SDS-PAGE分离蛋白技术.doc

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白技术 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)是对蛋白质进行量化,比较及特性鉴定的一种经济,快捷,而且可重复的方法,该法主要依据蛋白质的分子量对其进行分离.【实验目的】 掌握用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离不同蛋白质的方法.【实验原理】 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳是蛋白分析中最经常使用的一种方法.它是将蛋白样品同离子型去垢剂十二烷基硫酸钠(SDS）及巯基乙醇一起加热，使蛋白变性，多肽链内部及肽键之间的二硫键被还原，肽键被打开，打开的肽键靠疏水作用与SDS结合而带负电荷，电泳时在电场作用下，肽链在凝胶中向正极迁移。不同大小的肽链由于在迁移时受到的阻力不同，在迁移过程中逐渐分开，其相对迁移率与分子量的对数间成线形关系。【实验器材与试剂】一,仪器垂直板电泳槽及配套的玻璃板,梳子,电泳仪,干式恒温培养器,微波炉等.二,材料蛋白样品,蛋白标准品,EP管三，试剂1,1.5mol/L Tris-HCL Ph8.8（已加SDS）2,0.5mol/L Tris-HCL pH6.8（已加SDS）3,10SDS4,30丙烯酰胺（Acr/Bis）溶液：29.2g丙烯酰胺（Acr）+0.8g甲叉双丙烯酰胺(Bis)，用双蒸水定容至100ml，过滤备用，4下存放。5,10过硫酸铵（AP）（-20存放）6, 2样品缓冲液 0.5mol/L Tris-HCL Ph6.8 2ml 甘油 2ml 20SDS 2ml 0.1溴酚蓝 0.5ml -巯基乙醇 21.0ml 双蒸水 2.5ml 7, 5电泳缓冲液 Tris 7.5g Gly 36g SDS 2.5g双蒸水溶解，定容至500ml，使用时稀释5倍。8，染色液：0.2考马斯亮蓝R250+84ml95乙醇+20ml冰醋酸，定容至200ml，过滤备用9，脱色液：V（乙醇）:V(冰醋酸)：V（水）=7.5:7.5:85【实验内容】 一，聚丙烯酰胺凝胶的配制 1，分离胶（10）的配制： 双蒸水 4.0ml 30Acr/Bis 3.3ml 1.5mol/LTris-HCL 2.5ml 10SDS 0.1ml 10AP 0.1ml 取1ml上述混合液，加TEMED(N,N,N,N-四甲基乙二胺)10L封底，余加TEMED 4L，混匀后灌入玻璃板间，以水封顶，注意使液面齐平，凝胶完全聚合需3060min 2，浓缩胶（4）的配制： 双蒸水 1.4ml 30Acr /Bis 0.33ml 1mol/L Tris-HCL 0.25ml 10SDS 0.02ml 10AP 0.02ml TEMED 2L 将分离胶上的水倒去，加入上述混合液，立即将梳子插入玻璃板间，完全聚合1530min。二，样品处理 将样品加入等量的2样品缓冲液，100加热35min，12000g离心1min，取上清作SDS-PAGE分析，同时将SDS低分子量蛋白标准品作平行处理。三，上样 取10L诱导与未诱导的处理后的样品加入样品池中，并加入20L低分子量蛋白标准品作对照。四，电泳 在电泳槽中加入1电泳缓冲液，连接电源，负极在上，正极在下，电泳时，浓缩胶电压60V，分离胶电压100V，电泳至溴酚蓝行至电泳槽下端停止（约需3h）五，染色 将胶从玻璃板中取出，考马斯亮蓝染色液染色，室温46小时。六，脱色 将胶从染色液中取出，放入脱色液中，多次脱色至蛋白带清晰。七，凝胶摄像和保存 在图像处理系统下将脱色好的凝胶摄像，结果存于软盘中，凝胶保存于双蒸水中或7乙酸溶液中。【注意事项】 1，在加AP和TEMED之前最好对溶液进行抽气，以防止溶解在溶液里的分子氧在聚合时产生气泡使胶不均一。 2，AP和TEMED的量应根据室温和聚合情况而定。 3，分离胶聚合后最好在4下放置12h后再用，以使凝胶充分聚合，改善电泳时的分辨率。 4，为防止气泡陷入，梳子应倾斜插入。 5，如果带着梳子过夜可能会影响分辨率，所以浓缩最好在使用前再灌制。 6，如果没有足够数目的样品，应在加样孔中加样品缓冲液，不要留有空孔，以防止电泳时邻近的带扩展。 7，在样品浓度不确定的情况下，加样使用梯度加样法，这样能大致估计出样品的浓度。【思考题】 1，在不连续体系SDS-PAGE中，当分离加完后，需在其