real time PCR 操作手册.docVIP

Real-time PCR 检测(protocol)实验流程描述：收集生长状态良好的目的细胞，提取RNA，并反转录成cDNA采用real time PCR 方法检测目的基因的表达情况。实验材料：1主要试剂REAGENTSCOMPANYCat.No.TrizolInvitrogen15596-026M-MLV逆转录酶promega M1705dNTPspromegaU1240oligo dT上海生工B0205Rnase InhibitorpromegaN2115Primer(R&F)上海吉凯SYBR Master MixtureTAKARADRR041B2 主要仪器EQUIPMENTSCOMPANYCat.NoNanodrop 分光光度计Thermo2000/2000C稳压电泳仪上海天能Real time PCR 仪器TAKARA 公司TP800实验步骤：1 总RNA 抽提（根据Invitrogen 公司的Trizol 操作说明书进行）1) 收集细胞，2000rpm 离心5min，去上清，细胞沉淀中加入1ml Trizol，充分混匀后室温静置5min，然后转移至新的1.5 ml EP 管中；2) 每管加入200 l 氯仿，用手上下颠倒eppendorf 管15s，室温静置10min；3) 4，12800 rpm，离心10min；4) 吸取上层液体移至新的1.5 ml EP 管，加入等体积预冷的异丙醇，混匀后4静置10 min；5) 4，12800 rpm 离心10 min 后，弃上清；6) 加入1 ml 75%乙醇（用DEPC水新鲜配制），洗涤沉淀；7) 4，11800 rpm 离心5 min，弃去大部分上清；8) 4，11800 rpm 离心5 min，弃去上清；室温干燥；9) 待RNA 沉淀基本透明时，加入RNase-free 水（加入体积视RNA沉淀量而定）至完全溶解，Nanodrop 2000/2000C分光光度计分析测定所抽提RNA 的浓度及质量。2 RNA 逆转录获得cDNA（根据Promega 公司M-MLV 操作说明书进行）实验所需耗材均购自Axygen，具体步骤如下：1) 将1 l Oligo dT(0.5g/l) 和2.0 g Total RNA加入到PCR小管中，补充RNase-Free H2O至10ul；混匀后离心，70温浴10min；之后立即置于冰水混合物中冰浴，使Oligo dT 和模板退火；2) 按下表的比例配制反应体系（冰上进行），混匀，短暂离心；试剂每管加入量5RT buffer4 l10mMdNTPs2 lRnasin（40U/ul）0.4 lM-MLV-RTase（200U/ul）1 lRNase-Free H2O2.6 l注：dNTPs 是dATP , dCTP, dGTP, dTTP 的混合，浓度为10mM3) 上述体系在42水浴反应1h，然后在70水浴10min 使RT 酶失活；4) 将得到的RT 产物-cDNA 置于-80保存备用。3 Real-time PCR 检测1) 按下列比例配置反应体系：试剂每管加入量SYBR premix ex taq:10.0 l上游引物（2.5M）0.5l下游引物（2.5M）0.5lcDNA1