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动物生物化学实验讲义东北农业大学动物生化教研室实验项目1 球蛋白的分离实验项目2 球蛋白含量测定（光度分析法）实验项目3 凝胶柱层析法（球蛋白纯化）实验项目4 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）实验项目5 动物组织中DNA的制备实验项目6 多聚酶链反应（PCR扩增反应）实验项目7 琼脂糖凝胶电泳分离DNA实验项目8 转氨酶GPT活性的测定实验项目9 氨基酸薄层层析实验项目10 琥珀酸脱氢酶及丙二酸的抑制作用实验一 球蛋白的分离【 原 理 】 中性盐 （如硫酸铵、硫酸钠、氯化钠、硫酸镁等）对球状蛋白质的溶解度有显著影响。随着中性盐浓度的增加，离子强度也增加。当溶液离子强度增加到一定数值时，溶液中蛋白质的溶解度开始下降。离子强度增加到足够高时，蛋白质可从水溶液中沉淀出来，这种现象叫做盐析。各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的高浓度盐溶液来沉淀分离各种蛋白质。蛋白质是一种生物大分子，它具有不能通过半透膜的性质。透析就是利用这种性质使之与其它小分子物质如无机盐、单糖等分开。本次实验应用的是脱盐透析，即盐析后，将含大量盐类的蛋白质溶液放在半透膜的袋内，再将透析袋浸入蒸馏水中。经过一段时间，袋内的盐类浓度即逐渐降低。若经常更换袋外的液体，最后即可使袋内的蛋白质溶液中所含的盐类除净，从而达到脱盐的目的。应用不同浓度硫酸铵分段盐析法将血清中球蛋白及、球蛋白分离，最后用透析法脱盐，即可得到纯度较高的球蛋白。【 试剂和器材 】一 试剂1pH 7.2，0.01mol/L磷酸盐缓冲液生理盐水（简称PBS）： 取0.2mol/L Na2HPO4溶液36.0ml，0.2mol /L NaH2PO4溶液14.0ml混合，加NaCl 8.5克，用蒸馏水稀释至1 000ml。0.2mol/L Na2HPO4溶液：取28.4g Na2HPO4或71.6g Na2HPO412H2O用蒸馏水溶解稀释至1 000 ml。0.2mol /L NaH2PO4溶液：取24g NaH2PO4用蒸馏水溶解稀释至1 000 ml。2pH7.2饱和硫酸铵溶液：取化学纯（NH4）2SO4 800g，加蒸馏水1 000ml，不断搅拌下加热至5060，并保持数分钟，趁热过滤，滤液在室温中过夜，有结晶析出，即达到100饱和度，使用时用浓氨水将饱和硫酸铵溶液调pH到7.2。3纳氏试剂：纳氏试剂贮存液：于500ml三角烧瓶内加入碘化钾150克、碘110克、汞50克及蒸馏水l00ml，用力振荡715分钟，至碘色将转变时，此混合液即产生高热。随即将此烧瓶浸于冷水内振荡，直至棕色之碘转变成带绿色之碘化钾汞溶液为止。将上清液倾入2 000ml量筒内，并用蒸馏水洗涤瓶内沉淀物数次。将洗涤液一并倾入量筒内，加蒸馏水至2 000ml刻度后，混匀即成。纳氏试剂应用液：取10%氢氧化钠700ml，钠氏试剂贮存液150ml及蒸馏水150ml混匀即成，如显混浊，可静置数日后取上清液使用。此试剂之酸碱度极为重要。用lmol/L盐酸溶液20ml滴定时，需此试剂1111.5ml恰好使酚酞指示剂变成红色时最为适宜。否则必须纠正其酸碱度。4双缩脲试剂：溶解1.50克硫酸铜（CuSO45H2O）和6.0克酒石酸钾钠（NaKC4H406 4H20）于500ml蒸馏水中。在搅拌下加入10%氢氧化钠溶液300ml，用蒸馏水稀释到1升，贮存在内壁涂以石蜡的瓶中，可长期保存。5浓蔗糖液：蔗糖的饱和溶液。610%氢氧化钠：取10克氢氧化钠溶解于蒸馏水中，定容至100ml。二 器材1透析袋。2磁力搅拌器。3离心机。三 材料兔血清【 操 作 】一 盐析 1取离心管1支加入血清2ml，再加入等量PBS稀释血清，摇匀后，逐渐加入pH7.2饱和硫酸铵溶液2ml（相当于33%饱和度硫酸铵），边加边摇。然后静止半小时，再离心（3 000r/min）20分钟，倾去上清液（主要含白蛋白）。 2用lml PBS将离心管底部的沉淀搅拌溶解，再逐滴加饱和硫酸铵溶液0.5m1。摇匀后放置半小时，离心（3 000r/min）20分钟，倾去上清液（主要含、球蛋白），其沉淀即为初步纯化的球蛋白。如要得到更纯的球蛋白，可重复盐析过程12 次。 3把提取的球蛋白用1 mlPBS悬浮。二 透析脱盐与浓缩1将盐析得到的球蛋白放入透析袋内，用线绳缚紧上口，用玻璃棒悬在盛有半杯蒸馏水的100ml烧杯中，使透析袋下半部浸入水中。 2将烧杯放在磁力搅拌器上搅拌1小时以上（中间换水12次），然后将透析袋取下。小心将线绳解开，吸取袋内的液体，与烧怀中的水同时用双缩脲试剂检查袋内外的蛋白质，用纳氏试剂检查袋内外液体中的铵离子（NH4+），观察透析法的脱盐效果。3脱盐后得到的球蛋白溶液可继续浓缩，即用透析袋装好悬于盛有10ml浓蔗糖或聚乙二醇溶液的小烧杯内1小时以上，观察袋内液体体积的变化。实验二 球蛋白含量测定（光度分析法）【 原 理 】双缩脲法是蛋白质光度分析法的一种，是利用蛋白质的双缩脲反应而测定蛋白质含量的方法。因蛋白质含有两个以上的肽键，所以有双缩脲反应。在碱性溶液中蛋白质与Cu2+形成紫红色络合物，其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的分子量及氨基酸成分无关。在一定的实验条件下，未知样品溶液与标准蛋白质溶液同时反应，并于540560nm测定，即可以通过标准蛋白质的标准曲线求出未知样品的蛋白质浓度。【 试剂和器材 】一 试剂1标准酪蛋白溶液（5mg/ml）：用0.05mol/L NaOH溶液配制：5g酪蛋白加0.05mol/L NaOH溶液至1 000ml。2双缩脲试剂：溶解1.5g硫酸铜（CuSO4 5H2O）和6.0 g酒石酸钾钠（NaKC4H4O6 4H2O）于500ml蒸馏水中。在搅拌下加入10% NaOH溶液300ml，用蒸馏水稀释到1升，贮存在内壁涂有石蜡的瓶中，可长期保存。3未知蛋白质溶液：球蛋白溶液。二 器材分光光度计。【 操 作 】1标准曲线的绘制：取6支试管按下表操作。试 剂 1 2 3 4 5 6标准酪蛋白溶液（ml） 0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0蒸馏水 （ml） 2 1.6 1.2 0.8 0.4 0双缩脲试剂 （ml） 4 4 4 4 4 4室温下（1525）放置30分钟，用分光光度计于540nm测定。以光密度为纵坐标，酪蛋白含量为横坐标用坐标纸绘制标准曲线。2球蛋白溶液浓度的测定：取3支试管按下表操作。试 剂 空白管 测定1 测定2球蛋白溶液（ml） 1 1蒸馏水 （ml） 2 1 1双缩脲试剂 （ml） 4 4 4摇匀，放置30分钟，540nm测定读取光密度。【 实验结果 】求出待测蛋白质溶液的光密度后，从标准曲线上查出其蛋白质浓度，按稀释倍数求出每毫升蛋白质溶液的蛋白质含量。实验三 凝胶柱层析法（球蛋白纯化）【 原 理 】凝胶层析（gel chromatography），又称为凝胶过滤（gel filtration）、分子筛过滤（molecular sieve filtration）、凝胶渗透层析（gel osmotic chromatography）等。它是20世纪60年代发展起来的一种层析技术。其基本原理是利用被分离物质分子大小不同及固定相（凝胶）具有分子筛的特点，将被分离物质各成分按分子大小分开，达到分离的方法。凝胶是由胶体粒子构成的立体网状结构。网眼里吸满水后凝胶膨胀呈柔软而富于弹性的半固体状态。人工合成的凝胶网眼较均匀地分布在凝胶颗粒上有如筛眼，小于筛眼的物质分子均可通过，大于筛眼的物质分子则不能，故称为“分子筛”。凝胶之所以能将不同分子的物质分开是因为当被分离物质的各成分通过凝胶时，小于筛眼的分子将完全渗入凝胶网眼，并随着流动相的移动沿凝胶网眼孔道移动，从一个颗粒的网眼流出，又进入另一颗粒的网眼，如此连续下去，直到流过整个凝胶柱为止，因而流程长、阻力大、流速慢；大于筛眼的分子则完全被筛眼排阻而不能进入凝胶网眼，只能随流动相沿凝胶颗粒的间隙流动，其流程短、阻力小、流速快，比小分子先流出层析柱；小分子最后流出。分子大小介于完全排阻不能进入或完全渗入凝胶筛眼之间的物质分子，则居中流出。这样被分离物质即被按分子的大小分开。 用于凝胶层析的凝胶均为人工合成的产品，主要有交联葡聚糖（商品名为Sephadex）、琼脂糖（商品名为Sepharose）、聚丙烯酰胺凝胶（商品名为Biogel）及具有一定网眼的细玻璃珠等和这些凝胶的衍生物。本实验主要介绍葡聚糖凝胶，这是由葡萄糖的多聚物与1氯2、3环氧丙烷 （CH2CHCH2C1）交连而成。环氧丙烷引入丙三醇基将链状的多聚葡萄糖单位交联起来，凝 O 胶网眼的大小由多聚葡萄糖的分子和环氧丙烷的比例（交联度）来控制。 葡聚糖具有较强的亲水性，在水和电解质溶液中膨胀成为柔软而富于弹性的凝胶，其吸水能力与葡聚糖凝胶的交联度有密切关系。交联度大的，孔径小，吸水少，膨胀的程度小；交联度小的，孔径大，吸水多，膨胀的程度大。因此，葡聚糖凝胶孔径的大小可以其吸水量的大小来表示，常以G10至G200号码标记。G后面的数字是其吸水量（毫升水/克干胶）乘以10所得的值。如G25即表示吸水量为2.5ml/g干胶。市售有G10、G25、G50、G75、G100、G150、G200等型号。G75以上的胶因吸水量大，膨胀后形态柔软易变，统称为软胶。G75以下的称为硬胶。 葡聚糖凝胶可分离的分子大小从几百到数十万。可根据被分离物质的分子大小及目的选择使用。一般说Sephadex Gl015通常用于分离肽及“脱盐”。Sephadex G75200用以分离各类蛋白质。凝胶层析是一种物理分离法。葡聚糖凝胶基本上不带电荷呈多惰性，不与被分离物质发生反应，所以分离的效果较好。然而由于它是葡萄糖的聚合物，因而仍有少量活性羟基，能吸附少量蛋白质等被分离的物质。为了克服这个缺点，一般使用含有离子强度达0.08的NaCl等中性盐缓冲液作洗脱液。本实验采用凝胶过滤法纯化球蛋白，除去其中的硫酸铵，以达到纯化目的。【 试剂和器材 】一 试剂1实验二提取出的球蛋白2磷酸盐缓冲液（pH6.7，0.0175mol）：取0.2mol/L Na2HPO4溶液43.5ml，0.2mol/L NaH2PO4溶液56.6ml混合，用蒸馏水稀释至1 000ml。3Sephadex G25。4奈氏试剂520%磺酰水扬酸6洗脱液：磷酸盐缓冲液（pH 7.0，0.01mol） 取0.2mol/L Na2HPO4溶液30.5ml，0.2mol /LNaH2PO4溶液19.4ml混合，加NaCl 8.5克，用蒸馏水稀释至1 000ml。二 器材1lcm20cm层析柱2洗脱瓶。3部分收集器4恒流泵 5监测仪【 操 作 】1凝胶处理：溶胀（水化）：商品葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶均为干燥颗粒，使用前必须水化溶胀。商品琼脂糖凝胶呈悬浮胶体可直接用，玻璃球不用溶胀。凝胶溶胀有两种方法：一种是将所需葡聚糖凝胶浸入蒸馏水中于室温下溶胀；另一种 是置于沸水浴中溶胀。各种葡聚糖在上述溶胀方法中所需的时间见实验原理部分。必须浸泡足够的时间以使凝胶充分溶胀。两种方法中，沸水浴溶胀不但节省时间，还可以杀灭凝胶中污染的细菌并排出网眼。凝胶溶胀后，需用蒸馏水洗涤几次，每次应将沉降缓慢的细小颗粒随水倾倒出去，以免在装柱后产生阻塞现象，降低流速。洗后将凝胶浸泡在洗脱液中待用。一支层析柱中应该装入的干胶量可以用下法推算：称取1g所需型号的葡聚糖干胶，放在5ml量筒中，用室温溶胀的方法充分溶胀，观察溶胀后凝胶的体积。然后在层析柱中加水到所需柱床高度，将水倒出，量取柱床体积。根据1g干胶溶胀后的体积和所需柱床体积，即可推算出干胶的需要量。 2装柱 将层析剂装入柱中进行层析的方法称柱层析法。作层析用的柱子称层析柱。层析柱有玻璃和透明塑料的两种。柱子的一端为进口，另一端为出口，出口端底部有烧结玻璃砂板或尼龙布，能阻止层析剂流出，溶剂则可流过。如果没有市售的层析柱，可以选用粗细均匀，长短合适的玻璃管，在两端塞上合适的胶塞，胶塞中插人细玻璃管，在一端放一层尼龙布为出口，即可作为层析柱使用。层析柱的长短粗细根据实验的目的而定，一般说来，凝胶层析时柱越长，分离效果越好。但柱过长，层析时间长，样品易稀释造成扩散，反而影响分离效果。柱的内径不宜较细，直径1cm以下的柱易发生“管壁效应”，即柱中部分的物质组分移动较快，管壁周围的则移动较慢，造成分离混乱。当然柱的内径也不宜过粗。凝胶层析中，在把小分子物质（mw1 500），如无机或其他物质与大分子物质 （mw20 000）分离时，层析柱的体积一般约为样品的410倍，高度与直径的比例为5：1至15：1之间。这类柱也称为“脱盐”柱，常用网孔很小的凝胶如G25。用以将生物大分子物质彼此分开的分级层析柱，体积应为样品体积的25100倍。柱长度与直径的比例为20：1100：1。本实验中使用“脱盐”柱。装柱的操作过程如下：将层析柱垂直固定在支架上，打开柱下口开关。将溶胀好的凝胶放在烧杯中，使凝胶表面上的水层与凝胶体积相等。用玻璃棒搅匀凝胶液，顺玻璃棒灌入柱内。此时柱下口一边排水，上口一边加入搅匀的凝胶，可见凝胶连续均匀地沉降，逐步形成凝胶柱。当到达所需凝胶柱高度时（本实验达17cm），立即关闭下口，待凝胶自然沉降形成凝胶柱床。凝胶柱床一般应离柱顶35cm，并覆盖一层溶液。灌注凝胶时要求将均匀的凝胶一直加到所需柱床高度，不能时断时续，否则将出现分层或“纹路”等毛病。若中途出现这些现象，可以用玻璃棒将已形成的柱床逐步搅起，直至出毛病的部分再让凝胶重新沉降或继续加入搅匀的凝胶悬液。若在灌好胶后才发现“纹路”、分层等现象时，要重新装柱，以免影响层析效果。在做大型的凝胶柱时，灌注的凝胶是否均匀往往从表面上看不出来。所以使用前应该用一些带色的大分子物质如细胞色素C、血红蛋白或专用的蓝色葡聚糖2 000 （Blue dextran2 000）通过凝胶柱，观察形成的色斑带是否整齐，若斑带歪斜，应该重新装柱，直至达到要求。刚从冰箱中取出的凝胶液，不能马上用来灌柱，应平衡至室温后再用，不然装好的凝胶会产生大量的气泡影响层析。在整个灌注凝胶的过程及使用中，凝胶柱面上一定要覆盖着一层溶液，以免进入空气。若进空气再加入溶液时，凝胶柱中易形成气泡。3平衡 装好的凝胶柱，使用前应该用相当于柱床体积两倍或更多的洗脱液（本实验中为pH 7.0，0.01mol磷酸盐缓冲液溶液）流过凝胶柱，以压实凝胶，称为平衡。 4上样 将样品加入到凝胶柱中，准备层析的过程称上样。上样时，应该注意上样量的多少、样品的黏稠度及离子强度。这三个因素会影响到以后层析的效果。一般来说“脱盐”层析时，上样体积可为柱体积的10%25%；生物大分子的分级分离，约为柱体积的1%5%。样品的黏稠度一般不宜大于洗脱液黏稠度的2倍以上，不然洗脱峰会变宽和歪斜。离子强度要达到0.08，以免产生特异性吸附。上样操作：先打开层析柱的下口开关，放出凝胶柱面上的溶液，或用皮头吸管吸取，使液面与凝胶表面相平齐，但切忌液面低于凝胶表面。然后将样品加在凝胶表面，打开柱下口开关，控制流速，使样品慢慢渗入凝胶内。本实验以盐析所得 球蛋白为样品，用皮头吸管加到凝胶柱表面。加样时注意勿将凝胶柱面冲起形成凹面，也不能沿管壁流下，以免样品沿柱壁与凝胶柱的间凝胶隙漏下。当慢慢渗入凝胶的样品液液面与凝胶柱面相平时，关闭下口，完成上样。然后在凝胶柱面上加一层（35cm）洗脱液，接上洗脱瓶准备洗脱。5洗脱 用规定的溶液（本实验用pH 7.0，0.01mol磷酸盐缓冲液）流过样品，使分子量不同的样品逐步分开并先后由柱床流出的过程称为洗脱。所用溶液称洗脱液。洗脱液放在贮液瓶（洗脱瓶）中并与层析柱相通连。洗脱时只要打开层析柱下口开关，洗脱液即可流出。洗脱过程中保持恒定的流速是柱层析获得良好分离效果的重要条件。因为凝胶层析的分离作用主要取决于分子扩散进入凝胶的机会，流速过快有些分子来不及在分子筛中分配而流出；过慢时已分离的分子会因扩散而混合。因而要保持适当的恒定流速。洗脱液的流速取决于它的静水压。静水压是指洗脱瓶中洗脱液的液面高出于层析柱出口产生的液体压力（或接触空气的两个液面间的高差），这个高度差越大，静水压越大，洗脱液的流速就越快。这个压力差可以调动，如提高洗脱瓶的位置或瓶中液面的增减；或者降低或提高层析柱出口的位置等，因此静水压又称操作压。由于静水压越大，洗脱液的流速就越快。在固定洗脱瓶与出口位置的情况下，静水压会在洗脱过程中，随着洗脱瓶中溶液减少液面不断下降而减少，难以维持流速的恒定。为了解决这个问题，Marriotte首次将洗脱瓶加塞塞紧，塞中插入玻璃管，使玻管下口深入到洗脱液的底部，这样洗脱液的静水压便等于此玻管下口的液面高出层析柱出口液面的高度（因为当洗脱瓶液体流出时，瓶顶形成真空，空气只从玻璃管中进入，玻管下口即为接触空气点），因此只要溶液不低于玻璃管下口，玻璃管口以上溶液的增减将不影响静水压，从而自动保持了流速的恒定，此洗脱瓶称为恒压瓶，也叫马氏瓶。当然，当洗脱液减少至液面低于玻管的下口时，便会失去作用，但这时可用及时加入洗脱液来解决。 在凝胶层析中，不仅要保持静水压的恒定，还要保持适当的静水压。这是因为G75以上的软胶胶体柔软易变形，对静水压仅有一定的承受能力，不同软胶的承受能力也不相同，静水压超过凝胶的承受能力时，最初流速会很快；其后随着静水压力过大将使软胶变形压紧，流速逐渐降低，最后甚至流不出。所以，保持恒定正确的静水压是凝胶层析时获得满意结果的必要条件。本实验中使用的G25属于硬胶，硬胶不易变形，受静水压的影响较小，实验过程中的流速可用恒压瓶下口橡皮管上的螺旋夹控制在0.5ml/min左右，随着洗脱液的流出，样品逐步被分开。用试管收集洗脱液，按顺序每管收集2ml。6检测 在收集的同时，检查蛋白质是否流出。于每管中取出1滴放在黑色比色板孔中（按编号顺序），再分别加入1滴20%磺酰水扬酸，如出现白色沉淀即表示蛋白质已流出凝胶柱，如此一直检查到蛋白质全流出为止。与此同时，再从蛋白质的管中取出1滴于白色比板中，加入奈氏试剂1滴，如蛋白管中不出现棕色，即表示蛋白质中的硫酸铵已除去。合并纯化后的蛋白质管以待用。以光密度值为纵坐标，以收集管的顺序号为横坐标，在坐标纸上绘图。可获具有一条洗脱峰的曲线，称为洗脱曲线，用以表示被分离物质流出的状态。7凝胶的洗涤及保存 由于凝胶对被分离的物质基本无吸附作用，所以无需“再生”，只要用洗脱液冲洗后即可连续使用。但因多次使用凝胶颗粒将逐渐沉积压紧，流速将减慢，所以使用一段时间后应倒出来，清洗后重新装柱。 凝胶暂时不使用可浸泡在溶液中，存放在4冰箱中。若放在室温保存应加入0.02%叠氮钠（NaN3）或0.01%乙酸汞等防腐剂，以防发霉。用时以水洗去防腐剂即可使用。凝胶长期不用，可用水洗净，分次加入百分浓度递增的乙醇溶液，每次停留一段时间，使之平衡，再换一下浓度的乙醇，让凝胶逐步脱水，再用乙醚除乙醇，抽干即可，或将凝胶洗净后抽干，在表面皿上30逐步烘干。实验四 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）【 原 理 】 带电的颗粒（蛋白质）在电场的作用下，移动的速度是： v Vq d6r根据此公式，在同一电场强度（v/d）和电极缓冲液（）条件下，带电的各种蛋白质成分，移动的速度决定于，各蛋白质的带电量（q）和自身分子的大小（6r）。若使各蛋白质成分的带电量（q）相近似时，则各蛋白质成分移动的速度就只决定于各蛋白质成分自身分子的大小（6r）。1967年Shapiro等人发现，在聚丙烯酰胺凝胶中加入阴离子去污剂十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS），不影响凝胶的形成，而蛋白质的电泳迁移率则主要取决于它的自身分子量的大小。 加入SDS之所以能获得如此的效应，是因为SDS能打开蛋白质分子间的氢键和疏水键，使蛋白质变性成为松散的线状。同时大多数蛋白质的每个氨基酸能与固定量的SDS相结合溶液中的SDS总量，至少要比蛋白质的量高3倍以上，大多数蛋白质与SDS按1：1.4（W/W）的比例结合，形成SDS蛋白质复合物。其结果：（1）由于SDS解离后带有很强的负电荷，致使SDS蛋白质复合物都带上了相同密度的负电荷，其电量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，基本掩盖了不同种类蛋白质同原有的电荷差异。（2）SDS与蛋白质结合后，改变了蛋白质原有构象，使所有蛋白质水溶液中的形状都近似椭圆柱形。不同SDS蛋白质复合物的短轴直径都一样，约为18nm，而长轴则与蛋白质分子的大小成正比。这样SDS蛋白质复合物在凝胶电泳中的迁移率，就不再受蛋白质原有电荷及其形状的影响了，而只取决于椭圆柱长度，即蛋白质分子的大小。需要注意的是：为使SDS与蛋白质能充分的按比例结合，必须将蛋白质间的二硫键完全打开。因此，在用SDS处理蛋白质样品时，必须同时用巯基乙醇处理。巯基乙醇是一种还原剂，它能使二硫键还原打开，并在有多余的巯基乙醇存在时，就不会再氧化为二硫键。蛋白质与SDS结合后的复合物都是易溶的，因而有利于电泳。为满足SDS定量地与蛋白质结合，这种聚丙烯酰胺凝胶电泳的凝胶及电极缓冲体系中都含有SDS，所以称为SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。1969年Weber和Osborn用此法测定了约40种蛋白质的迁移率，结果发现，蛋白质的迁移率与其分子量的对数呈直线关系：lgM = K1 bm M表示分子量，m表示迁移率，b表示斜率， K1表示常数即用此法可以测得蛋白质的分子量。实验证明，分子量在12 000200 000之间的蛋白质，用此法测得的分子量，与其它方法测得的相比，误差一般在10%以内，重复性高。此方法还具有设备简单，样品用量甚微，操作方便等优点，现已成为测定大多数蛋白质分子量的常用方法。应用此法测定分子量，是首先将几种已知分子量的标准蛋白质混合物，与被测蛋白质同时进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。然后测出各个蛋白质成分的迁移率，再以标准蛋白质的分子量为纵坐标，迁移率为横坐标，在半对数坐标纸上绘出一条直线型的标准曲线。若以普通坐标纸作图，则纵坐标应取蛋白质分子量的对数值。被测蛋白质的分子量只要测得迁移率即可从标准曲线上求出。Weber的实验指出，不同浓度的SDS聚丙烯酰胺凝胶适用于不同范围的蛋白质分子量大小的测定。如15%的凝胶适用于分子量在10 00050 000范围的蛋白质；10%的凝胶适用于分子量在10 00070 000范围的蛋白质；5%的凝胶适用于分子量在25 0002 000 000范围的蛋白质；3.33%的凝胶其胶孔径更大，适用于分子量更高的蛋白质的测定。使用时应根据待测蛋白质样品的分子量范围选择合适的凝胶浓度，以求获得好的结果。 实验中使用的标准蛋白质（Mark），应该选择那些分子量大小与待测蛋白质样品相近似的，应使其待测样品的分子量恰好在标准蛋白质的范围之内。此法虽然适用于大多数蛋白质分子量的测定，但对于一些蛋白质，如带有较大辅基的蛋白质（如某些糖蛋白）、结构蛋白（如胶原蛋白）等，由于不能定量地与SDS相结合，因而测定结果偏差较大。另外，由亚基（如血红蛋白）或由于两条以上肽链，（如胰凝乳蛋白酶）组成的蛋白质，在SDS的作用下将解离成亚基或单条肽链，其电泳后测得的只是这些蛋白质的亚基或单条肽链的分子量，而不是整个蛋白质的分子量。上述这些“特殊”蛋白质的分子量都不宜用此方法测定。若要使用时，也需要作对照实验。本实验选用分子量在10 00070 000范围的标准蛋白质，使用10%的聚丙烯酰胺凝胶，其配制方法主要参照U.K.Laemmli（1970）的方法，以板状、不连续电泳系统进行电泳。【 试剂和器材 】一 试剂1标准蛋白质（Mark）目前国内外均有厂商生产低分子量及高分子量标准蛋白质成套试剂盒，用于SDS PAGE测定未知蛋白质分子量。主要包括高分子量标准蛋白试剂盒，低分子量标准蛋白试剂盒以及自己配制的低分子量或高分子量标准蛋白质混合试剂。2连续体系SDSPAGE有关试剂：（1）0.2 mol/L PH7.2磷酸盐缓冲液：取0.2mol/L Na2HPO4溶液720ml，0.2mol /L NaH2PO4溶液280ml混合。（2）样品溶解液：0.01 mol/L PH7.2磷酸盐缓冲液，内含1%SDS、1%巯基乙醇、10%甘油或40%蔗糖、0.02%溴酚蓝。其用来溶解标准蛋白质及待测固体蛋白质样品。配制方法如下：SDS 巯基乙醇 甘油 溴酚蓝 0.2mol/L磷酸盐缓冲液 加重蒸水至最后总体积100mg 0.1ml 1ml 2mg 0.5ml 10ml（3）30%丙烯酰胺（称为凝胶贮液）：丙烯酰胺（简称Acr）30g，甲叉双丙烯酰胺（简称Bis）0.8g，加重蒸水至100ml，过滤后置棕色瓶，4保存可用23月。（4）凝胶缓冲液：SDS 0.2g，加0.2mol/L PH7.2磷酸盐缓冲液至100ml。4保存，用前稍加温使SDS溶解。（5）1%TEMED（N，N，N四甲基乙二胺）：取TEMED 1ml，加重蒸水至100ml，过滤后置棕色瓶4保存。（6）10%过硫酸铵（AP）：AP 10g，加重蒸水至100ml，每周新配，置棕色瓶4保存。3电极缓冲液：0.1%SDS、0.1mol/L PH7.2磷酸盐缓冲液。41%琼脂：琼脂1g，用上述缓冲液溶解至100ml 4保存。5固定液：甲醇：冰乙酸：水为1：2：76染色液：考马斯亮蓝R250 0.25g加上述固定液500ml，过滤后应用。7脱色液：冰乙酸：甲醇：水为2：9：9二 器材1夹心式垂直板电泳槽。2电泳仪。3微量加样枪。 三 材料1纯化后的球蛋白。【 操 作 】（一） 安装夹心式垂直板电泳槽（二）配胶及凝胶板的制备1配胶：分离胶（浓度为15）水 4.6ml凝胶贮液 10ml1.5 mol/L Tris-HCl pH8.8 5.0ml10SDS 0.2ml10%过硫酸铵 0.2mlTEMED 8 uL总计 20ml2凝胶板的制备：用细长头滴管将胶混合液加到两块玻璃板的缝隙内直至距离短玻璃板上缘0.5cm处，插入梳形样品槽模板（称“梳子”），为防止渗漏，可在上、下电极槽中的胶面上轻轻铺一层蒸馏水，但不能超过短板，以防凝胶被稀释。大约30min胶聚合，继续放置2030min后，倒去上、下电极槽中的蒸馏水，小心拔出梳形样品槽模板，窄条滤纸吸去残余水分，注意不要弄破凹形加样槽的底面。倒入电极缓冲液即可进行预电或准备加样。（三）样品的处理与加样1样品的处理 根据分子量标准蛋白试剂盒的要求加样品溶解液，自己配制标准及未知样品：按0.51 mg/ml溶液比例，向样品中加入样品溶解液，溶解后，将其转移到带塞小离心管中，轻轻盖上盖子（不要塞紧以免加热时迸出），在100沸水浴中保温3min，取出冷却后加样。如处理好的样品暂时不用，可放在20冰箱保存较长时间，使用前在100沸水中加热3rnin，以除去亚稳态聚合。2加样一般每个凹形样品槽内，只加一种样品或已知分子量的混合标准蛋白质，加样体积要根据凝胶厚度及样品浓度灵活掌握，一般加样体积为1015uL（即210ug蛋白）。如样品较稀，加样体积可达100uL。如样品槽中有气泡，可用注射器针头挑除。加样时，将微量注射器的针头通过电极缓冲液伸入加样槽内，尽量接近底部，轻轻推动微量注射器，注意针头勿碰破凹形槽胶面。由于样品溶解液中含有比重较大的蔗糖或甘油，因此样品溶液会自动沉降在凝胶表面形成样品层。（四）电泳分离胶聚合后是否进行预电泳则应根据需要而定，SDS连续系统预电泳采用30mA，60120min。在电极槽中倒入0.1%SDS PH7.2 0.1mol/L磷酸盐缓冲液，连接电泳仪与电泳槽，上槽接负极，下槽接正极。打开电源，将电流调至20mA，待样品进入分离胶后，将电流调至50mA，待染料前沿迁移至距硅橡胶框底边11.5cm处，停止电泳，一般需56h。（五）凝胶板剥离与固定电泳结束后，取凝胶板，卸下硅橡胶框，用不锈钢药铲或镊子撬开短玻璃板，在凝胶板切下一角作为加样标志，在两侧溴酚蓝染料区带中心，插入细铜丝作为前沿标记。将凝胶板放在大培养皿内，加入固定液，固定过夜。（六）染色与脱色将染色液倒入培养皿中，染色1h左右，用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰，即可计算相对迁移率。（七）绘制标准曲线【 注意事项 】1SDS纯度：在SDSPAGE中，需高纯度的SDS，市售化学纯SDS需结晶一次或两次方可使用。2SDS与蛋白的结合量：当SDS单体浓度在1mmol/L时，1g蛋白质可与1.4g SDS结合才能生成SDS蛋白复合物。巯基乙醇可使蛋白质间的二硫键还原，使SDS易与蛋白质结合。样品溶解液中，SDS的浓度至少比蛋白质的量高3倍，低于这个比例，可能影响样品的迁移率，因此，SDS用量约为样品量10倍以上。此外，样品溶解液应采用低离子强度，最高不超过0.26，以保证在样品溶解液中有较多的SDS单体。在处理蛋白质样品时，每次都应在沸水浴中保温35min，以免有亚稳聚合物存在。 3凝胶浓度：应根据未知样品的估计分子量，选择凝胶浓度。 4对样品的要求：应采纳低离子强度的样品。如样品中离子强度高，则应透析或经离子交换除盐。加样时，应保持凹形加样槽胶面平直。加样量以1015uL为宜，如样品系较稀的液体状，为保证区带清晰，加样量可增加，同时应将样品溶解液浓度提高二倍或更高。5由于凝胶中含SDS，直接制备干板会产生龟裂现象。如需制干板，则用25%异丙醇 内含7%乙酸浸泡，并经常换液，直至SDS脱尽（约需23天），才可按PAGE法制备干板。为方便起见，常采用照像法，保存结果。实验五 动物组织中DNA的制备【 原 理 】DNA是所有生物体的基本组成物质。真核生物DNA主要存在于细胞核中。制备DNA时应将细胞核膜打破方能释放出来。细胞中的DNA和RNA分别与蛋白质相结合，形成脱氧核糖核蛋白及核糖核蛋白。在细胞破碎后，这两种核蛋白将混杂在一起。因此，要制备DNA首先要将这两种核蛋白分开。已知这两种核蛋白在不同浓度的盐溶液中具有不同的溶解度，如在0.15mol/L NaC1的稀盐溶液中核糖核蛋白的溶解度最大，脱氧核糖核蛋白的溶解度则最小（仅约为在纯水中的1%）；而在l mol/L NaCl的浓盐溶液中，脱氧核糖核蛋白的溶解度增大，至少是在纯水中的2倍，核糖核蛋白的溶解度则明显降低。根据这种特性，调整盐浓度即可把这两种核蛋白分开。因此，在细胞破碎后，用稀盐溶液，反复清洗，所得沉淀即为脱氧核糖核蛋白成分。分离得到的脱氧核糖核蛋白，用十二烷基硫酸钠（SDS）使蛋白质成分变性，让DNA游离出来，再用含有异戊醇的氯仿沉淀除去变性蛋白质。最后根据核酸只溶于水而不溶于有机溶剂的特点，加入95%的乙醇即可从除去蛋白质的溶液中把DNA沉淀出来，获得产品。当细胞破碎时，细胞内的脱氧核糖核酸酶（DNase）立即开始降解DNA，如果在破碎细胞后不及时采取抑制酶活的措施，最后将会得不到任何DNA。为此，如在本实验中加入柠檬酸盐、EDTA等螯合剂以除DNase必需的Mg2离子，使DNase活性降低，并要求整个分离制备的过程均在4以下进行，以减少DNase的降解作用，最后加入SDS使所有的蛋白质（包括DNase）变性。当然如果希望获得更大分子的DNA时，则在细胞破碎后，及时加入SDS使蛋白质（包括DNase）变性，并加入蛋白酶K，降解所有的蛋白质成为碎片或氨基酸，及时阻止DNase的降解作用。DNA分子很大、很长，在水中呈黏稠状，但DNA链的双螺旋结构不宜小角度的折叠，使之DNA分子具有刚性，即分子是僵直的（stiff），小角度的折叠和压挤等剪切力，将使DNA断裂成碎片。为保证获得大分子DNA，操作时应避免急裂振摇，或过大的离心力。转移吸取DNA时不可用过细的吸头，不可猛吸猛放，更不能用细的吸头反复吹吸。大分子DNA的水溶液呈黏稠状，可以用玻璃棒缠起来。液体DNA只要防止DNase污染和高盐浓度条件下能在液体状态保存；抽干后的固体DNA，性质稳定，可长期保存。生物体内各部位的DNA是相同的，但取材时以含量丰富的部位为主，如动物的肝脏、脾、肾、血液、精子等。所有材料，必须新鲜及时使用，或放入20冰箱或液氮冷冻保存。DNA的含量及纯度可用紫外吸收法、定磷法及化学法等测定。【 试剂和器材 】一 试剂10.15mol/L NaCl0.015mol/L pH7.0柠檬酸钠溶液：称取8.77g NaCl，4.41g柠檬酸三钠（Na3C6H507 2H20），用约800ml蒸馏水溶解后，调节pH至7.0，最后定容至1 000ml。20.15mol/L NaCl0.1mol/L EDTANa2溶液：称取8.77g NaCl，37.2g EDTANa2溶于约800ml蒸馏水中，以NaOH调pH至8.0，最后定容至1 000ml。35%（W/V）十二烷基硫酸钠（SDS）溶液：称取5g SDS溶于45%（V/V）100ml的乙醇中。 4氯仿异戊醇溶液：按氯仿:异戊醇=24:1配制。5pH8.0 TE缓冲液或0.01mol/LNaOH：120mol/L TrisHCl，lmol/L EDTANa2。或取NaOH 0.4g加蒸馏水至1 000ml。695（V/V）乙醇1 000ml。775（V/V）乙醇1 000ml。二 器材1组织捣碎机。2玻璃匀浆器。3冷冻离心机。三 材料1冰、粗盐。2鸡肝脏【 操 作 】1本实验以鸡肝脏作材料（其他动物肝脏也可以）。实验前鸡应饥饿24h以上，以避免糖原的干扰。2用烧杯（500m1）放1/3体积的冰，加入少量水及约20g食盐，制成冰盐水。3将经过饥饿的鸡剪断颈部放血致死，迅速开腹取出肝脏，称取约1g浸入预先在冰盐水中冷却的0.15mol/L NaCl0.015mol/L柠檬酸钠溶液中。除去脂肪、血块等杂物；再用少量溶液反复洗涤几次，直至组织块无血为止。4将洗净的组织剪成碎块。先加入2m1 0.15mol/L NaCl0.015mol/L柠檬酸钠溶液，放在组织捣碎机中迅速捣成匀浆，再放入玻璃匀浆器中匀浆23次，使细胞充分破碎。最后加入0.15mol/L NaCl0.015mol/L柠檬酸钠溶液至5ml。5匀浆液在常温 6 000r/min离心15min，弃上清。在沉淀中加入4倍体积冷的0.15mol/L NaCl0.015 mol/L柠檬酸钠溶液，搅匀，按上述条件，离心弃上清。如此重复操作23次，尽量洗去可溶的部分（目的是什么?）。最后弃去上清，留沉淀。6将沉淀物悬浮于5倍体积的pH8.0，0.015 mol/L NaCl0.1 mol/L EDTANa2溶液中，搅匀，而后边搅拌边慢慢滴加5%SDS溶液，直至SDS的最终浓度达1%为止（应加多少毫升?），此时溶液变得十分黏稠，若不黏稠应重做，然后，加入固体NaCl使最终浓度达l mol/L。继续搅拌3045min，以确保NaCl全部溶解，此时可见溶液由稠变稀薄。7将上述混合溶液倒于一个EP管中，加入等体积的氯仿异戊醇，振荡10min。在室温3 000r/min离心10min（为什么可以在室温操作?），此时可见离心液分为3层：上层为水溶液，中层为变性蛋白块，下层为氯仿异戊醇。小心吸取上层水相，记录体积，放入EP管中，向水相中，再加入等体积氯仿异戊醇，振荡，离心，如此重复抽提23次，除净蛋白质。8最后1次离心后，小心吸取上层溶液（不要吸取下层氯仿），放入干燥EP管中，加入2倍体积预冷的95%乙醇。静置20min,10000r/min 1min,按200g/ml的浓度溶于0.01 mol/L NaOH溶液或pH8.0 TE缓冲液中。实验六 多聚酶链反应【 原 理 】通常的DNA扩增法是分子克隆法。首先要构建含有目的基因的载体，然后将其转入细胞后进行扩增，再用同位素探针进行筛选。这种方法，需经过DNA内切、连接、转化和培养等有关过程，操作复杂，一般需数周时间才能完成，而PCR基因扩增法只需几小时，就可用电泳法检出0.1微克基因组DNA中仅含数个拷贝的摸板序列，所以，这种基因扩增法又称无细胞分子克隆法。 PCR基因扩增是一种特定区段DNA的复制，其复制方式是以半保留形式进行的。PCR扩增法的DNA复制，必须有DNA模板、DNA聚合酶、DNA引物及四种dNTP。如图16-1所示，要扩增模板DNA中A-B区间的DNA片段，首先要设计二条寡核苷酸引物A和B，PCR扩增DNA的特异性是由这二条人工合成的引物质决定的。A和B片段的DNA序列是已知的，这是PCR扩增的必要条件，但A-B中间的序列未必清楚。A段和B段序列的长度一般为15-20个碱基，据此可用DNA合成仪人工合成与A、B对应互补的二个引物A和B，PCR扩增系统中的模板DNA经过高温变性分解二条单链后，又进行降低温（55-37），引物退火，与互补的模板DNA结合，形成局部的双链，这是DNA复制的固定起点，即延伸的固定起点。如图16-1所示，A和A结合，B和B相结合，退火的时间为12分钟。PCR扩增过程中，链的延伸具有方向性，以引物为固定起点，延伸才能进行。目前使用的DNA多聚酶，合成DNA的方向都是从5端到3端。当温度升至中温（6072）时，在多聚酶的作用下，四种dNTP会迅速以旧链为模板合成新链，其合成方向，若以A和B引物而言，都是从5端到3端的方向进行。PCR扩增片段的长度范围，从数百个至2kb个碱基。在此扩增中，真核细胞和原核细胞没有明显的差别，其扩增的长度由引物来限定。模板DNA经过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段的循环过程。每循环一次，模板DNA的拷贝数加倍，第一次循环由一条模板双链DNA变成二条；第二次循环，则变成4条；第三次循环，就变成8条，以几何级数扩增下去，一般扩增循环是30-35次，最后形成特定的DNA片段。PCR扩增DNA特定区段，是由人工合成的二条引物决定的，这是PCR扩增的关键。【 试剂和器材 】一 试剂1Taq DNA多聚酶在PCR 100l反应体系中，Taq DNA多聚酶用量为12.5单位由于DNA的不同和引物的不同，以及其他条件上的差别，则多聚酶的使用量亦有差异。如果酶的浓度偏高，会出现非特异性产物堆积；如酶的浓度偏低，则合成产物的量少。因此，常常根据电泳的结果决定酶的最佳用量。2三磷酸脱氧核苷酸（dNTP）dNTP 用 NaOH 贮存（pH7.0），最初的贮存液可稀释到10mmol/L，分装后存放于20冰箱内。使dNTP工作储存液为lmmol/L，其使用浓度为20200mol/L之间，这四种的dNTP必须以当量浓度配合，以减少错配误差。在PCR反应中，使用低dNTP浓度，可减少在非靶位置上启动和延伸时核苷酸错误掺人。决定最低dNTP浓度是根据靶序列的长度和组成。例如，在1001的反应体系中，四种dNTP的浓度使用20mol/L，基本能满足合成2.6gDNA或10pmol的400bp序列。使用低dNTP浓度，能够高灵敏扩增ras基因点突变的等位基因。3引物 引物的浓度一般为0.10.5mol/L之间。引物的浓度偏高，会引起错配和非特异性产物的堆积，同时能增加生成引物二聚体的几率。非特异性产物和引物的二聚体，竞争使用酶，引物及dNTP，结果是特异性产物的