医学生物化学实验指导-第一章.doc

第一章 实验基本操作一、要求1熟悉实验室规则及常用生化仪器2清点洗刷实验用具。3掌握各种仪器的正规操作及维护二、常用生化仪器 烧杯试管刻度吸量管离心管滴管搅棒枪式移液器及其配适吸头混匀器恒温水浴箱离心机分光光度计，电泳仪点收仪器；根据仪器清单，逐项查点是否完好(如有缺损向教师声明及时补充更换)。本套仪器由本人使用保管至全部实验课程结束。三、基本操作1玻璃仪器的洗涤(1)洗涤液：洗洁精，肥皂水，洗衣粉。玻璃仪器专用洗涤液：主要成份为中性稀氯氧化剂，上海日化研究所出品(2)洗涤的要求与步骤：要求：洁净的玻璃器皿表面应不挂任何水滴。步骤： 不净的器皿 洗衣粉或肥皂水刷洗 自来水冲净达到要求？ 是 浸入洗液(数小时至过夜) 自来水冲净 蒸馏水涮洗23次(其目的是去除自来水中的杂质，故应少量多次，全面充分)烤干或晾干、备用 对使用过的仪器应养成及时清洗的习惯，特别是血液分析时用以吸取血液样本的吸管，用过后应当立即用水将所沾的血液冲去，否则放置过久，血液干燥硬结，就很不容易清除。 (3)玻璃仪器的干燥 一般的玻璃仪器均可洗净后倒置架上，让其水分蒸发自然干燥，如需迅速干燥者应按仪器的不同类型按下述不同方法处理： 试管、离心管、烧杯、烧瓶等普通玻璃器皿可置烤箱中100105烘烤 少量仪器如需急用也可在电炉上或酒精灯上烘烤。烘烤时应将器皿时时转动，务使受热缓慢且均匀，并将管口(或杯口)倾斜向下，以便水蒸气冷凝成水滴，顺口流出，不致使水滴接触烘热了的器壁而使仪器爆裂。 使用电吹风干燥一般玻璃仪器也很便利常用。 下列玻璃仪器应避免烘烤：吸管：容易造成器壁变形而致容量不准。比色杯：易在烘烤时发生破裂。2移液操作(1)吸量管的使用吸量管的选择：在一次完成转移的前提下，应选用容量较小的吸量管。对于同一次实验中同一种试剂的移取，应选用同一支吸量管操作(见图11) 用洗耳球将液体吸至超过标线移开洗耳球，迅速用食指压紧管口必要时将管尖端外围拭净调液面至标线放开食指，使液体流入容器将最后液滴沿器壁而下或吹出读数(见图12)吸量管保持垂直视线与液面应水平管中液面与刻度线应呈切线注：对于刻度由上至下的吸量管应尽量使用上端刻度管尖残液是否需吹出，看清标记。弯(2)枪式移液器的使用抢式移液器的结构(见图3) 1. 液体吸放钮2体积选取钮3. 体积、显示4枪头排放钮5. 枪头排放器6枪头接嘴其内部柱塞分2段行程，第1档为吸液，第2档为放液，手感十分清楚。操作(见图14)调体积选取钮至所需值套上枪头，旋紧垂直持握枪式移液器外壳，按下大拇指至第1档将枪头插入溶液，徐徐松开大拇指，使其复原排放时，重新将大拇指按下，至第1档后，继续按至第2档以排空注：移取过程中应控制速度，力度如需移取另一样品，按枪头排放钮，更换枪头3混匀(1)旋转法：手持容器，使溶液作离心旋转(2)指弹法：一手执试管上端，另一手轻弹试管下部，：使其中液体作涡旋运动。(3)搅动法：使用玻璃棒搅边；多用于溶解烧杯中的固体。(4)混匀器法：将试管置于混匀器的振动盘上，逐渐用力下压，使内容物旋转。(5)倒转混匀：适用于具塞的容器，如容量瓶、具塞量筒及具塞离心管等。操作时，将容器反复倒转。试管内的液量太多，也可利用倒转混匀法，外面包以玻璃纸塞住管口，然后用手指按住橡皮塞将试管反复倒转，溶液即可充分混匀。(6)吸管混匀法：用吸管将溶液反复吸吹数次，以达到混匀的目的。4加热与保温(1)加热(2)保温使用恒温水浴箱，调节温度设定钮至需要的温度。水浴箱中水要足量。实验过程中应随时监测温度，并及时调节。5离心(1)离心沉淀法：当颗粒小而不均一，沉淀粘稠或容积小又需精确定量时，往往采用离心沉降法。(2)离心前检查：取出所有套管，起动空载的离心机，看是否转动平稳。检查套管有无软垫，是否完好，内部有无异物。离心管与套管是否匹配。 (3)平衡： 将一对离心管放入套管，置于天平两侧，用滴管较轻一侧的离心管与套管之间加水至两侧平衡(离心管及其内溶液量不能差别过大) (4)离心： 将等重的两管置于离心机中的对称位置，调转速调节钮，逐渐增加转速至所需值，计时，离心结束后，将套管中的水倒净，所有套管放回离心机中。 四、血液样品的制备： 1采取血液样品的注意事项： (1)空腹采血： 血液中不少化学成份可受饮食影响，一般需在早晨空腹或禁食6小时以上采取血液。 (2)防止酶的分解作用： 血液内若干化学成份在离体后继续分解。如血糖被红细胞糖酵解酶系统分解而降低；为防止酶分解作用可用氟化钠、碘乙酸等保存剂，或将血液立即制成无蛋白血滤液。(3)防止溶血：红细胞与血浆中成分与含量皆有显著的差别，因此溶血可影响一些血清或血浆生化检验的结果。为防止溶血，抽血用具必须干燥清洁，避免剧烈振摇，防止污染。 2抗凝剂：根据所测定血液成份不同，标本可应用血清、血浆或全血。若需血浆或全血应加抗凝剂。 (1)草酸钾 为最常用的抗凝剂，02m8可使1nd血液不凝固。它与血液内钙离子形成草酸钙使血液不再凝固，但不能用于钾、钙测定。(2)草酸钾一草酸铵混合剂(3：2) 铵盐使红细胞膨胀，钾盐使之皱缩，故两者混合能保持红细胞体积不变。(3)柠檬酸盐 与钙离子混合成可溶性钠络合物，从而防止血液凝固。比草酸钾较少产生溶血，故用于红细胞沉降率测定及输血。但抗凝能力较弱，一般不作生化检验抗凝剂用。(4)氟化钠 有弱抗凝作用，但能抑制糖酵解和一些水解酶类。草酸钾-氟化钠(3：1)、氟化钠-麝香草酚(10：1)是测定血糖、尿酸、肌酐、无机磷等的良好抗凝剂。(5)肝素 能抑制凝血酶原转化为凝血酶而抗凝血。抗凝能力强，0102mg或20单位可使1m1血液不凝固，且较少产生溶血。五、实验预习，实验记录，实验报告1实验预习实验前应认真预习，弄清实验目的、原理、操作概要、各步操作的意义及注意事项。2实验记录准备一个记录本，在实验时记录实验现象、实验结果和实验数据。3. 实验报告每个同学均应准备一个练习本，以备实验结束后及时整理和总结实验结果，写出实验报告：实验报告应包括以下项目：(1)实验名称(2)目的和要求(3)原理(简述实验的基本原理)(4)操作(可以采用流程图的方式或以表格方式表示)(5)结果与讨论 描述实验出现的现象和结果，分析它们所说明的问题，探讨实验成败的关键。阐述对实验设计的改进意见等。对于定量实验列出算式进行计算并对实验结果进行必要的说明和分析。(6)思考题(徐 洪)第二章 生物化学实验常用方法第一节分光光度法 光线的本质是一种电磁波，有与电磁波和X线类同的性质。光线有不同的波长，肉眼可见彩色光称之可见光，波长范围在400750nm，小于400nm的光线称为紫外线，大于750nm的光线称之红外线。如图所示(表21) 当光线通过透明溶液介质时，其幅射能量有部分被溶液吸收，一部分透过，所以光线射出溶液介质之后光能被减少。对溶液来说，溶液呈现不同的颜色，是由于溶液中的质点(分子或离子)选择性地吸收某种颜色的光所引起的。如果各种颜色的透过程度相同，这种物质就是无色透明的，若只让一部分波长的光透过，其它波长的光被吸收，则溶液就呈现出透过光的颜色，并与被吸收的光的颜色完全互补。任何一种溶液，对不同波长的光的吸收程度是不相等的，一些有色物质可以选择性地吸收一部分可见光区的光的能量而呈现不同颜色，一些物质却能特征性地选择吸收紫外线的能量。物质吸收由光源发出的某些波长的光可形成特定的吸收光谱。由于物质的吸收光谱与物质的分子结构有关，而且在一定条件下其吸收程度与该物质的浓度成正比，所以可利用物质的特定吸收光谱对其进行定性和定量分析。分光光度法是利用各种物质所具有的这种吸收特征所建立起来的分析方法。 一、分光光度分析法的基本定律 劳伯比尔定律(Lambert-Beerlaw)是讨论吸收光能与溶液浓度和溶质层厚度之间关系的基本定律，是分光分析的理论基础。 劳伯比尔定律适用于可见光、紫外光、红外光和均匀非散射的液体 (一) Lambert氏定律 一束单色光通过透明溶液介质时，光能被吸收一部分，被吸收光能的量与溶液介质厚度有一定比例关系(见图21)。表达式为 这里I0为入射光强度 I为通过溶液介质后的光强度 L为溶液介质的径长(path length) k为吸光系数(absorption coefficient)(gcm-1) (二)Beer氏定律 以溶液介质浓度变化代替溶液介质厚度的改变，光能的吸收与浓度改变有类同的关系，即一束单色光通过溶液介质时，光能被溶液介质吸收一部分，吸收多少与溶液介质浓度有一定的比例关系。得出下式： 这里C(Concentration)为溶液介质的浓度(gL-1)将Lambent氏定律和Beer氏定律合并，即(1)和(2)合并为式中A(Absorbance)为吸光度 T(Transmittance)为透光度(4)式也可表达为 A=Cb.(5)式中(epsilon)称之摩尔吸光率(Molar absorptivity)(molL-1cm-1) C(concentration)浓度(molL) b(path length)溶液样品的长度cm(或比色皿内径长cm) (5)式为lambertBeer定律的物理表示式，其含义为一束单色光通过溶液介质后，光能被吸收一部分，吸收多少与溶液的浓度和厚度成正比。此式为分光分析法的基本计算式。 如果实验中溶液厚度b=lcm则A=C图22表明，在溶液介质厚度一定的情况下，吸光度(A)、透光度(T)和溶液介质浓度(C)之间的关系。摩尔吸光率()实际上是物质在单位浓变和单位厚度下对入射光的吸光度，在一定波长下，越大表示物质对光的吸收越强。二、定量的分光光度法分析许多对光有吸收的物质可以直接用分光光度法进行定量分析：一些对光，包括紫外、可见或近红外都无吸收的物质亦可通过和某些化学试剂作用而呈色，在一定的反应条件下和一定的浓度范围内，溶液颜色的深浅(对光吸收的程度)和该溶液中显色物质的浓度呈正比。(一)测定波长的选择 使用分光法测定溶液中物质的含量，首先要选择最适单色波长，因为只有以能被溶液吸收的光束作为入射光才能符合LambertBeer定律。测定有色物质时，不同颜色的待测溶液，则应选择不同波长的单色光束。在分光光度计上，单色光波长的选择原则一般是使被测溶液的单位浓度的吸光度变化最大，同时还要具有最小的空白及干扰读数，借以获得最高的灵敏度和正确性。最理想的办法是对每种物质的测定都应先傲它的光谱吸收曲线及有关干扰物的吸收曲线，根据这些光谱吸收曲线来选择最佳测定波长。表22可供波长选择的参考。(二)利用标准管计算测定物含量最适波长选定以后可进行溶液物质含量的测定。通常都采用对比测定法，即以巳知精确含量的待测物质的溶液作为参考标准物(Cs)和未知待测样品(Cx)用同一方法，在同一条件下、同时进行测定，读取标准物质的吸光度(As)和未知含量的样品吸光度(Ax)，由于标准物质和未知物质是同一物质，其摩尔吸光率(巨)相同和进行测定用的比色皿内径长(b)相同即bs=bx，根据A=Cb式，可得到 As=Cs 换算成下式 Ax=Cx 式中Cs是标准管中物质的实际含量，是标准液的浓度与实际用量的乘积；Cx是测定管中物质的实际含量。还应换写到法定单位mmolL、mgm1。(三)利用标准曲线进行换算配制一系列不同浓度的标准的溶液(至少五个)按测定管同样方法处理显色，在选定的波长分别测定各管的吸光度(A)，以吸光度为纵坐标，标准溶液的浓度(C)为横坐标，在方格坐标纸上作图，制作标准曲线。以后在同样条件下进行测定时，测定被测溶液的吸光度，从标准曲线上可找出相应的浓度。根据LambertBeer定律，标准液的浓度在一定范围内与吸光度呈直线关系，标准曲线是这种直线关系的描述，一般认为，标准曲线范围在测定物浓度的一半到二倍之间，并使吸光度在00510范围内为宜。 还须注意：曲线制作与测定管的测定应在同一仪器上进行，由于曲线的建立与实验室当时的条件如温度，湿度和气压及电压稳定性等有关，因此标准曲线常因各种变化而需校正或重做。(四)摩尔吸光率求取测定物浓度当浓度为1ML时，溶液厚度为1cm，吸光率用表示，在已知测定物的，则可根据下式求得测定物的物质浓度。此计算法常用于紫外吸收，如核苷酸溶液含量测定，如UTP在262nm具有最大吸收峰，利用已知UTP在262nm时的摩尔吸光率，读取待测UTP溶液吸光度A，即可求出该UTP浓度。二种以上被测物的混合液，也可利用不同进行定量测定。例如a，b两种物质在波长1时，摩尔吸光率分别为a1和b1：，在波长2时摩尔吸光率分别为a2和b2，a和b混合的溶液在1时吸光度为Al，在2时的吸光度为A2(图23)，各自浓度分别为Ca和Cb，则 如有三种以上成分的混合液，也可通过三种不同波长情况下的吸光度，以各自特有的值，依据三元一次方程，同样可求出未分离的三种混合物的各自浓度-三、物质的定性分析以不同波长的单色光作为入射光，测定某一溶液的吸光度，然后以入射光的不同波长为横轴，各相应的吸光度为纵轴作图，可得到溶液的吸收光谱曲线。吸收光谱曲线是物质的特征性曲线，它和分子结构有严格的对应关系故可作为定性分析的依据。不同的物质，分子结构不同，其吸收光谱曲线也有其特殊形状(图24)。在吸收光谱中，往往可以找到一个或几个吸收最大值，该处的波长称为最大吸收波长(入max)。物质不同，它们的波长(nm)最大吸收波长也往往不同，图14为维生素B12溶液的吸收光谱曲线。物质用分光分析定性主要依据吸收光谱存在的特征吸收。1比较吸收光谱曲线，在相同情况下，吸收光谱曲线不同，表明物质的化学结构不同，因为不同的物质有各自的特征性曲线。如ATP和GTP都属于核苷酸，它们的溶液在紫外光区均有吸收，但由于化学结构不很一样，它们的吸收光谱就有差别。需要注意的是在不同条件(如选择不同溶剂)下，即使是同一物质也可呈现不同的吸收光谱。2比较最大的吸收波长。不同的物质可有不同的最大吸收波长(kmax)。如ATP、GTP、CTP和UTP的max分别为259nm、253nm、271nm和262nm。Lnlax可作为物质定量测定的最适波长，此时测定灵敏度最高。有些物质化学结构相近，可产生相同的max，伹它们的吸收系数都不一致，可据此鉴别之。 3比较吸光度比值。可根据物质两个或几个不同波长的吸光度比值来鉴别不同的物质，同时也可检查物质的纯度。如DNA溶液kmax为260nm。在260nm的吸收度和在280nm的吸收度比值为18。但溶液中混进了蛋白质，则比值会降低(蛋白质在280nm处有最大吸收)。四、常用分光光度计及使用介绍(一)721型分光光度计 该机光谱范围在360800nm(可见光区)，该机灵敏度较高，而且结构简单，操作方便，可用于有色物质溶液的测定。1721型分光光度计光路图和外形图2使用方法； (1)开启电源，指示灯亮，选择开关置于“T”，波长调置测试用波长。仪器预热20分钟。(2)打开试样室盖(光门自动关闭)。调节“0”旋钮，使数字显示为“000”盖上试样室盖，将比色皿架处于蒸馏水校正位置，使光电管受光，调节透光率“100”旋钮，使数字显示为“100.0”。 (3)将选择开关置于“A”。调节消光零旋钮，使得数字显示为“000”，然后将被测样品移入光路，显示值即为被测样品的吸光度的值。(4)如果大幅度改变测试波长时，在调整“0”和“100”后稍等片刻，(因光能量变化急剧，光电管受光后响应缓慢，需一段光响应平衡时间)，当稳定后，重新调整“0”和100即可工作。(5)每台仪器所配套的比色皿，不能与其它仪器上的比色皿单个调换。(6)换一波长测试时，应将选择开关置“T”，重复(2)和(3)操作。(7)测试完毕，关闭开关，电源，将比色皿冲洗干净。 (三)UV754型紫外分光光度计1. UV754紫外分光光度计光路图：由光源发出的连续辐射光线，经滤光片和球面反射镜至单色器入射狭缝处聚焦成像，光束通过入射狭缝，经平面反射镜到准直镜，产生平行光射至光栅。在光栅上色散后，又经准直镜聚焦在出射狭缝上成一连续光谱，由出射狭缝射出定波长的单色光，通过标准溶液再照射到光电管上。光源切换与波长移动相对应 200nm-290nm需点亮氘灯290nm一360nm需同时点亮氘灯和钨灯360nm-850nm需点亮钨灯单色器采用自准式系统，衍射光栅使用该厂自制1200条nm的复制闪跃光栅2测试准备(1)打开电源开关之前，检查一下测试样品室。(2)试样槽置“参考”位置。(3)打开电源开关。如果波长工作在200nm一300nm时需按氘灯触发按钮。(4)显示器显示754”后，数显为“1000”，则表明仪器已通过自检程序。此时按AC键，仪器自动进入“0000吸光值状态，测试“连续”及“自动”打印状态；(5)仪器预热三十分钟。3测试(1)数显“0000稳定后，即可把试样槽置于“样品”位置进行测试(即拉一下样品室滑杆)。待第一个数据自动打印完毕后，再可将试样槽置于第二个“样品”位置测试(即再拉一下样品室滑杆)。(2)每当需要调换波长时，必须把试样槽置于“参考”位置，重新调零，现将测试操作顺序如下： 注意：样品号超过99号，打印数复位至00继续计数下去。(四)分光光度计和紫外分光光度计使用注意事项1光度计的光电管或光电池对不同浓度的光敏度不一样，应注意每换一次波长，即应将空白溶液的吸光度调整到0。2溶液定量测定，应注意吸光度在00510范围，浓度太大时应该适当稀释。3一般灵敏度旋钮调置“1”档，因其放大倍率最小，较稳定。(五)双波长分光光度计为了消除背景吸收的影响，提高测定的精确度，可采用双波长分光光度法，仪器图示如下：由图25可见，从光源发出的光分成两束，分别经过各自的单色器后，分出具有任意波长l和2的两束单色光，由切光器(斩波器或称扇面镜)调制l和2，以一定间隔交替照射装有供试品溶液的比色皿，然后测量和记录它们之间吸收度的差值。双波长分光光度法是通过选择二个适当的波长经过斩波器或扇面镜，使两个波长分别交替在照射于同一供试品液，测量二个波长处的吸收度之差A(A=A2A1)，来消除不相关吸收的方法。双波长分光光度法由于采用一个比色皿和两道不同波长的光束进行测量，因而不用参比比色皿，而只用一个比色皿进行测量，所以能避免由于比色皿及样品溶液和参比溶液之间的差别等因素所引起的误差，从而可提高测定的精确度。(六)荧光分光光度计 1荧光分光光度计种类很多，一般均由激发光源、激发单色器、样品皿和检测器四部分组成。(1)光源 主要用于激发荧光物质产生激发光，通常有汞灯和氙弧灯。对光源的要求是能够产生高强度的，不随波长变化的连续的光谱。汞灯提供线性光谱，由于光强度随波长有很大的变化，作为激发光源有一定的局限性，仅适用于滤光片的荧光计的光源，氙弧灯内有氢气，通电后氙气电离，同时产生很强的光源，并提供250600nm的连续光谱，最高峰值在470nm，适用于记录光谱图。(2)单色器 采用滤色片作单色器的光电荧光计通常有两个滤光片。处于光源和样品池之间的单色器叫激发单色器；用于选定不同的激发波长，满足不同溶液的需要。处于样品池与检测器之间的单色器叫发射滤光片，用于滤去样品池里物质受激发后所产生的不同波长的可见光。若用滤光片代替两个单色器，这样的仪器称为荧光光度计或光电荧光计，这类仪器虽然结构简单，价格低廉，但是灵敏度低特异性差。若采用棱镜或光栅作单色器，这类仪器称为荧光分光光度计，但是光栅色散后谱线的波长读数是线性的，并且分辨率相同时，光栅色散后得到谱线强度高于棱镜，灵敏度高。(3)样品皿 大多由石英制成，某些仪器为了测定低温荧光，在石英皿的外周套上一个装有液氮的透明石英真空瓶以降低温度。(4)检测器 大多数荧光分光光度计采用光电倍增管作检测器。以后的信号处理和显示部件与一般的可见分光计类同。2荧光分析的应用分子荧光光谱具有灵敏度高、选择好、操作快速等优点。可适用于生物体内微量的有机物和体内代谢产物的监测与定量。无机物很少能发出荧光，无机物的荧光分析依赖于待测元素与有机物形成配合物，具有荧光的配合物可用于荧光分析，能进行荧光分析的元素现已达几十种。此外荧光光谱法还有测定葡萄糖、胆红素、叶胆原、胆汁酸和某些激素，甚至还可借助于酶的人工底物产生的荧光测定酶的活性。(程枫)第二节电泳法带电粒子在电场中向与自身带相反电荷的电极移动的现象称为电泳(Electrophoresis)，电泳技术是生物化学与分于生物学中的重要研究方法之一。利用电泳技术可分离许多生物物质，包括氨基酸、多肽、蛋白质、脂类、核苷、核苷酸及核酸等，并可用于分析物质的纯度和分子量的测定等。电泳按介质状想来分，有自由电泳和区带电泳两大类。前者以溶液为介质，在溶液中将蛋白质分离开来。两者相比较，自由电泳过程中扩散严重，分辨率有限，而且设备昂贵，操作繁琐，现在已基本上被区带电泳法所取代。所谓区带电泳法，就是在固体支持物上所进行的电泳。50年代以来，常用的固体支持物有滤纸、醋酸纤维薄膜、淀粉凝胶、琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶等等。区带电泳法分辨率很高，而且设备简单，操作方便，已经是生物化学及分子生物学领域中极为有用的技术。 一、电泳法的基本原理在酸性溶液中，蛋白质分子带正电，而在碱性溶液中，蛋白质分子带负电。伹是这并不是实际的电动单位，从物理化学的原理来分析，带电分子的周围由相反电荷的离子形成扩散双电层，它由紧密层和扩散层两部分构成。紧密层中相反电荷的离子被束缚在大分子周围，它在电场中是随大分于一起泳动的，而扩散层中相反电荷的离子虽然也受到大分子的静电引力，但在电场中却会向另一极移动。紧密层表面相对于溶液本体的电位差称之为电动电位即(Zeta)电位，由它决定了蛋白质分子在电场中的运动速度。蛋白质泳动分子在电场中受到电动力F的驱动，其大小等于净电荷Q和电场强度E的乘积： F=QE如果假设泳动分于为球体，它在电场中泳动时也受到一定的阻力F，按Stoke定律，其大小与球体半径r，介质粒度刁以及泳动速度成正比： F=6rv当恒速泳动时，电动力F与阻力F相等，即QE=6rv 带电粒子在单位电场强度下的泳动速度，称为迁移率(mobility)或泳动度，以表示，即：所以可见，一个带电粒子的迁移率不仅取决于其本身所带的电荷，还与带电粒子的大小、介质的粘度等多种因素有关。在具体实验中，式中：v为粒子的泳动速度(厘米秒或分)，E为电场强度或电势梯度(伏厘米)，d为粒子移动距离(厘米)，l为支持物的有效长度(厘米)，u为加在支持物两端的实际电压(伏)，1为通电时间(秒或分)。故迁移率(或泳动度)的单位为厘米2秒-1伏特-1。假设物质1和物质2在同一电场中移动距离分别为：经过时间t之后，两物质(带电粒于)移动的距离之差力： 这就是说，物质1和2能否分离开来，取决于两者的迁移率。若它们的迁移率相同则不能分离，有差别才能分离，差别越大，分离越好。当然，也与其它实验条件有关。二、影响电泳的因素电泳结果可受到多种因素的影响，但通常认为以下4个方面更为重要。(一)电泳介质的pH当氨基酸为被分离物质时，各种氨基酸有不同的等电点，当介质的pH等于某氨基酸的等电点时，则该氨基酸处于等电状态，即不向正极或负极移动，当介质pH小于等电点时，氨基酸呈阳离子状态、向负极移动，反之当介质pH大于等电点时，氨基酸呈阴离子状态，向正极移动。当20种氨基酸的混合物置于pH55左右的介质中电泳时，可以将它们分离为三组。蛋白质由氨基酸组成，也具有两性电离性质，所以介质的pH值也影响蛋白质的电离情况，即决定蛋白质的带电量(Q)。为了保持介质pH的稳定性，常用一定pH的缓冲液，如分离血清蛋白质常用pH86的巴比妥缓冲液或三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液。(二)缓冲液的离子强度离子强度如果过低缓冲液的缓冲容量小，不易维持pH恒定；离子强度过高，则降低蛋白质的带电量(压缩双电层降低Zeta电势)，使电泳速度减慢，所以常用离子强度为00202之间。溶液中离子强度的计算方法如下： Ci=离子的摩尔浓度 Zi=离子的价数例1，两个单价离子化合物(如NaCl)的离子强度等于它的摩尔浓度，如0154molL NaCI溶液的离子强度例2，两个两介离子化合物(如ZnSO4)的离子强度等于它的摩尔浓度的4倍，如01molL ZnSO4溶液的离子强度 由上述例子中可以看出多价离子会使离子强度增高，所以电泳缓冲液常用单价离子的化合物配制。(三)电场强度实验所用电场强度对移动距离起正比作用。电场强度以每一厘米的电势差计算，也称电势梯度。以滤纸电泳为例，滤纸长15厘米，西端电势差为150伏特，则电场强度为10伏特厘米。电场强度愈高，则带电粒子的移动愈快。伹电压愈高，电流也随之增高，产生的热量也增加。所以在高压电泳(电场强度大于50伏特厘米)常需加用冷却装置，否则热量可引起蛋白质等物质的变性而不能分离，还因发热引起缓冲液中水分蒸发过多，使支持物(滤纸、薄膜或凝胶等)上离于强度增加，以及引起虹吸现象(电泳缸内液体被吸到支持物上)等，都会影响物质的分离。(四)电渗在电场中，液体对于固体的固定相的相对移动，称为电渗（图2-6）。如滤纸中含有羟基而带负电荷，与纸相接触的水溶液带正电荷，液体便向负极移动。由于电渗现象往往与电泳同时存在，所以带电粒子的移动距离也受电渗影响，如电泳方向与电渗相反，则实际电泳的距离等于电泳距离减去电渗的距离。如方向相同，则实际电泳距离等于电泳距离加上电渗的距离。琼脂中含有琼脂果胶(agaropetin)，其中含有较多的硫酸根，所以在琼脂电泳时电渗现象很明显，许多球蛋白均向负极移动。除去了琼脂果胶后的琼脂糖用作凝胶电泳时，电渗大为减弱。电渗所造成的移动距离可用不带电的有色染料或有色葡聚糖点在支持物的中心，以观察电渗的方向和距离。三、区带电泳的分类区带电泳的形式繁多，分类比较困难，仅按某一特点分类似乎都不全面。这里基于支持物的物理性状、装置形式、pH值的连续性等不同，可分为：(一)按支持物的物理性状不同，区带电泳可分为1滤纸及其他纤维(如醋酸纤维纱、玻璃纤维、聚氯乙烯纤维)薄膜电泳。2粉末电泳，如纤维素粉、淀粉、玻璃粉电泳。3凝胶电泳，如琼脂、琼脂糖、硅胶、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶电泳。4丝线电泳，如尼龙丝、人造丝电泳。(二)按支持物的装置形式不同，区带电泳可分为1平板式电泳，支持物水平放置，是最常用的电泳方式。2垂直板式电泳，板状支持物，在电泳时，按垂直方向进行，聚丙烯酰胺凝胶常做成垂直板式电泳。3连续液动电泳，首先应用于纸电泳，将滤纸垂直竖立，两边各放一电极，溶液自顶端向下流，与电泳方向垂直，以后有用淀粉、纤维素粉、玻璃粉等代替滤纸分离血清蛋白质，分离量较大。4圆盘电泳(disc electrophoresis)。电泳支持物灌制在两通的玻璃管中，被分离的物质在其中泳动后，区带呈圆盘状。如果用石英玻璃制成内径为25或50um、长50100cm的管状，则成为目前认为比较先进的毛细管电泳技术，若管中注入聚丙烯酰胺凝胶(特殊技术)，也是区带电泳的一种。它集电泳与分析检测系统于一身。因管细、散热快，电压可达2-3万伏，故具有量微、快速、重复性好、分辨率高及可自动化等优点，但价格很高。(三)按pH的连续性不同，区带电泳可分为1连续pH电泳，即整个电泳过程中pH保持不变，常用的纸电泳，醋酸纤维薄膜电泳等属于此类。2. 非连续pH电泳，缓冲液和电泳支持物间有不同的pH，如聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳分离血清蛋白质时常用这种形式，它的优点易在不同pH区之间形成高的电位梯度区，使蛋白质移动加速压缩为一极狭的区带而达到浓缩的作用。但聚丙烯酰胺凝胶电泳分离核酸则采取连续pH装置。 近年来发明的等电聚焦电泳(Electrofocusing)可称为非连续pH电泳，它利用人工合成的两性电解质(商品名ampholin，一类脂肪族多胺基多羧基化合物)在通电后形成一定的pH梯度。被分离的蛋白质停留在各自的等电点而形成分离的区带，电极两端，一端是酸，另一端是碱。等速电泳Isotachophoresis)也是属于非连续pH电泳，它的原理是将分离物质夹在先行离子和随后离子之间，通电后被分主物质的电泳速度相同，所以叫等速电泳。近年发明的塑料细管等速电泳仪，可以进行毫微克量物质的分离，该仪器采用数千伏的高电压，几分钟内即完成分离，用自动记录仪进行检测，它的出现是电泳技术的革新。四、电泳技术的应用电泳技术主要用于分离各种有机物(如氨基酸、多肽、蛋白质、酶、脂类、核苷、核苷酸、核酸等)和无机盐。也可用于分析某种物质纯度，还可用于分子量的测定。电泳技术与其他分离技术(如层析法)结合，可用于蛋白质结构的分析，“指纹法”就是电泳法与层析法的结合产物。用免疫原理测试电泳结果。提高了对蛋白质的鉴别能力。电泳与酶学技术结合发现了同功酶，对于酶的催化和调节功能有了更深入的了解，所以电泳技术是医学科学中的重要研究技术。下面介绍几个在生化实验工作中常用的电泳技术。(一)纸电泳：是以滤纸为支持物来进行电泳，它常与其它层析方法配合使用，以提高分析效果，纸电泳一般用于物质分离分析、测定等电点、鉴别颗粒电荷的符号和判断样品的纯度等方面。由于纸电泳具有设备简单，化费少以及操作方便等优点，所以目前仍为实验室常用电泳技术之一。然而，纸电泳所用滤纸有较大的吸附力和电渗作用，使样品颗粒泳动易受影响，所以不适用于进行测定迁移率。(二)醋酸纤维素膜电泳。醋酸纤维素是Kohn(1975)首先用于区带电泳，它是由高纯度的醋酸纤维素制成的一种细密而又薄的微孔膜。醋酸纤维素膜电泳的原理基本上和纸电泳原理相同，但由于作为支持物的醋酸纤维素膜对样品的吸附性较滤纸小得多，因此，少量的样品，甚至大分子物质都能得以较高的分辨率。又由于醋酸纤维素亲水性较小，故而电渗作用较纸小，并且它所容纳的缓冲液也较少，因此电泳的大部分由样品传导，可以加速样品分离，大大节约电泳时间。 虽然醋酸纤维素膜电泳的分辨能力比聚丙烯酰胺凝胶电泳和淀粉胶电泳等要低，但它具有简单、快速、定量容易等优点，尤其较纸电泳分辨力强、区带清晰、灵敏度高和便于保存、照相等，所以醋酸纤维素膜电泳已取代纸电泳而被广泛应用于科学实验、生化产品分析和临床化验，如血清蛋白、血红蛋白、脂蛋白、同工酶等的分离分析，也用于免疫电泳层析技术上。 (三)琼脂糖电泳 琼脂糖电泳是一种以琼脂糖凝胶为支持物的凝胶电泳，其分析原理与其它支持物电泳的最主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。琼脂糖凝胶具有网络结构，直接参与带电颗粒的分离过程，在电泳中，物质分子通过空隙时会受到阻力，大分子物质在泳动时受到的阻力比小分子大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅依赖于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大地提高了分辨能力。 琼脂糖凝胶通常制成板状，凝胶浓度以081为宜，因为此浓度制成的凝胶富有弹性，坚固而不脆，但是在制备过程中应避免长时间加热。 电泳缓冲液的pH多在6-9之间，离子强度最适为002-005。离子强度过高时，将有大量电流通过凝胶，使凝胶中水份大量蒸发，甚至造成凝胶干裂，电泳中应加以避免。 由于琼脂糖电泳具有较高分辨率、重复性好，区带易染色、洗脱和定量以及干膜可以长期保存等优点，所以常用于大分于物质如蛋白费等的分离分析；与免疫化学反应相结合发展成为免疫电泳技术，用于分离和检测抗原。若对目前常用的琼脂糖进行某些修饰，如引入化学基团羟乙基，则可使琼脂糖在6512左右便能熔化，被称为低熔点琼脂糖。该温度低于DNA的熔点，而且凝胶强度又无明显改变。以此为支持物进行电泳，称为低熔点琼脂糖凝胶电泳，主要用于DNA研究。如在分子生物学实验中，用来回收或制备DNA。(四)聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegeldectrophoresis，PAGE) 聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的凝胶，具有机械强度好、弹性大、透明、化学稳定性高、无电渗作用、设备简单、样品量小(1100微克)、分辨率高等优点，并可通过控制单体浓度或单体与交联剂的比例聚合成不同大小孔径的凝胶，可用于蛋白质，核酸等分子大小不同的物质的分离、定性和定量分析。还可结合解离剂十二烷基硫酸钠(SDS)，以测定蛋白质亚基分子量。 聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理1丙烯酰胺的聚合 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(Act)与交联剂甲撑双烯酰胺(Bis)在催化剂作用下，经过聚合交联形成含有亲水性酰胺基侧链的脂肪族长链，相邻的西个链通过甲撑桥交链起来的三维网状结构的凝胶。2聚丙烯酰胺凝胶孔径的大小 决定凝胶孔径的大小主要是凝胶的浓度，例如75的凝胶孔径平均为50A，30的为20A左右。但交联剂对电泳泳动率亦有影响，交联剂重量对总单体重量的百分比愈大，则电泳泳动率愈小。不管交联剂是以何种方式影响电泳时的泳动率，总之它是影响凝胶孔径很重要的一个参数，为了使试验的重复性较高，在制备凝胶时对交联剂的浓度、交联剂与丙烯酰胺的比例、催化剂的浓度、聚胶所需时间这些影响泳动率的因子都应尽可能保持恒定。 要想将一个蛋白质或核酸之类的大分子混合物很好地分开，并在胶柱上形成明显的带，选择一定孔径的凝胶是很关键的。实用中，常按样品的分子量大小来选择适宜的凝胶孔径。 3缓冲系统 目前常用的分离胶缓冲系统有三大类：高pH(pH9左右)、低pH(pH4左右)和中性。选择的pH应使蛋白质分子处于最大电荷状态，使样品中各种蛋白质分子表现出泳动率的差别最大。酸性蛋白质在高pH条件下，碱性蛋白质在低pH条件下常得到较好的解离，电泳分离效果较好。假若蛋白质样品经电泳后还希望保留生物活性，则pH值不应过大或过小大于9或小于4)。 在考虑离子种类和离子强度时，原则上只要有导电离子存在的任何溶剂就能用于电泳，但要避免因离子种类和离子强度选择不当使样品中各蛋白质分于之间相互作用而造成人为假象。常选用00101molL低离子强度的缓冲液。离子强度低，从而电导低，低电导能产生高电压梯度，电泳分离过程短，产生热量较小，分离效果好。 4聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳 这里主要简单介绍不连续盘状电泳的基本原理。不连续盘状电泳有较高的分辨力，这里因力有三种效应：浓缩效应，在样品胶和浓缩胶中进行(如不用样品胶，则在浓缩胶中进行)；电荷效应和分子筛效应在分离胶中进行。(1)浓缩效应：管中置三种不同的凝胶层，即上层为样品胶，第二层为浓缩胶，这两层均为大孔胶、TrisHCl缓冲液、pH值67，第三层为分离胶，该层为小孔胶、TrisHCl缓冲液、pH值89。在上下两电泳槽中充以Tris甘氨酸缓冲液，pH值83。这样造成凝胶孔径、pH值、缓冲液的不连续性。在此条件下，HCl几乎全部电离为C1-，甘氨酸有极少部分的分子解离成NH2CH2COO-，一般酸性蛋白质也能解离带负电荷。当电泳系统通电后这三种离子都向正极移动，根据有效泳动率的大小，最快的称为快离于或先行离子(这里是Cl-)，最慢的称为慢离子或随后离子(这里是NH2CH2COO-)。电泳开始后，快离子在前，在它的后边形成一离子浓度低的区域即低电导区。电导与电压梯度成反比，所以低电导区就有了较高的电压梯度。这种高电压梯度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动。在快离孑和慢离子的移动速度相等的稳定状态建立后，则在快离于和慢离子之间造成一个不断向阳极移动的界面。由于蛋白质的有效泳动率恰好介于快、慢离子之间，因此蛋白质样品被夹在当中浓缩成一狭窄层。这种浓缩效应可使蛋白质浓缩数百倍。 (2)电荷效应：蛋白质样品在界面处被浓缩成一狭窄的高浓度蛋白质区，但由于每种蛋白质分于所载有效电荷不同，因而泳动率也不同，因此各种蛋白质就按泳动率快慢顺序排列成一个一个的圆盘区带。在进入分离胶时，电荷效应仍起作用。 (3)分子筛效应：当被浓缩的蛋白质样品从浓缩胶进入分离胶时，pH值和凝胶孔径突然改变，选择分离胶的pH值89(电泳时实际测量是95)使接近甘氨酸的pKa值(9798)，这样慢离子的解离度增大，因而它的有效泳动率也增加。此时慢离子的有效泳动率超过所有蛋白质的有效泳动率。这样，高电压梯度不存在了，各种蛋白质仅仅由于其分子量或构象的不同，在一个均一的电压梯度和pH条件下通过一定孔径的分离胶时所受摩擦力不同、受阻滞的程度不同，表现的泳动率不同而被分开。 5SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 十二烷基硫酸钠(SDS)是阴离子型去污剂，当它的浓度在8X1041110VL以上时，1克蛋白质几乎能够恒定地与14克SDS结合。如前所述，蛋白质的迁移率同时与其电荷及大小有关，但由于蛋白质分子这时带有足够的负电荷，如果在聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，将由于分子筛效应，它们的迁移率仅取决于分子的大小，因此SDS凝胶电泳可以按蛋白质分子大小的不同将其分开。 蛋白质与SDS的结合，必须在蛋白质充分变性的状态下才能达到饱和，因此，这一过程是在巯基试剂(2琉基乙醇或二硫苏糖醇)存在时加热情况下进行的。例如，天然牛血清白蛋白或胰核糖核酸酶每克只能结合09克SDS，将其中的二硫键还原后，便增加到14克。糖蛋白中因为糖部分不能与SDS结合，总的结合率降低，迁移率变慢，会使测定的分子量偏高。这时，如果提高聚丙烯酰胺凝胶的浓度，突出其分子筛效应作电泳分析，则表现分子量可接近于真实分子量。 6聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳 蛋白质分子有一定的等电点，当它处在一个由阳极到阴极pH梯度逐渐增加的介质中，并通过以直流电时，它便“聚焦”在与其等电点相同的pH位置上。等电点不同的蛋白质泳动后形成位置不同的区带而得到分离。这种电泳方法便称为等电聚焦电泳。 这种方法具有很高的分辨率，可以区分等电点只有001pH单位差异的蛋白质，根据其所在位置还能够测定蛋白质的分子量。同时，对很稀的样品，最后达到高度的浓缩。所以，等电聚焦电泳也是一种得到广泛应用的方法。 这种方法的发展取决于pH梯度形成技术的开发。在电场中能够形成pH梯度的物质必须具有以下特性：(1)有足够的缓冲能力，样品存在时也能保持稳定的pH梯度；(2)有足够的电导能力，以使一定的电流能够通过，同时各处都应有相近的电导系数，避免局部地区过热，以及局部地区过大电位差的差异对pH梯度的影响；(3)是小分子的物质，电泳后易于除去；(4)化学组成与被分离的蛋白质物质不同，不干扰测定；(5)不会使蛋白质变性或与其发生副反应。60年代初期，Svesson通过系统研究，确定多电荷的两性电解质满足以上的条件，Vesterberg则进一步选择脂肪族多氨基多羟酸物物质作为介质，在电场中获得了理想的平滑pH梯度。这种物质的商品名称是Ampholine，它实际上是一系列不同等电点的脂肪族多氨基多羧基同系物及异构物的混合物。它是由不饱和酸(例如丙烯酸)与多乙烯多胺加成后产生的，反应式概括如下： 式中Rl及R2是氢或者是带有氨基的脂肪基。由于合成物的不同分子氨基和羧基的比例不同，从而形成连续的等电点。通常的范围有pH310之间。 等电聚焦电泳可以在液体介质中进行，适宜作大量制备用，每个区带能够聚焦2080毫克左右的蛋白质。以聚丙烯酰胺凝胶为介质时，设备简单，操作易行，适宜于小量分离及分析。 (五)双向电泳提高电泳分辨率的方法 1975年，OFarrell发展了双向电泳技术，其第一向采用聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳，第二向采用SDS凝胶电泳。由于结合了蛋白质的等电点和分子量两种完全不同的特性来进行分离，因此具有非常高的分辨率。从大肠杆菌溶物中可分析出近1,100种蛋白质或肽链组分，甚至可以判断出一个基团的变异。双向电泳是鉴别蛋白质一项很有力的手段。 胶板可以用考马斯亮蓝染色，检出的最低限量为031微克斑点。也可以用银染法，检出最低量为25纳克斑点。银离子能与蛋白质的巯基及羧基等基团作用，经还原后显出黑色斑点。为了进一步提高灵敏度，还可应用放射性氨基酸(如35S甲硫氨酸)作体内掺入，使所有的蛋白质斑点都带有放射性标记，在x射线底片上曝光后，获得电泳图谱。(陆劲松)第三节层析法 在一定的温度下，同一化学物质在不相混溶的两种介匝间分布达平街时该物质在这两种介质中的浓度比是一常数称分配系数。不同化学物质的分配系数不同。层析法即利用混合物中各组分的分配系数不同而崖其分离的方法。其两种介质，一为固定不动，称固定相，另一为可相对流动，称流动相。 层析法已广泛应用在生物化学领域中，无论是少量分析还是大量制备，都能体现出它的高效性，简便性等特点。在实脸室中的常用层析法有：凝胶过滤，纸层析薄层层析，离子交换层析，亲和层析，高效液相