ImageLab操作手册.doc

Image Lab 中文操作手冊 Image Lab 影像擷取和分析軟體搭配Molecular Imager ChemiDoc XRS+、Molecular Imager Gel Doc XR+ 和 Criterion Stain FreeTM 影像擷取系統，可應用於凝膠電泳和轉漬膜之數位影像擷取和分析，而自動化的工作流程能加速影像擷取及參數最佳化之調整，並針對調整好的凝膠或轉漬膜影像進行系統性分析，進而得到所需的分析數據。一、軟體操作介面啟動精靈程式桌面主視窗工具列分析工具列狀態列1. 主視窗工具列 檔案管理 分析數據Results Data2. 顯示工具列轉換3D影像改變影像色彩全視窗大小放大縮小影像轉換膠片顯示設定影像資訊3. 分析工具列（1）影像擷取工具（Image Tools）（2）電泳條及電泳條帶工具（Lane and Band Tools）（3）分子量工具（MW Molecular Weight）（4）自動定量工具（Quantity Tools）（5）註釋工具（Annotation Tools）（6）手動定量工具（Volume Tools） 二、使用Image Lab 軟體進行化學發光影像擷取流程1. 建立影像擷取流程：在膠片影像擷取（Gel Imaging）對話方塊中選擇Chemi（化學發光）應用程式(1) 在影像擷取區域（Imaging Area）對話方塊中的下拉式選單中選擇合適的樣品大小（非必需）(2) 選擇影像擷取曝光（Image Exposure）方法，可以自行評估曝光時間並以手動設定（Manual Exposure），或是使用信號累積模式（Signal Accumulation Mode，SAM）來進行評估。擷取化學發光的影像流程中最重要的關鍵在於影像曝光時間的確定，過短的影像曝光時間可能會無法辨識到微弱的信號（高於背景值）；相對地，較長的影像曝光時間則是會造成電泳條帶之訊號過飽和而超出了相機的偵測極限。若使用ChemiDoc XRS+擷取化學發光樣品的影像，需要在設定手動或信號累積模式（SAM）前先確認好適合的影像擷取時間框架。2. 手動曝光(1) 選擇手動設定曝光時間（Manually set exposure time）並在讀秒框中輸入10秒。(2) 選擇Highlight saturated pixels 。(3) 把膠置於透射箱的中心位置。(4) 在程式視窗中點擊按鈕。(5) 觀察顯示器中樣品的即時影像，打開照膠系統的門並移動樣品直到位於視野的中心區域。(6) 可利用照相機的變焦滑板調節影像擷取區域的大小。(7) 選擇按鈕來擷取影像。若所需的影像出現在電腦的顯示器上，確認影像中是否包含紅色的飽和區域。若有飽和區域存在，請重新以較短的曝光時間參數來擷取影像。若無飽和區域存在，則可移動滑鼠置於最暗的條帶之上，在較低的右下角Image Lab視窗中觀察信號的強度數值。如圖中顯示強度為1994，照相機能記錄的最大值的32分之一（最大值為65,535）。用你的最初的10秒曝光再乘以30就可在照相機的最大動態範圍附近影像擷取你的樣品。若你只需針對單一影像的影像擷取時間進行評估，可直接在手動曝光區域中輸入300。3. 信號累積模式（Signal Accumulation Mode，SAM）如果預估方法不足以滿足您的需求，可選擇SAM按鈕，再選擇Setup按鈕。一個新的對話方塊會跳出來，包含可以輸入影像擷取時間的參數位置。我們可以輸入原本預測的300秒曝光時間上下的範圍，可設定擷取5個影像，推測能擷取到接近最佳化的影像。而SAM設定的影像顯示對話視窗，在您選擇按鈕後再點選按鈕，視窗會顯示相關進度圖示來說明整體影像擷取的時間。在250秒擷取第一個影像，同時小縮圖會出現在視窗的下方，以此類推整個過程將持續到擷取所有的影像。藉由移動滑鼠到影像上，就能即時地判定強度值，可再利用位於左邊的影像轉換視窗（Image Transform）中的調節游標來改變影像的顯現。若確定調整到符合您要求的影像時，點擊 按鈕捨棄其他不適合的影像來完成擷取影像的程序。也可在SAM擷取影像的過程中或之後來保存需要的影像，直接點選右鍵單點縮圖視窗內的影像即可進行存檔保留下來。在決定擷取影像的數量前，需要先確定增加SAM影像參數是否會影響背景值的變化。當擷取的影像次數提高時，可能會造成接近背景值的訊號難以辨識，若需要針對較弱的信號進行擷取，仍然建議選擇適當的曝光時間來進行影像擷取。三、建立快速分析步驟（Creating Protocols）1. 啟動分析精靈視窗 - STEP 1. GEL IMAGING（1）選擇應用的程序（Choose an application）（2）選擇影像擷取區域（Choose the Imaging Area）（3）選擇影像擷取曝光時間（Choose Image Exposure Time）（4）選擇顯示設定（ Choose Display Options , Highlight saturated pixels and Image Color）2. 進行影像分析（Analyze Image）- STEP 2. DETECT LANES AND BANDS 設定DETECT LANES AND BANDS的參數（Low Band Detection Sensitivity（Low sensitivity = 25）、High Band Detection Sensitivity（High sensitivity = 75）或自行設定靈敏度。 3. 分子量分析（Analyze Molecular Weight ）-STEP 3. ANALYZE MOLECULAR WEIGHT 設定Analyze Molecular Weight Settings的Molecular Weight Standard（Precision Plus Protein Standards、Prestained SDS-PAGE Standards Broad Range、Prestained SDS-PAGE Standards Low Range或Prestained SDS-PAGE Standards High Range）、Standard Lanes及Regression Method參數。4. 報告輸出設定（Report Settings）- STEP 4. SPECIFY CONTENT OF REPORTS5. 結果（Results Overview）及報告（Report） （1）數據顯示資訊（Displaying Data）（2）分析表格設定（Analysis Table Options） （3）Lane 資訊（Lane Profile）（4）標準曲線（Standard Curve） 四、建立影像分析步驟（Creating Images Analyzing Protocols）1. 影像分析（Analyzing Images）（1）分析工具Analysis Tool Box（A）自動分析（Auto Analysis） 點選進入Detection Settings視窗 設定Detect lanes and bands的參數（Low Band Detection Sensitivity（Low sensitivity = 25）、High Band Detection Sensitivity（High sensitivity = 75）或自行設定靈敏度），接著再設定 Molecular Weight Analysis Settings的Molecular Weight Standard、Standard Lanes及Regression Method參數。2. 影像工具（Image Tools） 藉由水平或垂直延伸（Flip）、左右旋轉90或自由旋轉（Rotate）、裁切（Crop）、反轉（Invert Data）及疊合（Merge）。3. Lanes及Bands工具（Lane and Band Tools） （1）Lane Tab 使用自動（Automatic）或手動（Manual）搜尋Lane功能（A）針對所有的Lanes（All Lanes）進行大小調整（Resize）、（Adjust）及 刪除（Delete）等參數調整。（B）針對單一Lane（Single Lane）進行增加（Add）、彎曲（Bend）、移動（Move）、寬度（Width）及刪除（Delete）等參數調整。（C）利用Lane Background Subtraction進行背景值之扣抵，並可點選（Apply to selected Lane）針對單一Lane進行調整。- 可以藉由Rolling Disk參數設定可接受的最低限制（1-99 mm）來去除未符合的 背景值。（2）Bands Tab 藉由Detect Bands進行自動搜尋Bands功能或手動進行增加（Add）、刪除（Delete）及（Adjust）等參數調整。4. 分子量分析工具（Molecular Weight Analysis Tools） 此工具能藉由已知的標準品偵測相對的分子量或base pairs。5. 定量工具（Quantity Tools） （1）相對定量（Relative Quantity Tab） 從影像中選擇已知的標準品（reference band）及其標準品濃度（以R表示），其分析結果可從Analysis table觀察。（2）絕對定量（Absolute Quantity Tab） 藉由選擇已知標準品濃度的bands（至少兩個以上,以R表示），並設定合適的回歸參數計算所得之標準曲線來推算目標bands的絕對濃度（回歸參數設定如Linear(較常用)、Point-to-Point或Cubic spline）。Regression MethodMinimum number of standard bandsMinimum number with Force Through OptionLinear21Point-to-Point21Cubic Spline546. 註釋工具（Annotation Tools） 可以藉由Add Annotations工具增加文字註解及箭頭註解，並可調整註解相對位置（Alignment）、文字屬性、顏色及旋轉方向等參數7. 定量工具（Volume Tools） 按下選擇較適合的Band型態, 選取想要定量分析的Band位置, 並在Band上點擊左鍵兩下可將樣品定義為標準品或待測物種 , 並分別定義其定量依據 （ 如 kb , ppm , mg/ml ）建議用Rect Tool方形,先框出適當之方形,並用複製方式將分析之Band框出後（C+rl+C+左鍵/即可以複製） 在Band上點擊左鍵兩下可將樣品定義為標準品或待測物（