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Rho/Rho激酶与心血管疾病摘要：Rho蛋白是一种三磷酸鸟苷( GTP) 结合蛋白，Rho激酶( ROCK) 是最早发现的Rho效应物，Rho/ Rho 激酶信号通路是体内普遍存在的一条信号通路, 它通过调节细胞内肌动蛋白骨架的聚合状态而扮演着 分子开关 的角色, 参与细胞形态维持、细胞粘附与迁移、细胞增殖与凋亡、基因转录、平滑肌收缩等多种生物学行为。 研究发现，Rho /Rho激酶与心血管疾病有关，如冠状动脉粥样硬化性心脏病高血压心力衰竭等，其抑制剂可以治疗许多心血管疾病，目前已经在临床上应用该文对Rho /Rho激酶与心血管疾病关系予以综述。关键词:Rho /Rho激酶 心血管疾病 Rho激酶抑制剂Study on the Correlation between ho /ho Kinase and Cardiovascular DiseasesWANG HongleiAbstract: Rho protein is kind of GTP binding protein.Rho kinase (ROCK) is a Rho effector the earliest discovered. Rho/Rho-kinase signal ng pathway is a ubiquitous one in vivo. It plays a role of molecular switch by regulating the polymetic state of intracellular actin cytoskeleton and participates in the regulation of various cellular functions, including cell polarity,cell adhesion and migration, cell proliferation and apoptosis, genetic transcription, smooth muscle cell contraction. Studies have shown that Rho /Rho kinase is correlated with cardiovascular diseases, such as coronary heart disease( CHD) , hypertension, heart failure, etc. and its inhibitor fasudil can be used in treating many kinds of cardiovascular diseases in clinical practice. Here is to make a review of the correlation between Rho /Rho kinase and cardiovascular diseases.Key words: Rho /Rho Kinase Cardiovascular disease Rho kinase inhibitor1 Rho蛋白生物学效应1.1Rho蛋白分类Rho蛋白是一种小分子三磷酸鸟苷(guanosine triphosphate，GTP)结合蛋白，为Ras超家族中的一个亚群，分子量为2030 k Da，是由约2 00300个氨基酸组成的只有一个亚基的信号多肽1。它广泛分布于哺乳动物的组织细胞中，被称为小G蛋白超家族，.哺乳动物R ho家族至少有10个成员，包括Rho(异构体A至E、G)、Rac(异构体13)、Cdc42和TC102，Rho GTP酶家族是细胞表面的信号链接到多个细胞内反应的细胞内信号传感器。除了控制细胞间粘附，极化，囊泡运输和细胞周期，它们最出名的是其在调节细胞迁移所需的肌动蛋白动力学的作用3。它们通过动态调节肌动蛋白骨架来影响细胞的多态性和细胞的分裂增殖，而Rho在介导抑制轴突再生，引起生长锥塌陷过程中起着重要作用。1.2Rho蛋白结构与活性调控Rho蛋白和其他的小G蛋白一样，具有保守的GTPase结构域、GTP/GDP结合域和效应物结合域4。另外R ho蛋白还有一个经翻译后修饰的C末端,这个脂质末端与一些调节因子以及膜结构相互作用,如细胞膜、包涵体和高尔基体等.Rho蛋白在细胞内与GTP和GDP有高度的亲和力,并且具有低水平的内在GTPase活性5Rho蛋白活性受3种细胞因子调节( 1) 鸟苷酸交换因子(guanine nucleotide exchange factors GEFs):调控小蛋白GDP/GTP的转换,GTP通过其端与特异性靶区作用而定位于胞膜，（2）GT P酶激活蛋白(GTPase activating protein s,GA P s),提高Rho GTPase的内在GTP酶活性,加速GTP酶的水解,使R ho蛋白恢复到GDP结合的失活状态;(3)GDP解离抑制因子(GDP dissociation inhibitors,GDIs)抑制GDP/GTP的转换和GTP的水解,从而抑制Rho蛋白的激活6。Rho蛋白具有GTP酶活性，在细胞信号转导通路中以GTP结合形式(活性状态)和二磷酸鸟苷结合形式(非活性状态)存在，通过二者间相互转换引发或终止细胞级联活化反应，产生多种生物学效应。 2 Rho激酶2.1Rho激酶的结构和分类迄今利用酵母双杂交体系和亲和层析法已鉴定出50多种Rac，Rho，Cdc42的下游效应物和靶蛋白7。一类有代表性的效应物是Rho激酶家族。其中最早发现的Rho激酶又称Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶(Rho associated coiled-coil forming protein serine/threonine kinase，ROCK)是一种丝/苏氨酸蛋白激酶，其一级结构自N端依次含有激酶催化结构域(kinase domain/catalytic domain，CD)、Rho蛋白结合结构域(Rho-binding domain，RBD)、P H结构域(pleckstrin-homology domain)和半胱氨酸富集结构域(cysteine-rich repeatdomain，CRD)(图1 A)，ROCK的晶体结构已经阐明，机体的ROCK以同源二聚体的形式存在，静息状态下没有活性，二聚体的形成通过P H结构域相互缠绕实现(图1B，C)5ROCK全片段的晶体结构也已经构建。图1 A:ROCK的一级功能结构；B:ROCK的晶体结构；C:ROCK整体结构示意图Rho激酶有ROCK1(ROCK)和ROCK2(ROCK)两种异构体;人类OCK1与OCK2基因分别定位在第18号染色体和第2号染色体上8，两者在氨基酸序列中的表达有65%相似，在它们表达的激酶域中有92%相似。ROCK1与ROCK2分布广泛，普遍表达在各种组织，大脑和骨骼肌以ROCK2表达为主，在肺脏肝脏脾脏肾脏和睾丸以ROCK1表达为主9，在血管平滑肌和心脏，两种蛋白均有表达10。生物化学分离技术分离发现，Rho激酶绝大部分分布在细胞质内，并且用免疫细胞化学技术能够发现Rho激酶遍布细胞溶胶。当细胞转染Rho GTP或用生长因子刺激以后，部分Rho激酶易位到细胞膜上。2.2 Rho激酶活性的调节机制Rho激酶是一种GTP结合蛋白的重要效应分子，可以通过Rho/Rho激酶信号通路参与细胞的多种生理功能及细胞过程。静息状态下的ROCK没有酶活性，因为ROCK的激酶活性存在一种自我抑制机制，C末端为激酶活性负调节区域，因为C末端折回其催化结构域，形成自动抑制环，使ROCK处于非活性状态。即ROCK的RBD，PHD和CRD等结构域能通过一种返折机制将ROCK的催化活性中心覆盖，使其不能与ATP及其下游底物大分子多肽/蛋白结合。在生理条件下当结合GTP的R ho与RBD结合，改变了ROCK的空间结构，破坏催化结构域与C末端之间的负调节相互作用，活性中心暴露从而表现催化活性，使激酶活化，对细胞外信号作出反应。研究表明，Rho A结合的RBD晶体结构是平行的卷曲螺旋二聚体，即整个激酶也是二聚体，这表明蛋白质低聚化可以调节ROCK的活性，可能是通过N末端的转磷酸作用。除此之外。其他物质如花生四烯酸(arachidonic acid，AA)、神经磷酸胆碱，它们可以直接激活ROCK，而不依赖Rho。另外参与细胞凋亡的caspase-2，3（含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-cysteinyl aspartate specific proteinase）也能将ROCK(ROCK I)的返折部分水解11，切掉ROCKC末端的自动抑制结构域，从而激活ROCK。 3 Rho/Rho激酶与心血管疾病3.1Rho/Rho与高血压动脉高血压是一个主要的危险因素，是最常见的心血管疾病之一。由于血管收缩的增加和动脉壁重塑引起的周围血管阻力增加导致高的动脉压的水平。此外，心输出量增加，降低了肾钠/水排泄和一个扭曲的CNS用于血压调节是高血压发病机制的关键组成部分。许多因素，特别是肾素血管紧张素 - 醛固酮系统和活性氧（ROS）在高血压病理生理学牵连12-13另一方面，心血管细胞在各种压力，如压力，舒展，缺氧和血管紧张素影响下产生ROS导致血管氧化还原状态的变化;这些变化进而激活特定的信号通路导致平滑的肌肉收缩和增殖，诱导炎症反应和内皮依赖性舒张的损害14。血管平滑肌的收缩状态决定血管腔的大小，血管平滑肌紧张度的异常增大参与了血管疾病的发生机制。更好地理解调节血管紧张度的分子机制对于为预防和治疗血管疾病是至关重要的。高血压最重要的发病机制就是血管阻力的增加，但是其分子机制还未完全阐明。RhoRho激酶信号通路可以通过对VSMC(血管平滑肌细胞)的各种作用介导血管紧张度的改变，调节血管阻力甚至参与高血压的发生和发展15。ROCK信号的动脉高血压中的作用已被广泛使用研究，ROCK抑制剂如Y27632和舒地尔对各种高血压模型大鼠给药，均有显著的降压作用，而对正常大鼠血压无影响，总之，Rho激酶在高血压患者血压升高的发病机制中具有重要的作用16长期给予Rho激酶抑制剂法舒地尔等可显著抑制血压的升高。3.2Rho/Rho激酶与肺高血压肺动脉高压（PH）是一种无法治愈的疾病，本病的特点是持续的血管收缩，渐进血管重塑和不可逆的右心脏功能不全。而缺氧性肺血管收缩（HPV）是已知的导致的上升肺动脉压的主要病理生理学因素，生物机制导致HPV和血管重塑是多重的17。它被认为是分子间的相互作用和交叉参与PH的发病机制，扰动物质控制血管张力，细胞生长和细胞凋亡之间的生理平衡18。有研究表明，Rho/ RhoA的通路及其下游效应物，Rho激酶（ROCK-1和ROCK-2）信号通路在不同的肺动脉高压（PH）的实验模型中，包括慢性缺氧，野百合碱，博莱霉素，分流和血管内皮细胞生长因子受体的抑制作用以及慢性缺氧引起的PH的发病机制中起重要作用19。肺动脉高压与低氧，内皮功能障碍，血管平滑肌细胞和过度收缩相关增殖，增强ROS产生和炎性细胞迁移，对于其中Rho激酶是基本上参与。另外有研究表明长期用法舒地尔治疗会抑制野百合碱诱导大鼠的肺动脉压和小鼠缺氧诱发的肺动脉高压的发生20。3.3Rho/Rho激酶与动脉粥硬化动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)的特征是慢性炎症，脂质积聚和动脉壁的纤维化，从而导致斑块的积聚，从而导致平滑肌收缩功能的递减和内皮松弛。对于动脉粥样硬化目前公认的发病机制是“损伤反应学说”ET（内皮细胞endothelial cell，ET）受损是AS发生的始动因素，巨噬细胞血管平滑肌细胞的增殖和迁移在AS中起到重要的作用21多项动物研究已经证明，ROCK对于动脉粥样硬化的多个炎症步骤是关键的，而且ROCK选择性抑制剂会导致eNOS(内皮一氧化氮合酶endothelial NO synthase eNOS)的表达上调，血管炎症减少，并减少动脉粥样硬化斑块的形成22-23使用加速动脉粥样硬化的小鼠模型中，诸如载脂蛋白E缺陷小鼠，观察到在主动脉中动脉粥样硬化的早期阶段依赖ROCK的平滑肌收缩增加（不改变ROCK表达式）动脉粥样硬化病变的形成过程中，ROCK活性，正如ERM磷酸化所指示的一样，可以通过Y27632处理受到抑制，在某些区域和细胞类型包括内皮细胞，脂肪细胞外膜周和巨噬细胞泡沫细胞中增加24。此外，用法舒地尔处理引起动脉厚度，最大流速和巨噬细胞聚集在下降动脉粥样硬化病变的。另外有研究证实，氟化钠可通过激活Rho/Rho激酶信号通路诱导动脉内皮血管收缩，而5-羟甲基胞嘧啶25可通过抑制此通路解除其缩血管效应，具有扩血管和抗AS的作用，因此可能被用于治疗或预防与Rho/Rho激酶信号通路激活相关的心血管疾病。3.4 Rho/Rho激酶与心肌缺血再灌注损伤研究发现ROCK在心脏局部缺血/再灌注（I/R）损伤有重要作用，其中血液流动受到限制或切断，然后将其再引入到该区域。I/R导致氧化应力，线粒体功能障碍，炎症和组织损伤。缺血后再灌注会引起RhoA/ROCK活性的增加26。有研究证实RhoA/ROCK信号在几个体内模型I/R损伤包括小鼠，大鼠和猪的有害作用。在这些模型中ROCK的抑制剂如法舒地尔或Y27632能显著的抑制缺血再灌注后ROCK的活性，会减少梗死面积和炎症因子水平，减少细胞凋亡和增强收缩功能。RhoA/ROCK信号有助于I/R损伤的机理包括抑制再灌注损伤的抢救激酶途径，例如PI-3K/AKT/eNOS信号。抗凋亡Bcl-2蛋白表达下降蛋白;增加线粒体核的凋亡诱导因子易位通过C-Jun氨基末端激酶的活化;诱发炎症回应。削弱ROCK的抑制剂如Y27632在I/R损伤中的能量的产生，来增加乳酸脱氢酶和甘油醛-3-磷酸脱氢酶。4 Rho激酶抑制剂法苏地尔是目前唯一应用到临床和在实验中最常用的Rho激酶抑制剂，最初在日本被用于治疗蛛网膜下腔出血，目前国外已在心绞痛心力衰竭高血压等方面进行试验性治疗，临床实践表明，人体对此药有较好的反应性。临床应用证实，法苏地尔对包括心绞痛、高血压、冠脉血管痉挛28、冠脉再通手术后再狭窄和动脉粥样硬化在内的心血管疾病均有较好的治疗作用29。法舒地尔还可通过抑制醛固酮和肾素发挥潜在的心肾抗纤维化作用，此研究结果已在糖尿病大鼠模型中得到证实30作为蛋白激酶抑制药，法苏地尔还在细胞水平调节细胞增殖、迁移黏附、骨架重排、胞浆移动、炎症细胞运动等，在分子基因水平调节炎症、血栓形成、氧化、纤维化等相关的多种因子。近些年来，多种其他类型的Rho激酶抑制剂已被报道，包括蚓唑类苯咪唑类异喹啉类等。5展望 大量研究证实了Rho/Rho激酶信号通路参与了多种病理机制，与多种心血管疾病有密切的联系 ho激酶表达上调会促进许多心血管疾病的发生及发展。目前有许多动物试验证明ho激酶抑制剂可以改善和治疗心血管疾病，可以减轻临床症状，且优于现在常用的一些心血管疾病治疗药物。总的来说，许多疾病均与Rho激酶表达的上调有关，因此不可否认的Rho激酶是一个重要的治疗靶点所以，进一步了解Rho激酶各种亚型的生理作用以及各种亚型的特异抑制剂是十分必要的，特异和有效的Rho激酶信号通路药理调节剂对于心血管疾病的干预仍是必不可少的 目前为止，法舒地尔是唯一已经用于临床的Rho激酶抑制剂 相信，在不久的将来，可以更加充分地认识ho激酶表达上调导致心血管疾病的机制，更多的Rho激酶抑制剂将会被研制出来并应用于临床。 参考文献1. 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