siRNA新颖的合成方法.doc

siRNA新颖的合成方法Bio-Rad与集成DNA技术公司（Integrated DNA Technologies，IDT)联手发展一种可以获得有效的27-mer Dicer酶作用（Dicer-substrate）siRNA双链的方法。通过这种方法可以获得有效预设的siLentMer siRNA双链。Dicer-Substrate siRNA技术原理之前的研究认为在没有引起干扰素应答（interferon response）的条件下，只有21-23nt双链siRNA才能激活RNAi途径（Elbashir et al. 2001)，但是来自美国希望之城国家医学中心（the City of Hope）和IDT的研究人员证明无干扰素应答激活的前提下，27-nt的siRNA双链实际上能有效的激活RNAi途径，并且比经典的21-mers siRNA更早激活这一途径（Kim et al. 2005)。这些研究数据表明27-nt双链是由RNaseIII家族成员：Dcicer酶加工获得的，而且27-mer siRNAs常常表现出比21-mer siRNA能更有效的RNA干扰效果。siLentMer Dicer-Substrate siRNA双链因此在这一理论基础上，IDT建立了27-mer设计运算法则（algorithm），相关生物信息学和高质量合成方法，并推出了siLentMer Dicer-substrate siRNA双链合成。这些双链已由Bio-Rad研发部专家经过了性能验证和有效性验证，可以减少至少85%的mRNA表达。除此之外，这种siRNA对于建立有效siRNA库也很合适，多种靶标的多siRNA双链合成可以产生复合生物学效应，有利于特异兴趣基因的确定敲除。减少脱靶效应当siRNA序列与兴趣基因非特异性序列mRNA转录本相似的时候就会产生脱靶效应（off-target effects）（Jackson et al. 2003），这会引起基因表达谱的错误识别，从而导致与目标基因无关的转录本沉默。为了避免这种情况出现，siLentMer siRNA双链：利用先进的生物信息学对敲除特异性同源序列进行分析，确保特异靶标。低浓度（(5 nM）有效性：在siRNA高浓度的时候才会发生脱靶效应，为了减少这一效应，siLentMer siRNA在低浓度时提高了有效性（见下图）。HPLC级纯化siRNA保证了一致和可靠的结果。HeLa细胞用10 nM 或者100 pM anti-GAPDH siRNA进行转染，转染后48小时提取总RNA， 进行iScript cDNA 合成试剂盒和iCycler iQ实时监控RT-qPCR分析，结果发现GAPDH转录水平()，相对于非沉默对照 ()，已经减少了至少95%）除此之外，序列有效性(Anon. 2003)和足够的实验对照也能减少脱靶效应的产生，siLentMer siRNA包含了阳性和阴性对仗，能确保沉默和简便结果分析。参考文献：Anonymous author, Whither RNAi?, Nat Cell Biol 5, 489490 (2003)Elbashir SM et al., Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells, Nature 411, 494498 (2001)Jackson AL et al., Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi, Nat Biotechnol 21, 635637 (2003)Kim DH et al., Synthetic dsRNA