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Zn-HAp/PLGA纳米纤维膜的制备与探究Zn-HAp/PLGA纳米纤维膜的制备与研究论文设计者：* 指导教师：*专业：生物医学工程论文方向：生物材料二0一五 年 五 月学术诚信声明本人所呈交的毕业论文，是在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果，所有数据、图片资料均真实可靠。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他人或集体已经发表或撰写过的作品或成果。对本论文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确的方式标明。本毕业论文的知识产权归属于培养单位。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。本人签名： 日期： Zn-HAp/PLGA纳米纤维膜的制备与研究Prepare and study on Zn-HAp/PLGA nanofiber membrane专业：生物医学工程本科生：*指导教师：*摘要羟基磷灰石与人体骨组织具有相似的结构,因而引起了科研工作者的关注。随着对羟基磷灰石研究的深入，科研工作者发现它具有良好生物相容性，可以引导骨的生长，能够与骨组织形成牢固的骨性结合。因此，羟基磷灰石常用于骨修复和替代材料。PLGA是一种可降解的高分子有机化合物，具有良好的生物相容性、无毒，在组织工程中常作为支架材料来进行细胞的培养，为细胞生长提供三维空间。因此，本文以羟基磷灰石与PLGA为原料制备了一种复合材料，以期应用到骨组织工程中。本文以CaCl2、ZnCl2、Na2HPO4为原料，利用化学沉淀法制备出锌掺杂的纳米羟基磷灰石，再用静电纺丝法制备锌掺杂羟基磷灰石纳米粒与PLGA复合纤维膜并用FTIR、SEM对纤维膜进行表征。SEM结果表明羟基磷灰石与PLGA的复合材料在纤维形貌上的表现更为出色。关键词：锌掺杂羟基磷灰石；PLGA；静电纺丝；骨组织工程Prepare and study on Zn-HAp/PLGA nanofiber membraneMajor: Biomedical EngineeringName: Li ChengpengSupervisor: Lecturer Liyan,AbstractThe chemical composition of hydroxyapatite is similar to the main ingredients of bone tissue of human body. Therefore，hydroxyaptite HAs attracted much attentionoftheresearchers. With further research on hydroxyapatite, it was discovered that thebiocompatilityofhydroxyapatiteisverywell and it can guide the growth of the bone. Hydroxyaptite and bone can reachosseointegration when it was embedded in bones. Therefore, it is widely used forbone repairand replacement materialofbone. PLGA is a biodegradable and non-toxic polymer with well biocompatibility. In tissue engineering, PLGA as cell scaffold materials for cell culture is used to provid three dimensional space for cell adhesion. Here, a composite material as a cell scaffold material to be used in tissue engineering was prepared via method of electrostatic spinning using Zn-doped HAP and PLGA as raw materials in this dissertation. In this dissertation, using CaCl2、ZnCl2 and Na2HPO4 as starting materials, Zn-doped hydroxyapatite nanorods were prepared via chemical precipitation method. Then fiber membrane was prepared via method of electrostatic spinning using Zn-doped hydroxyapatite nanorods and PLGA as raw materials. The fiber membrane was systematically characterized by SEM and FTIR. The results of FTIR showed that zinc doped hydroxyaptite nanorods were successfully entrapped in PLGA membrane. The results of SEM show HAp the prepared composite material using Zn-doped hydroxyapatite nanorods and PLGA as raw materials HAps better fiber morphology.Key words: Zn-doped Hydroxyapatite; PLGA;Electrostatic Spinning; Bone Tissue Engineering46目录目录摘要1Abstract2目录4第一章绪论71.1引言71.2羟基磷灰石81.2.1羟基磷灰石的结构与特性81.2.2 纳米羟基磷灰石的制备方法91.2.3 离子掺杂纳米羟基磷灰石111.2.4 纳米羟基磷灰石的应用121.3静电纺丝121.3.1静电纺丝的起源与发展121.3.2静电纺丝原理131.3.3静电纺丝设备141.3.4静电纺丝影响因素151.3.5静电纺丝纳米纤维的应用171.4本文的研究目的、主要内容及创新性171.4.1 本文的研究目的171.4.2本文的研究内容181.4.3本文的创新性181.5 本章小结19第二章HAp的制备与Zn-HAp的制备202.1 引言202.2 实验试剂与设备仪器202.2.1 实验试剂202.2.2 实验设备仪器212.3 实验部分212.3.1 化学沉淀法制备HAp212.3.2 化学沉淀法制备Zn-HAp222.3.3 HAp与Zn-HAp的FTIR分析222.4 结果与讨论222.4.1 HAp与Zn-HAp的粒径与电位检测结果222.4.2 HAp与Zn-HAp FTIR分析232.5 本章小结25第三章PLGA静电纺丝探究263.1引言263.2实验试剂263.3实验部分263.3.1PLGA静电纺丝溶剂与溶液浓度的探究263.3.2PLGA静电纺丝的电压283.4PLGA纤维膜的SEM结果293.5 本章小结30第四章HAp/PLGA、Zn-HAp/PLGA纤维膜的制备314.1 引言314.2 实验部分314.2.1 实验试剂314.2.2 HAp/PLGA、Zn-HAp/PLGA的静电纺丝纤维膜的制备314.3 结果与讨论324.3.1 HAp/PLGA纤维膜与Zn-HAp/PLGA纤维膜FTIR结果324.3.2 PLGA纤维膜与Zn-HAp/PLGA纤维膜SEM对比354.3.3 PLGA纤维膜与HAp/PLGA纤维膜力学性能对比364.4 本章小结38第五章结论与展望395.1 结论395.2 展望40参考文献42致谢44第一章 绪论第一章 绪论1.1 引言人体由于疾病、创伤等因素所造成的骨组织缺损问题可以通过某些替代物的移植来进行修复与治疗，最初使用的替代物主要有两类：一种是不锈钢等医用金属材料；另一类则是自体骨、同种异体骨和人工替代骨。然而这些替代物都存在一定的局限性，例如自体骨虽然是较为理想的骨缺损修复的替代物，但存在来源受限，对供骨部位有损伤；异体骨与人工骨虽然解决了来源问题，可满足大范围移植治疗需求，但是存在免疫排斥、感染等问题。这就迫使科研工作者去寻找更为优异的骨移植材料，希望在解决来源与相容性问题的同时其他各方面性能也都都要求达到人体骨组织的性能标准，尤其是机械性能方面。随着组织培养技术的发展与普及，细胞生物学、分子生物学、生物化学、组织工程学、生物医学材料学等多门学科的发展，1995年Crane GM系统提出了骨组织工程的概念、研究方法、研究现状及发展前景，引起了广大学者的关注1。骨组织工程是指将自体成骨细胞、骨髓基质干细胞或软骨细胞分离出体外并且培养增殖之后接种到细胞支架或细胞外基质上,当细胞在支架上培养到一定程度之后，将这种细胞杂化材料植入人体骨缺损部位，在支架材料的体内降解过程中所种植的细胞在人体骨缺损部位不断增殖，并最终形成新的组织，从而达到骨修复的治疗目的。所使用的细胞支架材料要求具有良好生物相容性，移植到人体后可逐步被人体降解吸收而不会有毒副作用，为细胞提供生存的三维空间以利于细胞附着生长、进行物质交换与新陈代谢。骨组织工程主要包括三要素种子细胞，细胞支架，生长因子。细胞支架材料是构建骨组织工程的基本构架。因此，寻求一种性能优异的细胞支架材料是骨组织工程中必不可少的工作。二十世纪九十年代，科研工作者就发现了人体的骨骼和牙齿的主要成分与羟基磷灰石（HAp）十分相似2。二十世纪五十年代，科研工作者已经人工合成羟基磷灰石单晶和羟基磷灰石多晶体 3。随着对羟基磷灰石研究的深入，科研人员发现羟基磷灰石具有良好的生物相容性和生物活性，而且植入人体中能够与人体骨组织紧密结合，并且可以引导骨生长。聚丙交酯-乙交酯共聚物（PLGA）是组织工程中较为常用的人工合成高分子材料，通过调节丙交酯、乙交酯的比例可以调节其表面性能以及生物降解速率，降解产物无毒。同时可以根据具体组织或器官的特点进行专门设计，具有良好机械性能,易于加工，产品的质量容易标准化,可以大规模生产。但PLGA生物活性不高，在骨组织工程中不能引导骨生长，而羟基磷灰石则相反，由单一的羟基磷灰石所制备的生物陶瓷生物活性高但机械性能不佳，脆性大。随着复合材料研究的深入，羟基磷灰石与PLGA的复合研究逐渐引起了研究者的关注。相比宏观材料，纳米材料具有其独特的光、电、磁性能，在大多领域都具有广阔的应用前景。一维纳米材料是指在两维方向上为纳米尺度，一维方向为宏观尺度的纳米材料，例如纳米管、纳米纤维等。一维材料的制备方法通常有气-液-固生长法、模板法、溶剂热合成法、静电纺丝法等。其中，静电纺丝技术是近年发展起来的一维材料制备方法。随着静电纺丝技术的日趋成熟，利用静电纺丝技术制备纳米材料已经逐步成为研究热点。该法操作简单，可以通过静电纺丝法获取直径极小的纳米纤维，制备纳米管、纳米纤维膜等不同形貌的纳米材料。1.2 羟基磷灰石1.2.1 羟基磷灰石的结构与特性表1-1 羟基磷灰石的结构与特性化学式简称熔点密度溶解度Ca10(PO4)6(OH)2HAp16503.156g/cm30.4ppm钙磷比折射率莫氏硬度形状颜色1.671.64-1.655粉末或多孔颗粒白色晶系空间结构空间群对称型晶胞参数六方晶系六角柱体P63/mL6PCa=b=0.9418nmc=0.6884nm羟基磷灰石，又称羟磷灰石，是钙磷灰石Ca5(PO4)3(OH)的自然矿物化，常常写成Ca10(PO4)6(OH)2的形式。羟基磷灰石的单位晶胞有10个Ca2+、6个PO43-、2个OH-，在羟基磷灰石结构中，Ca2+具有两种不同的位置，分别是配位数为9的Ca（）位置和配位数为7的Ca（）位置4。在羟基磷灰石晶胞中，这两种不同位置的Ca2+数量也不一样，其中Ca（）位置的Ca2+数量为4个，位于Ca（）位置的Ca2+数量为6个。4个Ca（）位置的Ca2+与PO43-四面体中O相连组成Ca-O八面体，位于八面体中心。6个Ca（）位置Ca2+与PO43-四面体中的O相连，位于3个O组成的三配位体中心。至于羟基磷灰石中的OH-则位于由Ca2+和O形成的等边三角形的中心。正是因为羟基磷灰石的晶胞结构中存在通过Ca（）、Ca（）多面体连接起来的6个PO43-四面体网络结构使得羟基磷灰石具有比较稳定的结构。图1-1 羟基磷灰石的晶体结构图41.2.2 纳米羟基磷灰石的制备方法经科研工作者研究发现，纳米级的羟基磷灰石相比常规羟基磷灰石具有更为优异的性能，比表面积更大，吸附能力更强，溶解度更高，表现出更为优异的稳定性与生物相容性。目前，纳米羟基磷灰石的的合成技术已经相对成熟，制备纳米羟基磷灰石的方法较多，主要分为两大类，即为干法与湿法。1） 干法干法又名为固态反应法，就是在高温下进行固相反应。该法对反应温度控制要求较高，反应温度通常控制在1200，通入水蒸气进行固相反应。目前常见的合成路线有：1200，水蒸气Ca3(PO4)2+Ca4P2O9 HAp1200，水蒸气CaCO3+Ca4P4O7 HAp1200，水蒸气Ca3(PO4)2+CaO HAp1200，水蒸气Ca3HPO4+CaCO3 HAp在1200的烧结温度下，反应晶相为羟基磷灰石，而在1250的烧结温度下，晶相为羟基磷灰石和磷酸三钙5。这是由于羟基磷灰石在1250的烧结温度下发生了分解反应：1250Ca10(PO4)6(OH)2 Ca10(PO4)6O + H2O（气）12502Ca10(PO4)6O Ca3(PO4)2 + Ca2P2O7 + Ca4P2O9 2） 湿法湿法又包括了微乳液法、化学沉淀法、溶胶-凝胶法、水热合成法、自燃烧法等。微乳液法也就是由表面活性剂、助表面活性剂、碳氢化合物和水组成的透明的具有各相异性的热力学稳定体系。该法操作简便，所制备的纳米羟基磷灰石粒径分布较为均匀，但获得适当的微乳液体系存在一些问题。Lim6采用微乳液法，将CaCl2与(NH4)2HPO4分别制成微乳液，以环己醇为油相，正己醇为表面活性剂，将两种微乳液混合后静置一定时间后有沉淀物析出，用无水乙醇洗涤即可获得20-40nm的羟基磷灰石粉末。化学沉淀法是利用可溶性钙盐和磷酸盐溶液的复分解反应来合成羟基磷灰石。这种方法优点是操作简单，缺点是所制备的羟基磷灰石颗粒粒径不均匀，分散度比较低。利用沉淀法CUNEYT7等以Ca(NO3)24H2O和(NH4)2HPO4为原料，在一定条件下合成了高纯度、平均粒径约为50nm的羟基磷灰石粉末。本文即采用该方法制备出羟基磷灰石纳米粒子。水热法是指在密闭反应容器中，反应介质为水，在高温高压条件下进行化学反应的方法。该法优点是制备的羟基磷灰石粉体粒径均匀，形态规则，缺点是反应条件苛刻，能耗较大。利用水热法，Guo8等在300的水热条件下，制备出棒状羟基磷灰石纳米粒子。溶胶-凝胶法是利用易于水解的金属无机盐或金属醇盐，使其与水反应，经水解、聚合后形成溶胶，随着水的加入溶胶进一步凝胶化，在真空环境下低温干燥，再经过高温锻烧处理即可得到纳米级羟基磷灰石粉体。该法优点是工艺流程简单，加工温度低，可以制备超细粉体，缺点是羟基磷灰石粉体粒径分布范围较宽，成本相对较高。利用溶胶-凝胶法，Kim9等以Ca(NO3)2和(C2H5O)3P(O)为原料，制备出粒径范围在50- 150nm的羟基磷灰石纳米粒子。自燃烧法是建立在在溶胶-凝胶法的基础上研发出来的方法，主要利用硝酸盐与羧酸反应，在低温条件下进行原位氧化，自发燃烧快速合成纳米羟基磷灰石产物的初级粉末。该方法具有操作简单、制备周期短、产物分散性良好等优点。利用自燃烧法，韩颖超10等以Ca(NO3)2、(NH4)2HPO4为原料，以柠檬酸为燃烧剂，制备了平均粒径为85nm的羟基磷灰石纳米粒子。1.2.3 离子掺杂纳米羟基磷灰石与人工合成的羟基磷灰石相比，人体硬组织中的无机组分除了羟基磷灰石之外，还拥有各种阴离子与阳离子，例如羟基磷灰石中的钙离子被少量镁离子、钠离子、银离子、锌离子等金属离子所替代，硫酸根离子容易被少量碳酸根离子、碳酸氢根离子所替代，氢氧根离子容易被少量的碳酸根离子、氟离子、硅离子所替代。尽管这些离子在硬组织中所占比重极小，某些离子其在硬组织的生化过程具有不可替代的作用。例如锌离子是人体骨骼不可或缺的元素，一定浓度的锌离子具有抗菌作用,人体中锌离子含量在2-3g之间，而90%的锌存在与人体肌肉与骨骼之中。本文采用沉淀法制备了锌离子掺杂的羟基磷灰石纳米粒子。1.2.4 纳米羟基磷灰石的应用1） 纳米羟基磷灰石在药物控释领域中的应用羟基磷灰石纳米粒子具有良好的生物相容性、无毒无免疫原性、比表面积大、粘附性能强、可以结合并传递药物分子等优异性能。将羟基磷灰石用于药物载体系统，能够有效提高药物分子在生物膜中的透过性，有利于药物透皮吸收并在细胞内的发挥药效11。Ljntema K12等采用纳米羟基磷灰石晶粒包裹蛋白类药物BSA，制备出具有缓释功能的药物控释体系，进而证明羟基磷灰石能够有效控制药物的释放速率。2） 纳米羟基磷灰石在肿瘤领域中的应用Hideki13等在进行体外细胞培养实验时发现纳米羟基磷灰石对正常细胞几乎无影响。然而，Kannan14等研究发现，羟基磷灰石纳米粒子可以导致肿瘤细胞大量凋亡。这是因为羟基磷灰石纳米粒子的存在会提高钙离子浓度，肿瘤细胞的超强钙摄入能力导致摄入大量Ca2+，导致肿瘤细胞内Ca2+浓度上升，Ca2+进一步激活细胞内Ca2+/Mg2+依赖性核酸内切酶，最终导致DNA降解，肿瘤细胞凋亡。3） 纳米羟基磷灰石在骨组织工程中的应用纳米羟基磷灰石与人体硬组织具有极为相似的结构，拥有良好的生物相容性，但是单一的纳米羟基磷灰石存在抗弯曲强度低、脆性大、抗疲劳性差等问题，其机械性能不足以满足人体硬组织的要求。而纳米羟基磷灰石-高分子复合材料在一定程度上能改善某些性能，因此纳米羟基磷灰石-高分子复合材料在骨组织工程中具有极为广阔的应用前景。本文利用静电纺丝法将锌离子掺杂的羟基磷灰石纳米粒子与PLGA共混制备出作为骨细胞支架材料的Zn-HAp/PLGA复合静电纺丝膜。 1.3 静电纺丝1.3.1 静电纺丝的起源与发展近年来，静电纺丝技术发展迅速，随着静电纺丝技术的日趋成熟，利用静电纺丝技术制备纳米材料已经逐步成为研究热点。该法操作简单，可以通过静电纺丝法获取直径极小的纳米纤维，制备纳米管、纳米纤维膜等不同形貌的纳米材料。事实上，静电纺丝近似静电雾化的拓展，静电纺丝体系是建立在静电雾化技术的理论依据和基础之上。静电纺丝与静电雾喷主要区别区别是工作介质不一样，静电纺丝工作介质是粘度较高，属于非牛顿流体，而静电雾化工作介质是粘度较低，属于牛顿流体。1882年，Realign15经研究发现了液滴在电场中存在不稳定的现象。当所受表面张力无法抵抗外加电场力时，悬在喷口的液滴就会劈裂成一串的带电小液滴。1917年，Zeleny16在经研究发现以水作溶剂与乙醇作溶剂相比，不稳定现象的电压增高。1934年，Formalas17发明了用静电力制备聚合物纤维的实验装置并申请了专利，其专利公布了聚合物溶液如何在电极间形成射流，这是首次详细描述利用高压静电来制备纤维装置的专利，被公认为是静电纺丝技术制备纤维的开端。1964年Taylor18经研究发现当液滴的电场力和表面张力二者处于平衡时，就会形成一个49.3的角，即泰勒锥。1971年，Baumgarten19以丙烯腈树脂/DMF溶液为纺丝液，通过静电纺丝获取纤维，通过实验验证了纤维的长度与溶液的粘度正相关。随着社会的进步、科学技术的发展，静电纺丝技术近年来发展迅速，经科研人员大量实验基本确定了静电纺丝过程中影响纤维结构和形态的因素。同时，研究的领域进一步拓展，这包括单一组分纳米纤维和复合纳米纤维。而本文则利用静电纺丝法制备了Zn-HAp/PLGA复合纳米纤维膜。1.3.2 静电纺丝原理静电纺丝是一种特殊的纤维制造工艺，聚合物溶液或熔体在强电场中进行喷射纺丝。在电场作用下，针头处的液滴会由球形变为“泰勒锥”，经溶剂蒸发和熔体冷却固化延展得到纤维细丝。这种方式可以生产出纳米级直径的聚合物细丝。图1-1 静电纺丝原理图1.3.3 静电纺丝设备实验设备主要包括三个部分，分别为高压直流电源、纺丝装置和接收装置三个主要部分。纺丝装置可分为单通道与多通道，单通道的纺丝装置纺丝效率低，若需要一次纺丝中得到大量产物，一般采用多通道纺丝装置。静电纺丝的接收装置种类较多，最常见的为金属板接收装置与滚筒式接收装置，本文中采用的极为该法。但这一类接收装置所制备的纤维膜纤维取向杂乱无章，导致纤维膜的内部应力情况极为复杂，不易测试其力学性能，一般通过其单根或数根纤维力学拉伸来测试其力学性能。滚筒式接收装置，即利用一定转速的滚筒来作接收装置，利用滚筒可以制备具有单一走向的纤维膜，使得纤维膜内部应力不复杂，可做纤维膜的力学拉伸实验，易检测其力学性能。图1-2 高压直流电源 （a） （b）图1-3 （a）单通道注射泵，（b）双通道注射泵1.3.4 静电纺丝影响因素静电纺丝的影响因素很多，包括溶液性质、操作因素、环境因素等等。溶液性质主要包括溶剂、聚合物、表面张力等，操作因素包括电压、接收距离、溶液喷射流速等，环境因素主要是空气湿度。1） 溶剂溶剂的选择主要依据聚合物性质进行选择。在选择溶剂时，一般要考虑溶剂的挥发性以及聚合物在所选取的溶剂的溶解性，同时还需要考虑所选择的的溶剂与聚合物分子链之间的化学键作用，一般来说，挥发性高的溶剂更有利于获得直径均匀的纤维，聚合物在溶剂中的溶解性可直接影响到成丝与否，所选溶剂与聚合物分子链的相互作用越小就越有利于获得直径更小的纤维。2） 溶液的浓度和粘度溶液浓度过低会导致溶液粘度偏低，进而导致纺丝过程中射流不稳定，所得纤维直径不均一、串珠较多，甚至有可能不成丝。溶液浓度过高则导致溶液粘度偏大，容易出现堵针头现象。不同聚合物与不同溶剂的组合均有其可纺的浓度范围。一般来说，在纺丝液可纺的浓度范围内，浓度越低，则纤维直径越小，但纤维直径不均一；浓度越高，则纤维直径越大，而纤维直径相对均一。3） 聚合物相对分子质量聚合物的相对分子质量大小是其静电纺丝成丝与否的重要因素之一。聚合物的相对分子质量过低时难以成丝，这是因为分子链缺乏足够的缠绕能力。当聚合物相对分子质量过高时，所获得的纤维直径过大。A. Koski等人20经实验发现聚合物相对分子质量为2万左右最适合用于静电纺丝。4） 溶液表面张力表面张力通常是产生串珠的主要因素，纤维上的串珠会会影响纤维的形貌，进而影响其性能。为了获得无串珠出现的纤维，就要降低纺丝液的表面张力。通常采取的措施有：在纺丝液中加入表面张力小的溶剂或者加入表面活性剂。5） 溶液导电率 在静电纺丝的过程中，溶液的拉伸是由于纺丝液表面电荷在静电场中的电场力所导致的，溶液的电导率不同纤维的直径、形貌、可纺性。一般情况下，为了提高溶液的可纺性可以在溶液中加入少量的电解质，从而减小纤维的直径。6） 电压电压对静电纺丝的影响比较复杂，不同科研工作者经不同的实验所得到的规律并不一致。Buchko21等进行蛋白质溶液的静电纺丝实验发现增大电压可以使减小纤维直径。然而，Demir22经研究发现随电压的增大，纤维的直径也随之增大。而Reneker23在聚氧乙烯的静电纺丝时却发现纤维的直径并不随电压的变化而变化。电压的大小还会影响串珠纤维的形成，电压越高，串珠越多，串珠形状也从纺锤体向球体变化。同时，电压的大小会产生影响纤维结晶度，电压越高，纤维结晶度越低。7） 接收距离接收距离也就是针头喷口与接收装置的距离。在静电纺丝过程，接收距离可以影响到溶剂的挥发，从而影响纤维的直径与形貌。当其他条件一定时，接收距离越大，纤维直径越小且直径分布更均匀。这是因为其他条件一定的情况下，接收距离越大，场强降低，溶液射流飞行时间变长，溶剂得以充分挥发。但接收距离过大，场强下降过大，影响射流拉伸速度和溶剂的挥发，最终导致所得纤维中有残留溶剂。8） 溶液流速纺丝溶液的喷射速度主要影响溶剂的挥发。溶液流速过快，射流的飞行时间过短，溶剂无法完全挥发，导致所得纤维中有残留溶剂。而溶液的流速过慢，则可能导致射流拉伸速度受影响，所得纤维不连续。1.3.5 静电纺丝纳米纤维的应用纳米纤维具有极高的比表面积和孔隙率，有利于细胞的粘附，故而可以作为组织工程中的细胞支架材料，较高的比表面积使得纳米纤维可作为吸附媒介与生物化学防护服。同时，纳米纤维在传感器材料、导电材料、超疏水材料等方面也具有极为广阔的应用前景。1.4 本文的研究目的、主要内容及创新性1.4.1 本文的研究目的作为骨修复材料，羟基磷灰石近来一直是研究的热点。人工合成的羟基磷灰石与人体硬组织相比，缺乏某些离子,以至于无法完全替代人体硬组织。锌离子是人体骨骼不可或缺的元素，一定浓度的锌离子具有抗菌作用,而且对于骨生长具有诱导作用。人体中锌离子含量在2-3g之间，而90%的锌存在与人体肌肉与骨骼之中,人工合成的羟基磷灰石往往缺乏锌离子。因此，模拟人体骨组织中胶原与羟基磷灰石的复合结构，在制备羟基磷灰石的过程中掺杂一定量的锌离子以制备出Zn-HAp，同时利用静电纺丝法制备出Zn-HAp/PLGA复合纳米纤维膜，并将该复合材料应用到骨修复治疗中。1.4.2 本文的研究内容本文研究内容主要包括三个方面：（1）HAp与Zn-HAp的制备。本文主要采用化学沉淀法来制备HAp与Zn-HAp，在制备HAp的基础上，用一定量的锌盐代替少量的钙盐进行反应即可制备锌离子掺杂的HAp。制备出HAp与Zn-HAp之后对两者进行表征，对比二者理化性能。（2）探索PLGA的静电纺丝条件。本文中通过静电纺丝实验探索PLGA的纺丝溶剂、聚合物浓度、纺丝电压。部分参数设定为流速1mL/h，液量1mL，在PLGA的纺丝溶剂的选择上，在其他条件一定在溶剂不同条件下，以纤维形貌为指标进行选择，最终选取丙酮/DMF混合溶剂作为纺丝液溶剂。在聚合物浓度的探索中，通过改变聚合物浓度进行静电纺丝，以纤维形貌为指标进行选择，最终选择了聚合物浓度为20%（w/t%）。对于纺丝电压，通过改变纺丝电压进行静电纺丝，以纤维形貌为指标进行选择，最终选择了14kV的纺丝电压。（3）制备PLGA、HAp/PLGA、Zn-HAp/PLGA纤维膜。通过静电纺丝法制备PLGA、HAp/PLGA、Zn-HAp/PLGA纤维膜，并且在三者之间进行微观与宏观上的比较，并且讨论其在骨组织工程中的应用前景。1.4.3 本文的创新性本文基于化学沉淀法制备HAp的基础上以锌盐代替部分钙盐的方法制备锌离子掺杂的HAp，并通过静电纺丝的方法将其制备成纳米复合纤维骨修复材料应用于骨修复治疗中。1.5 本章小结本章简要介绍骨修复的所面临的问题与骨组织工程的概念，还介绍羟基磷灰石结构与各方面性能、制备方法以及在骨组织工程中的应用前景。同时，介绍了静电纺丝的起源与发展以及静电纺丝纤维的应用前景，在本章的最后，还介绍了本文的研究目的、研究内容、创新性。第二章 HAp的制备与Zn-HAp的制备第二章 HAp的制备与Zn-HAp的制备2.1 引言本实验是采用化学沉淀法来制备HAp与Zn-HAp，化学沉淀法是利用可溶性钙盐和磷酸盐溶液的复分解反应来合成羟基磷灰石。以CaCl2和Na2HPO4为反应物，根据如下反应式制备羟基磷灰石： 5CaCl22H2O+3Na2HPO4+4OH-=Ca5(PO4)3OH+6NaCl+13H2O+4Cl-根据该反应式，本实验还制备了锌离子掺杂的羟基磷灰石（Zn-HAp）。羟基磷灰石的钙磷比为1.67，故而维持摩尔比n（Zn+Ca）/n（P）=1.67的前提下本实验中加入少量ZnCl2代替部分CaCl2进行反应用以制备锌离子掺杂的羟基磷灰石。2.2 实验试剂与设备仪器2.2.1 实验试剂表2-1 主要实验试剂实验试剂产地CaCl2广州化学试剂厂ZnCl2天津市大茂化学试剂厂Na2HPO4广州化学试剂厂NaOH国药集团化学试剂有限公司PAA上海瑞永生物科技有限公司2.2.2 实验设备仪器表2-2 主要实验设备仪器设备名型号产地电子天平BSA2245-CW德国Sartorius公司Millipore超纯水系统Mill-Q Advantages A10 System美国Millipore公司超声波清洗机SG3200HBT上海冠特超声仪器有限公司磁力搅拌器84-1A上海司乐仪器有限公司实验室pH计FE20梅特勒-托利多仪器有限公司低速离心机L-530湖南湘仪实验室仪器开发有限公司Malvern激光粒度仪及Zeta电位仪Zetaszier Nano-ZS90英国Malvern公司注射泵控制器TJ-3A保定兰格恒流泵有限公司2.3 实验部分2.3.1 化学沉淀法制备HAp1）配制50mL浓度为 5mg/mL的PAA水溶液，50mL浓度为2M的NaOH溶液备用。2）准确称取110mgCaCl2粉末加到9mL水中充分溶解，再加入1mL浓度为5mg/mL的PAA水溶液，得到10mL浓度为0.1M的CaCl2溶液。3）再称取85.2 mg Na2HPO4粉末加入90mL水中，在200rpm转速下充分搅拌溶解，同时加入10mL 5mg/mL的PAA水溶液，得到100mL浓度为0.006M的Na2HPO4溶液。用实验室pH计测Na2HPO4溶液的pH值，同时用浓度为2M的NaOH溶液将Na2HPO4溶液pH值调节至10。用10mL注射器吸取10mL CaCl2溶液，用注射泵控制器将灌注速度控制在0.5mL/min，将10mL CaCl2溶液逐滴加入到Na2HPO4溶液中，在反应过程中缓慢加入浓度为2M的NaOH溶液使得溶液一直维持在pH=10的状态。4）灌注20min后，反应结束，搅拌速度不变，pH维持为10的条件下继续搅拌30min。30min后，反应液在1500rpm转速下离心5min，取沉淀，去上清液，用超纯水洗涤三次。三次洗涤后留样测粒径与电位，将其余样品置于-80冰箱冻结，之后置于冷冻干燥机中冷冻干燥24h，即可获得HAp粉体。2.3.2 化学沉淀法制备Zn-HAp准确称取105.4mg CaCl2粉末与6.8mg ZnCl2，二者摩尔比为95:5，一起加到9mL水中充分溶解，再加入1mL浓度为5mg/mL的PAA水溶液，得到10mL浓度为0.1M的CaCl2/ZnCl2混合溶液，重复上述步骤3、步骤4制备Zn-HAp粉体。，2.3.3 HAp与Zn-HAp的FTIR分析取足量溴化钾放到烘箱中烘1h，充分研磨后压制成溴化钾空白片备用。称取5mg冻干后的HAp粉末，按样品与溴化钾质量比1:100计算后称取500mg溴化钾，放到烘箱中烘1h，混合研磨，压片，将压好的空白片与样品片进行FTIR检测。称取5mg冻干后的Zn-HAp粉末，重复上述步骤。 2.4 结果与讨论2.4.1 HAp与Zn-HAp的粒径与电位检测结果图2-1 HAp的粒径分布柱状图图2-2 Zn-HAp的粒径分布柱状图表2-3 HAp与Zn-HAp的粒径与电位SampleSize/nmPdIZeta/mVHAp 241310.2140.103-17.50.40Zn-HAp197190.1020.037-17.90.2由图2-1 HAp的粒径分布柱状图、图2-2 Zn-HAp的粒径分布柱状图中可以看出，化学沉淀法所制备出来的羟基磷灰石纳米粒子粒径分布相对集中，但分布范围比较宽，存在比较大的微球。由表2-3 HAp与Zn-HAp的平均粒径与平均电位对比图表可知， HAp的平均粒径与Zn-HAp的平均粒径相差不大。虽然锌离子的粒子半径比较小，但是锌离子的加入只是影响了晶胞的大小，而在微球体系中微球是多个单一粒子所组成的，Malvern激光粒度仪及Zeta电位仪所检测的是微球的粒径，而非晶胞的直径，因而锌离子的加入理论上对粒径与电位检测的结果影响不大。2.4.2 HAp与Zn-HAp FTIR分析 （a） （b）（c）图2-3 （a）HAp IR图，（b）Zn-HAp IR图，（c）HAp与Zn-HAp IR对比图从图可知，HAp与Zn-HAp两条红外吸收曲线基本重叠，这说明无论是峰位还是峰强，HAp与Zn-HAp的红外吸收峰基本一致。由以上红外光谱图分析可知，HAp与Zn-HAp均在568cm-1、1060cm-1、1417cm-1、1576cm-1、3411cm-1这五处分别出现较强红外吸收峰。568cm-1处的吸收峰对应的是PO43-的弯曲振动峰，1060cm-1处的吸收峰是PO43-的伸缩振动峰，1417cm-1、1576cm-1附近的强吸收峰可能是PAA所引起的红外吸收峰。以上光谱图中在3411cm-1处的出现吸收峰是OH-伸缩振动峰，主要是由水与羟基磷灰石中的羟基所引起的。从以上光谱图中可以得知，HAp与Zn-HAp的化学结构中都存在PO43-的特征吸收峰，这与已知的HAp化学式Ca10(PO4)6(OH)2相吻合。2.5 本章小结本章主要介绍了化学沉淀法制备HAp的原理与流程，同时在HAp的制备基础上想以锌盐部分代替钙盐来制备Zn-HAp，并且对两者的粒径与电位进行对比，并且分析其差异原因所在。对HAp、Zn-HAp都进行了红外表征，通过二者的红外光谱图分析羟基磷灰石的基团。对于Zn-HAp的锌离子定性检测，取足量首次离心的上清液，用原子吸收检测锌离子浓度，低于所加入锌离子浓度（0.0045M），说明缺少的锌离子参与了反应，合成了Zn-HAp。取样Zn-HAp粉体悬浮，用原子吸收定性检测锌离子也可证明锌离子参与反应。第三章 PLGA静电纺丝探究第三章 PLGA静电纺丝探究3.1 引言静电纺丝是一种特殊的纤维制造工艺，聚合物溶液或熔体在强电场中进行喷射纺丝。在电场作用下，针头处的液滴会由球形变为“泰勒锥”，经溶剂蒸发和熔体冷却固化延展得到纤维细丝。这种方式可以生产出纳米级直径的聚合物细丝。静电纺丝的影响因素很多，包括溶液性质、操作因素、环境因素等。静电纺丝实验室中常常通过溶剂的选择以及调节聚合物浓度、电压、接收距离、溶液流速等可控因素来对静电纺丝纤维的形貌进行优化。在本章中，主要探究溶剂的选择、聚合物的浓度、纺丝电压对静电纺丝所制备出来的纤维形貌有何影响，并且以所制备出来的纤维形貌作为观察指标，对溶剂、聚合物的浓度、纺丝电压进行筛选，探索出最适宜的静电纺丝条件。3.2 实验试剂表3-1 主要实验试剂试剂产地PLGA（M=70000，PLA/PGA=50:50）济南岱罡生物工程有限公司丙酮广州化学试剂厂四氢呋喃（THF）广州化学试剂厂N,N-二甲基甲酰胺（DMF）广州化学试剂厂3.3 实验部分3.3.1 PLGA静电纺丝溶剂与溶液浓度的探究1）纺丝液的配制称取0.075g、0.090g、0.100g、0.110g PLGA固体，分别溶于0.5mL体积比为3:1的丙酮与DMF混合溶剂中，得到PLGA浓度分别为15%、18%、20%、22%的均匀溶液。分别称取0.075g、0.090g、0.100g、0.110g PLGA固体，分别溶于0.5mL体积比为3:1的THF与DMF混合溶剂中，得到PLGA浓度分别为15%、18%、20%、22%的均匀溶液。2）PLGA的静电纺丝设定参数为电压12kV，流速1mL/h，液量0.5mL，接收距离21cm。分别取已配制的纺丝液进行纺丝，记录纺丝现象与接样在显微镜下观察。3）结果与讨论表3-2 丙酮/DMF与THF/DMF混合溶剂纺丝现象与显微形貌PLGA浓度（%）纺丝现象与显微形貌 （丙酮：DMF=3:1）纺丝现象与显微形貌（THF：DMF=3:1）15 液滴，不成丝，针头不堵液滴，不成丝，针头不堵18 液滴，不成丝，针头不堵液滴，不成丝，针头不堵20 纤维直径较小，光滑无串珠，针头不堵，纤维直径均匀度较低纤维直径较小，有大量串珠，针头不堵，纤维直径不均一22纤维直径变大，无串珠结构，直径均匀度略高，针头略堵纤维直径变大，少量串珠，针头略堵 （a）丙酮/DMF溶剂，X10 （d）THF/DMF溶剂，x10 （b）丙酮/DMF溶剂x20 （e）THF/DMF溶剂，x20 （c）丙酮/DMF溶剂，x40 （f）THF/DMF溶剂，x40图3-1 20% PLGA浓度下，不同溶剂的PLGA纤维膜的光镜图 随着PLGA的浓度升高，显微镜下观察纤维直径逐渐变大。同时随着PLGA浓度升高，溶液粘度变大，纺丝过程由不堵针头变为堵针头。溶剂的选择上，加入DMF是为了来提高溶剂导电率，再对比相同PLGA浓度下的丙酮/DMF与THF/DMF混合溶剂，前者所纺出来的纤维直径更小，而且THF与丙酮相比，THF毒性更大，故而本实验中采用丙酮/DMF混合溶液作为PLGA的溶剂。对于PLGA的浓度选择上，虽然20%浓度的PLGA丙酮溶液所纺出来的纤维直径均匀度较低，但是与22%浓度相差不太大，完全可通过调节电压达到与22%浓度纤维直径均匀度。为了获取直径更小的纤维，本实验采用20%的PLGA浓度。 3.3.2 PLGA静电纺丝的电压1） 纺丝液的配制称取0.100g PLGA固体，溶于0.5mL体积比为3:1的丙酮与DMF混合溶剂中，通过磁力搅拌机将PLGA均匀溶于溶剂中，得到PLGA浓度分别为20%的均匀溶液。2） PLGA的静电纺丝设定参数为流速1mL/h，液量0.5mL，接收距离21cm。取已配制的纺丝液进行纺丝，在纺丝过程调节电压分别为10kV、12kV、14kV，并且分别用玻片接样在显微镜下观察其形貌。表3-3 不同电压下PLGA静电纺丝的显微形貌电压/kV显微形貌10有少量纺锤体出现12光滑无纺锤体，纤维直径不均一14光滑无纺锤体，纤维直径相对均一3） 结果与讨论相比10kV、12kV，电压为14kV下的纤维在显微镜下具有更良好的形貌，其纤维直径比10kV、12kV条件下的纤维直径显得更均匀。因此，本文中的PLGA静电纺丝的后续实验电压定为14kV。3.4 PLGA纤维膜的SEM结果 (a) (b)(c)图3-2 PLGA纤维膜的TEM图 以上三张SEM图所表征的都是同一张纤维膜，（a）为低倍TEM图，（b）、（c）为高倍TEM图。低倍下观察发现这张纤维膜上的纺锤体较多，纤维聚集现象比较明显，从高倍下观察可发现纤维直径不均一纤维粗细不一。3.5 本章小结 本章简要介绍了静电纺丝的原理与影响静电纺丝的因素，并且采用控制变量的方法来对静电纺丝的溶剂、聚合物浓度、纺丝电压进行筛选，简要证明了溶剂、聚合物浓度、纺丝电压等因素对静电纺丝的影响极其变化所造成纤维形貌所呈现出来的规律性变化。第四章 HAp/PLGA、Zn-HAp/PLGA静电纺丝纤维膜的制备第四章 HAp/PLGA、Zn-HAp/PLGA纤维膜的制备4.1 引言在之前静电纺丝实验的基础上，本章用静电纺丝法制备HAp与PLGA的复合纤维膜，Zn-HAp与PLGA的复合纤维膜。并且对这两种纤维膜进行F