分子生物学笔记.doc

第一章 基因的结构 第一节 基因和基因组一、基因(gene)是合成一种功能蛋白或RNA分子所必须的全部DNA序列一个典型的真核基因包括编码序列外显子(exon)插入外显子之间的非编码序列内合子(intron)5-端和3-端非翻译区(UTR) 调控序列(可位于上述三种序列中)绝大多数真核基因是断裂基因(split-gene)，外显子不连续。二、基因组(genome)一特定生物体的整套(单倍体)遗传物质的总和，基因组的大小用全部DNA的碱基对总数表示。人基因组3X1 09(30亿bp)，共编码约10万个基因。每种真核生物的单倍体基因组中的全部DNA量称为C值，与进化的复杂性并不一致(C-value Paradox)。人类基因组计划（human genome project, HGP）基因组学（genomics）,结构基因组学（structural genomics）和功能基因组学（functional genomics）。蛋白质组（proteome）和蛋白质组学（proteomics）第二节 真核生物基因组一、真核生物基因组的特点：真核基因组DNA在细胞核内处于以核小体为基本单位的染色体结构中真核基因组中，编码序列只占整个基因组的很小部分(23)，二、真核基因组中DNA序列的分类?(一)高度重复序列(重复次数lO5)卫星DNA(Satellite DNA) (二)中度重复序列1中度重复序列的特点重复单位序列相似，但不完全一样，散在分布于基因组中序列的长度和拷贝数非常不均一，中度重复序列一般具有种属特异性，可作为DNA标记中度重复序列可能是转座元件(返座子)，2中度重复序列的分类长散在重复序列(long interspersed repeated segments)?LINES短散在重复序列(Short interspersed repeated segments)?SINESSINES：长度105如人Alu序列LINEs：长度1000bp(可达7Kb),拷贝数104-105，如人LINEl(三)单拷贝序列(Unique Sequence)包括大多数编码蛋白质的结构基因和基因间间隔序列，三、基因家族(gene family)一组功能相似且核苷酸序列具有同源性的基因可能由某一共同祖先基因(ancestral gene)经重复(duplication)和突变产生。基因家族的特点：基因家族的成员可以串联排列在一起，形成基因簇(gene cluster)或串联重复基因(tandemly repeated genes)，如rRNA、tRNA和组蛋白的基因；有些基因家族的成员也可位于不同的染色体上，如珠蛋白基因；有些成员不产生有功能的基因产物，这种基因称为假基因 (Pseudogene)a1表示与a1相似的假基因假基因分类。加工过的假基因(processed pseudogene)。典型的基因家族1tRNA基因?单倍体人基因组中1300个tRNA基因，tRNA基因簇2rRNA基因l00copyrRNA基因簇(重复单元28S、18S、5.8s-rRNA)3组蛋白基因30-40copy定位：7q32-q36组蛋白基因簇(重复单位：H1，H2A，H2B，H3、H4)特点：无intron，Poly(A)- RNA?4珠蛋白基因类：16p13，基因簇(24Kb)：51213类：11p15，基因簇(60Kb)：5 GrAr3四、超基因家族(Supergene family ，Superfamily)由基因家族和单基因组成的大基因家族，结构上有程度不等的同源性，但功能不同五、人类基因组中的重复序列标记1、A1u序列单倍体人基因组50万-100万拷贝，平均每隔3-6Kb就有一个Alu序列，人A1u序列长300bp：2X130bp重复序列；?+31bp间隔序列(中间)；两侧7-21bp正向重复(direct repeats)，返座子?Alu序列广泛散布于人基因组，约90%巳克隆的人基因合有Alu序列Alu序列标志。2、可变数串联重复?，?Variable number tamdem repeat， VNTR又称小卫星DNA(minisatellite DNA)由短重复单位(6-40bp)串联重复(6-100次以上)而成，多位于基因的非编码区，广泛分布。VNTR多态性分子标记DNA指纹图（fingerprint）.小卫星DNA突变与肿瘤，H-Ras。3、短串联重复（short tandem repeat,STR）又称微卫星DNA（microstallite DNA）2-6个核苷酸组成的重复单位串联重复(10-60次),两侧为特异的单拷贝序列，人基因组中每l0kb DNA序列至少一个STR序列。CA)n，50，000-100，000拷贝新一代遗传标记，人类基因组研究，肿瘤，遗传病第三节 线粒体基因组人线粒体基因组的特点：1、人线粒体基因组为16，569bp的双链闭环分子，一条链为重链(H链)，一条链为轻链(L链)，两条链均有编码功能，每个mtDNA分于编码13种蛋白质和24种结构RNA(22rRNA，2tRNA)2、线粒体DNA为母系遗传3、结构基因不含内含子，部分区域有基因重叠，因此病理性mtDNA突变更易发生4、mtDNA突变频率更高5、线粒体DNA突变的表型表达与核DNA不同。第四节 细菌和病毒基因组一、细菌基因组的特点。1功能相关的几个结构基因往往串联在起，受它们上游的共同调控区控制，形成操纵子结构，2结构基因中没有内含子，也无重叠现象。3细菌DNA大部分为编码序列。二、病毒基因组的特点1每种病毒只有一种核酸，或者DNA，或者RNA；2病毒核酸大小差别很大，3X103一3X106bp；3除逆病毒外，所有病毒基因都是单拷贝的。4大部份病毒核酸是由一条双链或单链分子(RNA或DNA)，仅少数RNA病毒由几个核酸片段组成?5真核病毒基因有内含子，而噬菌体（感染细菌的病毒）基因中无内含子6有重叠基因第五节 染色质和染色体细胞分裂间期染色质(chromatin)分裂期染色体(chromosome)一、染色质的基本单位核小体(一)核小体(nucleosome)结构DNA绕在组蛋白八聚体(H2A、H2B、H3、H4各一对)核心外1.8周(146bp),形成核小体核心颗粒。两个核小体核心颗粒之间有Linker DNA(0-80bp)，核小体核心颗粒+Linker=核小体(长180-210bp)核小 体DNA Ladder(二)组蛋白(histone)：一类小的带有丰富正电荷富含Lys，Arg)的核蛋白，与DNA有高亲和力组蛋白分类：1核小体核心组蛋白，H2A，H2B，H3，H4。分子量较小(102-135aa)作用：盘绕DNA形成核小体 。2H1组蛋白：较大(220aa)，作用：与Linker DNA结合后利于核小体稳定和更高级结构的形成?。二、染色质的高级结构1、30nm染色质纤丝?，2、袢环结构(looped domain)?。3、细胞分裂期染色体分裂期染色体=一对姐妹染色单体（Chromatid)有丝分裂中期46条染色体按大小和形状排列的的光学显微镜图像称为人的染色体核型(Karyotype)三、染色体的结构要素?。(一)着丝粒（centromere)：细胞分裂时染色体与仿锤丝相连结的部位，为染色体的正常分离所必需。?(二)端粒(telomere)：真核生物线状染色体分子末端的DNA区域端粒DNA的特点：1、由富含G的简单串联重复序列组成(长达数kb)人的端粒DNA重复序列：TTAGGC。2、端粒的末端都有一条12-16碱基的单链3端突出。端粒的作用：防止DNA末端降解，保证染色体的稳定性和功能（三）、复制原点.第三节 DNA双螺旋的呼吸作用 甲醛的变性实验呼吸作用的定义碱基对的稳定性生物学作用第四节 DNA的变性复性和分子杂交 一、变性(溶解) 在某些物理化学因子的作用下，DNA 双链间的氢键断裂，双链解离形成单链。性质变化增色效应；黏度降低；沉降速度增加。因素温度：温度升高引起的DNA 变性称热变性。加热使氢键断裂。可用热变性曲线描述热变性过程。见下图融点Tm：50%DNA 分子解链时的温度。融点与DNA 分子中的GC 有关，随（G+C）% 的含量呈线性增加化学：甲酰胺破坏氢键二、复性去除变性条件后，单链DNA 在适当条件下重新形成双链，回复到原有的物理和生物学特性。 复性动力学复性过程是两条单链DNA 碰撞形成双链DNA 的过程，是双分子反应。服从二级反应动力学规律。控制复性反应的两个参数是C0 和t Rate of reaction The reaction follows the second order equation C is the concerntration of DNA that is single-stranded at time t k is a reassociation rate constant. Progress of reaction Integrate the rate equation between the limits; Initial concerntration of DNA=C0 at time t=0; Concentration remaining single stranded=C after time t Critical parameter is C0t1/2 When the reaction is half complete at the time t=1/2 Therefore C0t1/2=1/k. 复性反应进行到50% 时的C0 .t 为C0 t1/2 C0t 曲线：用已经复性的DNA 浓度，即1C/C0 对C0t 的对数作图。如右图所示. C0t 值的意义：C0 t1/2 值可以用来表示反应体系中DNA 的总长度（单拷贝）。这种总长度称为DNA 的复杂性。通过测定复性动力学可以预测基因组的大小。真核基因组DNA 的复性动力学：第1 是快复性动力学组分，高度重复序列。第2 是中复性动力学组分，中度重复序列。第3 是慢复性动力学组分，单拷贝序列。X：DNA 的复杂性C0t 曲线特征：原核生物每种图形的现状大致相同；重复序列多,复性快。曲线意义：求DNA 的复杂度。三、分子杂交 原理：基于DNA 的变性与复性的特性。双链DNA 加热以后，变成单链，在去除变性条件后，在一定的条件下，具有互补顺序的DNA 能再形成双链。探针：一种标记的一段DNA 或RNA，与待测基因序列的DNA 或RNA 互补分子杂交技术的种类：固相杂交（待测核酸固相化）；Southern blot ，待测核酸为DNA；Northern blot ，待测核酸为RNA。液相原位杂交示意图：Dots hybridization，点状杂交，待测核酸为DNA 或RNA；Colony or plaque hybridization， 菌落或噬菌班杂交，待测核酸为DNA。Tissue hybridization ，组织原位杂交，检测mRNA 表达和定位。研究基因的定位，拷贝数，测序。菌落原位杂交：基因文库：染色体DNA 文库，cDNA 文库。第三章基因和基因组 一、原核生物基因组特征通常含有质粒；操纵子结构；顺反子；只有一个染色体；有SD 序列；基因重叠；一般没有内含子；只有一个复制起始位点；以RNA 为产物的基因往往是多拷贝的，蛋白质基因单拷贝。X174 ；噬菌体1染色体、核小体结构二、真核生物基因组染色体功能实现三要素：着丝点；端粒；复制起始点。基因组大小和C 值矛盾C 值：单倍体基因的全部DNA 含量。C 值矛盾：与预期相比，C 值明显过大；同一物种，C 值相差很大。基因组的基因数目（下表：不同生物的基因数目）。种类基因组大小（bp） 基因数目支原体 1.0106 750 噬菌体T4 1.6105 200 大肠杆菌 4.2106 2350 酵母 1.3107 6100 果蝇 1.4108 8750 人 3.3109 65000-80000 真核生物基因组序列特征：具有多个复制起始位点；编码序列仅占一小部分(3%) ，大部分为非编码序列。单拷贝序列；轻度重复序列；中度重复序列；高度重复序列。不同物种中,重复序列/非重复序列的比例相差很大，原核基本不重复。真核生物的重复序列基因家族：.珠蛋白；.rDNA；.tDNA；.组蛋白基因。rRNA 基因:酵母：140 次；果蝇：130250 次；人类：300 次。10 组蛋白基因家族：左图1 为组蛋白基因家族，箭头表示转录方向，右侧数字表示基因组重复次数。左图2 为真核生物基因组中不同的多基因家族。Alu 的重复序列：.AGCT；.散布；.Alu 序列；.约90% 相同。卫星DNA .隐蔽卫星DNA .小卫星DNA .微卫星DNA A.单拷贝序列特征a.含有内含子内含子(intron) 外显子(exon) 内含子检测: 限制性内切酶图谱DNA 的杂交内含子GT/AG 规则: 内含子与外显子连接处的序列特异: 内含子5端为GT,3 端为AG, GT/AG 规则. -GT-AG-外显子内含子外显子B.存在不同的转录单位a.简单转录单位转录单位的基本组成: b.复杂转录单位转录方式不同,拼接方式不同. 三、基因定位遗传图：基因在染色体上的位置。经典方法: 遗传交换定位接合定位染色体爬行法基因鉴定的方法：外显子特征与RNA 后cDNA 杂交；Zoo-blot 不同物种杂交；外显子捕捉；CG 岛鉴定； 扣除杂交。 内含子GT/AG 规则: 内含子与外显子连接处的序列特异: 内含子5端为GT,3 端为AG, GT/AG 规则. -GT-AG-外显子内含子外显子B.存在不同的转录单位a.简单转录单位转录单位的基本组成: b.复杂转录单位转录方式不同,拼接方式不同. 三、基因定位遗传图：基因在染色体上的位置。经典方法: 遗传交换定位接合定位染色体爬行法基因鉴定的方法：外显子特征与RNA 后cDNA 杂交；Zoo-blot 不同物种杂交；外显子捕捉；CG 岛鉴定； 扣除杂交。第四章DNA 复制第一节 复制概论 半保留复制复制的方向53 实验证据：在反应物中加入dNTP。具有固定的起始位DNA 聚合酶半不连续复制一条链连续合成，称主导链Leading Strand； 另一条链分段合成，称随从链（随后链）Lagging Strand。第二节 DNA复制的酶学 复制体系的鉴定DNA 基因：与DNA 复制有关的基因条件型突变体、温度突变体研究DNA 基因快停突变体、慢停突变体1DNA 聚合酶3 种klenow 片段聚合酶I 活性53聚合活性35外切活性53外切活性聚合酶：主要的复制酶聚合酶活性 第三节 复制的基本模式 1. 型2. 滚环式3. D 型第四节 复制过程 一、复制的起始三、回环模型在oriC 和ori上起始涉及相同的反应阶段 oriC ori Ori 的识别和解链 DnaA O 解旋酶的结合和解链DnaB DnaB DnaC P RNA Pol RNA Pol 释放复合体 DnaJ？ DnaJ？ 四、线形末端的复制解决方法：1. 成环2. 末端冗余3. 腺病毒五、真核DNA 复制1DNA 聚合酶DNA 聚合酶 位置核核核核线粒体功能引发延伸修复，合成修复复制酶活性Pol I 3-5外切核酸酶3-5外切核酸酶3-5外切核酸酶2.SV40DNA 复制(1)RNA 引发，起始DNA 合成(2)DNA延伸功能 E.coli SV40 起始蛋白 DNA A T 螺旋酶 DNA B T 引发 DNA G Pol 聚合 Pol III Pol 外切酶活性 Pol III Pol I 滑动钳 Pol III PCNA 单链结合蛋白 SSB RPA 3.端粒酶端粒 TTGGGG 富含TG 结构，不同生物重复次数不同端粒酶性质真核生物复制过程中的核小体结构亲本八聚体全保留装配图示详见武汉大学出版社分子生物学第91 页。图723 新产生的组蛋白八聚体装配的三种模式图724 亲代组蛋白八聚体和新合成的组蛋白八聚体与DNA 结合的可能方式，是正确的。第五章转录第一节 原核生物的转录 一、转录的一般概念1转录是不对称的模板链/非模板链；有义链/无义链；正链/负链；编码链。病毒的分类：(1)RNA 病毒:RNAmRNA(链病毒)； RNA互补RNA翻译(链病毒)。(2)DNA 病毒2DDRP 35；3 4pppA；pppG 5RNApol 忠实性6转录泡二、RNA 聚合酶holoenzyme:起始因子，核心酶真核生物三种RNA 聚合酶的特点RNA Pol 位置产物相对活性对-鹅膏蕈的敏感性Pol 核仁 28S，18S，5.8S rRNAs 5070 不敏感Pol 核质 hnRNA，mRNA，某些snRNAs 2040 高度敏感Pol 核质 tRNA，5S rRNA，某些snRNAs 10 片段