、血流动力学指标：使用电磁流量计、压力换能器、多导生理记录仪等设备，可记录心室内压、心输出量、冠脉流量、肺动脉契压等指标，反映心肌缺血时血流方面的改变。4、组织学染色：用红四氮唑（TTC）可使正常细胞着色，而坏死细胞没有反应，硝基四氮唑兰（NBT）作用则相反，以此可清楚的将缺血区域区分出来。5、生化代谢改变：心脏流出血液中乳酸和脂肪酸水平升高，说明无氧代谢和脂肪分解加强；心肌细胞坏死可释放出乳酸脱氢酶（LDH）和磷酸肌酸激酶（CK），其外周血水平同样升高。6、组织形态学改变：心肌切片可见明显坏死样病理变化。六、脑卒中治疗药物评价方法1、抗脑缺血药物的分类及代表药物？ （1）改善脑供血的药物 血管扩张药，如潘生丁等 改善微循环、扩充血容量的药物：如低分子右旋糖酐等 溶解血栓的药物：尿激酶等 抗凝药物：肝素等 钙离子拮抗剂：尼莫地平等 防止血小板凝聚的药：阿司匹林等（2）脑功能保护药物（神经保护剂） 钙通道阻滞剂（尼莫地平） 自由基清除剂（依达拉奉） 谷氨酸释放抑制剂及受体拮抗剂 腺苷转运抑制剂 白细胞黏附抑制剂及抗炎药物 NO合酶抑制剂 其他（抗凋亡药，GABA增强剂，雌激素）2、评价抗脑缺血药物的动物模型分类及主要制备方法。（1）、全脑缺血/再灌注动物模型蒙古沙土鼠颈动脉阻断的脑缺血模型：蒙古沙鼠基底动脉环不完整，缺乏后交通支，故用丝线结扎或无创微血管夹夹闭双侧颈总动脉可引起蒙古沙土鼠大脑两半球的缺血，海马对缺血缺氧尤为敏感，故此模型可以较好的模拟人脑血液循环障碍 Pulsinelli四血管闭塞（4-VO）大鼠模型：永久性电凝阻断双侧椎动脉，结合短时间夹闭阻断双侧颈总动脉，造成前脑缺血 两血管阻断合并低血压大鼠模型：通过阻断双侧颈总动脉合并低血压（通过股静脉放血将血压降至50mmHg）减少脑血流，造成全脑缺血。 两血管阻断合并低血压小鼠模型：采用两颈总动脉结扎合并低血压，引起脑组织血流低灌注，造成小鼠全脑缺血。 （2）、局灶性脑缺血/再灌注动物模型 大鼠大脑中动脉闭塞， Middle cerebral artery occlusion，MCAO线栓法MCAO大鼠模型：用直径4.0（0.27-0.28mm）尼龙丝线从颈外动脉，经颈内、外动脉分叉处、颈内动脉插到大脑前动脉，造成大脑中动脉血供骤减甚至中断来建立大脑中动脉缺血模型。 栓塞法MCAO模型：把无菌干燥的血凝块研碎过筛制成栓子，注入颈外动脉，并使其经颈内动脉进入MCA而建立MCAO模型。 光化学诱导法：给大鼠注射染料后，用光导纤维通过颅骨给予强的绿光照射，光敏染料在特定光波作用下发生光化学反应，引起内皮细胞过氧化，释放自由基，导致血管内皮损伤，诱发血小板聚集而形成血栓，可导致大鼠局灶性脑缺血。 开颅电凝法MCAO模型：开颅后电凝惑结扎大脑中动脉及其分支而形成局灶性脑缺血。 （3）、慢性低灌注脑缺血（2-VO）模型 通过结扎双侧颈总动脉使脑组织供血长期低于生理阈值而出现慢性脑缺血性神经系统损害，这种病理状态时急慢性缺血性脑血管病发病的主要病理基础。 （4）、缺氧损伤动物模型 大鼠缺氧耐受实验：将动物置于缺氧室中，通过吸入氮气造成低氧状态，通过观察对缺氧的耐受和脑电图EEG的恢复这两个指标，研究化合物抗脑缺血引起脑电活动抑制的作用 小鼠缺氧耐受实验：a、小鼠断头法，由于缺氧引起呼吸动作存在，这种呼吸动作的持续时间可以间接反映脑容量储存和脑缺氧能力。b、亚硝酸钠法，静脉注射亚硝酸钠溶液，导致血液中氧耗竭，而引起动物死亡。单位体重亚硝酸钠致死量可以反应动物的耐缺氧能力。c、窒息法，观察小鼠密闭状态下，窒息致死需要的时间。 （5）、颈动脉血栓模型 CCA加压夹闭法：通过加压夹闭机械损伤CCA局部内皮，减压后5min之后加压处有白色血栓形成。 负电流电解损伤法：应用机械收缩器使颈总动脉血流减少，电流直接损伤血管内皮细胞，引发血栓形成，阻塞血管腔，是脑血流量减少造成脑缺血。 FeCl3化学诱导法：分离颈总动脉后，用FeCl3浸渍过的滤纸条包裹颈总动脉外壁，至血栓形成后剥下滤纸条。其机制可能是Fe3+渗透到血管内膜后造成内膜损伤，促发凝血和血栓形成。七、抗肿瘤药物研究方法多数转录因子是DNA结合蛋白，结合于靶基因的调节DNA元件，或称为顺式作用元件（cis-acting element）。转录因子也称为反式作用因子（trans-acting factor）。 转录调控研究的常用方法 ：一、蛋白质与DNA的相互作用 （一）DNA足印法 ：这是一种直接观察DNA结合蛋白与特定的DNA序列相结合的方法。 基本原理：转录因子与DNA靶序列结合后，可保护所结合的DNA区域不受DNase I 或其它分子的消化。通过比较转录因子存在与否时，消化的DNA条带分布，可以了解转录因子所结合的具体DNA序列。 （二）凝胶延迟实验：也称Gel Shift或Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) 。是另一种直接观察DNA结合蛋白与特定的DNA序列相结合的方法。 基本原理：转录因子与DNA靶序列结合后，形成的复合物在非变性凝胶电泳时的迁移速度，明显慢于单独的DNA片段。根据标记的DNA片段的迁移情况，可以很敏感地反映出蛋白质与其DNA靶序列的结合。 （三）报告子测定 ：是一种分析和检测基因序列中顺式调控元件的功能测定方法。 基本原理：用基因重组方法将待测定的顺式调控元件序列连接到含有报道基因的表达载体内，转染到细胞中。报道基因的表达水平可以精确测定。 报道基因常用的有氯霉素乙酰转移酶（CAT）基因，萤火虫酶（Luciferase）基因，半乳糖苷酶（Gal）和绿色荧光蛋白（GFP）等。（四）染色质免疫沉淀实验ChIP 基本原理：生长细胞经化学交联后，某种转录因子的特异性抗体可将该因子与所结合的DNA片段共同沉淀下来。通过分析所得到的特异性DNA片段的数量，可以知道在体状态下该因子与DNA片段的结合状况。二、蛋白质与蛋白质的相互作用 （一）免疫共沉淀基本原理：蛋白分子间互相结合形成复合物时，其中一种蛋白分子的抗体可使整个复合物沉淀下来。检测由此沉淀所得的蛋白分子，是获得蛋白分子间互相结合的一条途径。 （二）GST融合蛋白下拉实验基本原理：将蛋白分子与GST融合表达形成的融合蛋白，仍具有GST的底物结合特性，很容易纯化结合到GSH凝胶基质上。其蛋白分子与其它蛋白结合后，经电泳分离，容易鉴定出它的性质。（三）Far-Western杂交基本原理：与Western杂交相似，首先将待测的蛋白电泳分离，转印到固相膜上，不同的是，用一个蛋白作为探针，代替Western杂交中的抗体，来与固相膜杂交。根据杂交所得的条带，可以分析与该蛋白结合的蛋白分子。（四）双杂交系统酵母双杂交系统是在酵母细胞中鉴定蛋白相互作用的方法。由此演变来的哺乳细胞双杂交系统，则可在哺乳细胞的环境下，观察蛋白分子间的结合。基本原理：实验将两个待测蛋白质的基因分别结合在一个含DNA结合区（DBD）的GAL4或者LEXA上和一个含强烈转录激活区的GAL4或者VP16上。稳定蛋白质蛋白质相互作用能重新组成一个具有转录活性的转录因子，从而激活相应启动子的转录。 八、药理学机能实验的基本原理和常规方法药理学机能实验：对人体或动物的生理机能以及致病因子、药物引起的机能变化进行实验观察，探讨各种生理机能活动及其常规异常变化的规律以及药物的治疗作用及其作用机制。药理学机能实验指标的选择要求有哪些？ 选择特异性的指标，即能特异地反映实验对象的某种机能活动及其变化过程，不宜与其他现象混淆。 选择客观性强的指标，最好选用经过仪器测量而获得的指标。 选择灵敏度高，精确性强的指标，灵敏度高就会更好地显示处理因素的实验效应。 选择的指标具有可重复性，即在相同条件下，所测指标结果可以重复。 难以用仪器定量记录的实验结果，应客观、具体、准确地描述或用摄像、照相的方法进行记录。选定的目标必须有依据，技术和设备的可能性。生物机能实验系统的应用范围有哪些？ 药物研究量效分析，ED50计算，药代动力学新药的一般药理学。离体器官灌流实验心脏、肠系膜等灌流实验，心室压、收缩压、舒张压、灌流压、心率、心电、肠电。离体组织实验离体组织如动脉环、动脉条、心肌、支气管环、回肠、结肠、输精管、子宫等的收缩幅度，张力，电活动，节律性。心血管系统研究心率，心电图，血压，心室压，心功能。呼吸系统研究呼吸频率，幅度，气压，节律，流量，肺功能。消化系统研究胃电图，肠电图，胃肠张力，活动节律。神经电生理在体或离体神经信号，动作电位，神经和肌肉自发活动，神经传导速率，诱发电位。运动生理学心率，心电图，心功能，肌电图，呼吸，脉搏。心理生理学心率，呼吸，血压，诱发电位，肌电。生物信息分析生物信息的频率分析等等。九、药物筛选靶点蛋白的基因克隆与表达中心法则CDS 编码区域1.GenBank中，mRNA序列（为单链）是用DNA序列表示的（即：mRNA中的U用T代替）；2. mRNA最终反转录成双链的cDNA是我们要克隆的目标；其中的一条链与GenBank中记录的序列是相同的，也用这条链表示我们要克隆序列的顺序。引物设计：上游引物序列同GenBank表示的序列；下游引物则用GenBank表示序列的互补序列，所以需要先根据已显示序列推导出互补序列！Primer Design一般性原则1. 长度：1530bp2. G+C含量：4075%之间 Tm=4（G+C）+2（A+T） 3. 碱基分布的随机性：避免连续出现4个以上的单一碱基，尤其不要在3端出现超过3个的连续G或C4. 引物自身：不能含有自身互补序列5. 引物之间：不能有多于4个的互补碱基，尤其在3端6. 特异性：与非特异性序列的同源性小于70%，或少于连续8个的互补碱基7. 引物3端：一般地不应发生错配，最好选G、C或A，尽可能避免选T，尤其是2个以上的T上游引物设计如加入酶切位点要防止移码突变！TTGAATTTG GAA ATG ACT TTT GAT G YL1: 5-GGAA TTC GAA ATG ACT TTT GAT G-3 EcoR I如果序列后需要添加1个His-tag序列（CACCAC），则TGA序列可先不用，而把它移到His-tag后！例如：5TGA33ACT5 即5TCA3若添加His-tag序列，则变为： 5“如Not I酶切位点”TCAGAGGAGGAG3十、小分子干扰RNA技术RNA interference（RNAi）：与靶基因序列同源的双链RNA（dsRNA）所诱导一种序列特异性的转录后基因沉默现象。RNAi机制：体外实验表明：RNAi作用中，加入的dsRNA被切割为21-23核苷酸长的RNA片段，后者会使目的mRNA被切割为21-23核苷酸长的片段。 通过dsRNA的介导而特异地降解靶mRNA, 抑制相应基因的表达。均属于转录后水平的基因沉默(Post-transcriptional Gene Silencing, PTGS). dsRNA介导的同