Snapshot技术平台(中文).doc

Snapshot技术平台SnaPshot技术平台是Applied Biosystems,ABI公司推出了专为检测 SNP 设计的分析软件和试剂盒可对多个 SNP 位点同时进行基因分型 ,也被称为 minisequencing 。该方法针对不同突变位点设计不同长度的引物SNaPshot 反应后 ,产物通过电泳分离、五色荧光检测、Gene mapper 分析 ,可在 一次电泳胶 内检测 多个 SNP位点。这个平台是建立在3730，3130等PCR测序仪上的技术。3730XL型DNA序列检测仪一. SnaPshot工作原理应用 SNaPshot 进行定点的序列分析 ,其基本原理遵循了DNA 直接测序中的双脱氧终止法 ,所不同的是 PCR 反应中只有不同荧光标记的ddNTP。由于每个 SNP 位点的引物 3端都紧靠SNP点 ,因此每一种引物在聚合酶作用下 ,根据模板的的序列 ,只延伸一个核苷酸。然后用先进的荧光检测系统 ,检测延伸的那个核苷酸的种类。1多重SNaPshot反应的工作原理： 在一个SNaPshot反应体系中， 针对每个待测SNP 位点 在其上游或下游设计一条单向的寡核苷酸引物（正向引物或反向引物） ，引物的Tm 值要求在50度以上 ，在 AmpliTaq聚合酶和 4种不同荧光标.记的ddNTP存在的情况下,各条引物与各自互补的DNA 模板结合, 聚合酶在引物的3末端延伸单个碱基反应即告终止,产物的长度为引物长度+1bp。延伸的碱基就是该样本在该位点上的基因型 ，其中纯合子表现为单峰，杂合子表现为双峰 。为了能够分辨不同SNP的不同基因型，可在引物的5末端加上不同长度的Poly C 或Poly T，使各条引物以长度区分。经电泳将其分开。最短的引物一般设定为20bp, 相邻两个SNP的引物之间长度一般相差 4-6个核苷酸，以便区分。 多重SNaPshot反应即利用引物间长度的差异和单碱基延伸4种荧光标记的ddNTP 而最终达到区分不同SNP 位点的作用, 一次反应可以同时对4-5个SNP进行基因分型, 是一种通量较高的基因分型的方法。图1 SnaPshot实验原理图解2多重SNaPshot反应的工作通量工作的进度取决于多重PCR和EXTENSION的条件优化过程。还有测序仪的通量也是很重要的，3730每天可以做16次96道电泳，如果每次出4个位点，那每天的通量就是6000个GENOTYPING，是中等通量的检测。二. SnaPshot工作流程1 引物的设计SNAPSHOT可以检测多重的SNP，我们一般选择45个位点做一个组合。现对这些目的SNP进行引物的设计。每个SNP设计3条引物，其中2条是目的片段的扩增，长度在200500bp左右，Tm值在60度左右。第3条的引物的是延伸ddNTP,设计在SNP位点的上游或者是反向的下游。 引物设计注意事项：1 同一反应管中，不同位点的引物长度必须不同，最好能相差4-6个碱基。2 引物与模板互补部分（有效引物）的Tm值至少要50 C。3 为了改变引物的长度，区分不同的位点，可以在引物的5端加poly(dT)、poly(dA)、poly(dC)或者poly(dGACT)尾巴。这四种尾巴理论上不容易形成二级结构，并且都经过实验验证。小心：poly(dT)有可能与真核基因3端的poly(dA)尾巴互补。4 引物在毛细管中的迁移受引物长度、碱基组成、标记的荧光染料等因素影响。引物越短，影响越显著，越有可能偏离仅仅根据片段长度预期的引物迁移距离。当引物长度小于36个碱基时，ABI强烈建议用户使用Primer Focus试剂盒做预实验，确定各种引物在多重电泳中的精确迁移距离。5 合成长度大于30个碱基的引物时，建议采用HPLC方法纯化。6 在引物设计的时候，如果+链DNA的序列不理想，难以设计出最佳引物，请使用-链DNA设计引物。进行多重 SNaPshot 反应时 ,需多条引物和多个模板同时进行。为了保持反应的一致性 ,对引物的设计要求是尽量保持相近的Tm 值 ,否则会引起非特异性产物的扩增 ,造成碱基误读。另外 ,反应混合液中不同模板和其对应引物的量还应选择合适比例。与单重 SNaPshot 反应相比 ,多重反应不但节省了反应时间 ,还大大减少了试剂用量 ,降低了反应成本。位点SNPPCR LEFT PRIMERTMPCR RIGHT PRIMERTM长度SNP1c/tGAGCCAGAGGAGGATGTTGA60.35GGCTAGAAGGAGCGAGGACT60.12248SNP2C/TACGTTGCAGTTGCCTTTCTT59.92GACTCTGCAGTGAGGCCCTA60.55210SNP3A/GCCTTGATACCACGTGCATTG59.99TTCTTCAGCCTCTGCCATTT59.96185SNP4C/GTCAAGCCCAGTCCTTTCTGT59.84CCCAATAGCCGTATCTGGAA59.92296位点延伸引物TM方向产物长度Nts addedSNP1CGATCATAGTCAGCTGGCCT60.4R20A/GSNP2cccccccc-GGCACGGTACCTGGGCT62.1L25C/TSNP3cccccccc-TCATCAATTGCTGAGGACAGAG60.4L30A/GSNP4ccccccccccccc-AACTCTGGGAGATTCTCCTATTGAC60.36L38C/G2 片段扩增 引物稀释,将2OD的引物稀释到100mM.加入的TE的量为660000/MW如分子量为7003，则加入 660000/7003=94.2ul做试验前将一组的引物加DDH2O稀释成10mM.反应体系： 用 量 10Buffer (15Mm Mg2) 1 mL Primer (10Mm) 0.4 mL dNTP(10Mm) 0.3 mL HotStar (5u/ul) 0.1 mL DNA 1 mL Mg2 (25Mm) 0.52 mL ddH2O 6.68 mL Total Volume 10 mL多重PCR反应采用Touchdown的 PCR反应程序:95 15 min;94 40 s, 63 1 min 每个循环下降0.5 ,72 1.5 min,1 5个循环;94 40 s,56 40 s,72 1.5 min, 25个循环;72 8 min; 结束后4 保存。PCR产物经琼脂糖电泳检测有片段的表明实验成功。多重PCR产物凝胶电泳3 PCR产物的纯化 多色SNP实验的模板DNA可以是质粒，也可以是PCR产物(0.01到0.4 pmol)。质粒可以直接用于反应，但PCR产物必须先作好纯化，SAP酶将残余 dNTPs去磷酸化, ExoI降解游离单链引物。（1）纯化酶： SAP和Exo I（2）作用原理： SAP 去除多余的dNTP和引物 Exo I 去除单链引物和其他单链DNA产物（3）反应体系： PCR产物6mL2mL酶混合液（含2U SAP和2U ExoI），振荡混匀（4）反应条件： 37 C 孵育保温1 hr，然后75 C 保温15 min以灭活SAP和Exo I酶。纯化好的模板可以在4 C保存24 hr或-20 C长期保存。4SNaPshot PCR混合模板： 如果以PCR产物作为SNaPshot PCR的模板，在纯化好后，每种各取2 mL，混合。混合SNaPshot的PCR引物：每种引物在反应体系中的终浓度分别为0.2 mM。混合SNaPshot的PCR引物：每种引物在反应体系中的终浓度分别为0.2 mM。(每个SNP引物加1-2ul到500ulDDH2O中)SNaPshot PCR： 用量 (mL / Sample)标准品 (mL)Reaction Mix 0.5 5Pooled PCR Products2 2Pooled Primers1.2 1dH2O 1.3 2 总体积 5 mL 10 mLPCR循环条件为：96 C 10 sec (96 C 10 sec 50 C(53C)5 sec 60 C 30 sec) 25循环 60 C 30 sec 4 C5SNaPshot PCR产物的纯化在5 mL上述SNaPshot PCR产物中加入0.5USAP或者1 U CIP，震荡混匀，37 C 保温1 hr，75 C 保温15 min以灭活酶，4 C可保存24 hr或-20 C长期保存。6310、3100、3730电泳样品制备试 剂 用量 (mL)Hi-Di Formamide9.25GS-120 LIZ 0.1SNaPshot产物 1 总体积 10.35 mL95 C变性 5 min 迅速冰冷4 min。每个电泳样本都加入了LIZ120内标，使延伸片段的长度大小可以精确定位。15202535506280110120图2，liz-120分子内标电泳峰形7GeneMapper4.0软件分析图3.不同样本多重SNAPSHOT电泳结果图4. 1个SNP位点的不同样本的基因型结果，G/A,AA,GG软件分析后输出数据结果Sample NameMarkerAllele 1Allele 2LH005RS1010GLH006RS1010GALH007RS1010ALH009RS1010GALH010RS1010GALH012RS1010GLH014RS1010GA