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基本原则的实时定量PCRManit得来,伊克巴尔S Shergill等级,Magali威廉姆森,林德Gommersall,帕特和Hitendra Neehar RH的等级。实时定量PCR允许敏感的,具体的定量分析、重现性好核酸分子。自从它实时定量PCR的介绍,已经颠覆了传统的领域分子诊断技术和技术被用于一个迅速扩张的数量的应用。这个令人兴奋的新技术让分子诊断学的转变方向高通量、自动化技术与较低的返工时间。这篇文章回顾了实时PCR基本原理,同时也描述了这多种不同化学物质是可行的: 这SYBR双链的DNA-intercalating剂的研究情况、水解过程进行了探讨,并就绿色1、双杂交探针,分子灯塔和蝎子探头。定量分析方法讨论了除了竞争的工具在市场上。的例子应用这一重要和最多才多艺的技术被提供在复习。专家破产法组分。核。即使是一份特定的序列可以在PCR放大检测出。PCR反应生成份DNA模板指数。这一结果在定量开始的数量关系目标序列的金额与PCR产物在任何特定的周期积累。由于发现的多聚酶反应抑制剂模板、化学试剂的限制或积累钠分子的,PCR反应最终停止产生的效益在以指数速率模板(例如,高原相位)作出定量的终点PCR技术的产品不可靠的。因此,复制反应可以生成不同量PCR技术的产品。只有在这个指数PCR反应阶段它是可能的为了确定外推回来的起始数量的模板序列。他们测量PCR产物积累(即实时定量PCR)允许在指数相定量的反应,因此消除变异的发生与常规PCR相关。自从第一个文件的实时性PCR1,它已经被使用了一个不断增加和多样的数量的应用包括mRNA表达谱的研究,DNA复制在数量或病毒基因组的测量DNAs2胜7负),allelic歧视截流式合流制8,9,表达的分析具体的接头的变体13基因和基因表达在paraffinembedded14、15组织和激光捕获microdissected细胞,辍学,13。背景和方法论实时定量PCR是可靠的产生的产品检测与测量在每个周期的PCR的过程,这是直接成正比的数量了吗开始之前的模板PCR的过程。荷兰和同事证明aquaticus的耐高温酶鲸(例如,Taq DNA聚合酶)有5个为3exonuclease活动。该集团也显示app的目标,探索在PCR核酸酶的活性Taq 5的聚合酶能被用来检测放大的targetspecific产品20。一个核苷酸探针,这被设计为杂交在吗目标序列,被导入PCR分析检测。该探头是在它贴上32P 5在它的终结,是nonextendable结束3确保它不能作为底漆。退火探测器的一股PCR产物在此过程中,放大产生了适合核酸外切酶基质的活动。同时,在放大、5到 3倍。Shergill等级的等级,威廉姆森,Gommersall及派特破产法组分210专家。核。5(2),(2005)Taq DNA聚合酶活性(当酵素延长从上游底漆的境界探测器)堕落成小碎片探测器能分化从undegraded探针。这依赖于聚合确保乳沟只有探测器的发生目标序列被放大。PCR、app的后我的理解是:探测器测量,采用薄层色谱法从独立完整的探针。app碎片fluorogenic dual-labeled寡核苷酸的引入允许post-PCR探针的消除处理分析探头的退化21。探测器已经是个记者萤光染料在5一端是quencher染料附着在3结束。当探头是完整的,离的很近的quencher大大降低了荧光发出记者染料。发射荧光信号只是在暴露探测器的,基于荧光共振能量转移(烦恼)原理22。在实时定量TaqMan一fluorogenic化验TaqMan nonextendable探针用于(图1)(23)。探测器荧光染料有记者在它5一端是quencher染料在其3列车的终点站。如果目标序列现在,fluorogenic探针如果下游之一本册站点和裂解核酸酶的活性的5Taq聚合酶的酶在扩展阶段的PCR。当探头是完整的,烦恼会发生的原因,了荧光排放记者染料吸收淬火染料。通过Taq解理探测器的聚合酶在PCR分开记者和quencher染料,从而增加了荧光从前者。此外,app移除钢绞线的探头从目标,允许底漆延伸到坚持到底的模版,从而没有扰乱与指数累积的PCR产物。另外记者染料分子从他们的各自的裂解探针在每个周期的增加,导致荧光强度成正比的数量的amplicon产生了。各种各样的可用于实时PCR是化学反应随后描写进行综述。使用任何发达的化学成分分析,增加的荧光在PCR反应排放中可检测到通过一种改进的thermocycler实时。计算机软件的情节建构使用荧光光谱放大中收集的数据,这些数据PCR扩增(图2)。图2显示一个代表放大情节和定义了与之相关的重要条件。底线是:基线PCR循环定义为在这一过程中记者的荧光信号是积累,但都在限制的检测仪器。默认情况下,计算机软件可设置底线周期三至15;然而,这通常需要改变手动操作。Rn:一种电脑软件程序的计算出Rn使用Rnf方程- Rn代码,在那里Rnb = Rnf是荧光发射的产品在每个时刻的点和Rnb是荧光光谱的基线(23、24。Rn价值观的绘出了与循环数。在早期的周期PCR扩增, Rn的价值不超过底线。阈值:任意的阈值是由电脑,基于变异性的基线。它是计算为ten-times的标准偏差平均信号的基线荧光周期信号之间的三岁到15岁之间。一个荧光信号,检测到以上门槛,被视为一项真正的信号,可以用来定义阈值周期(Ct)对于一个样品。如果需要,可以手动修改阈值每个实验的,所以它的指数放大的地区在所有放大的阴谋。Ct:这是定义为小数PCR循环数的记者荧光大于最小的发现呢水平(例如,阈值)。Ct是一种实时PCR的基本原理,是一名宇航员在提供正确的关键部件并可重复的数据1。存在更多的模板,在开始的反应导致较少的周期数到达的时间点,荧光信号被记录为达到统计上的显著水平24以上背景。这个Ct价值总将发生在指数阶段的目标扩增, 发生在19世纪80年代早期周期PCR技术。作为反应部件的速度限制,成为目标PCR扩增反应减少,直到不再是过去的中国了在以指数速率产生模板(高原期)没有或者很少有提高PCR产物。这是最主要的原因是一种更可靠的测量Ct中开始拷贝测量的数量比一个端点的金额PCR产物积累。在指数期,没有反应,因此Ct部件都是限制价值观是很可再生为复制的反应与复制数相同的开始。绝对定量标准及两种方法可用来量化实时PCR,standard-curve或绝对的定量分析和相对定量分析。Standard-curve或绝对的定量分析如出土文书所见,Higuchi的情节和同事的原木的字母目标复制数为一套已知标准(5 -或串行稀释10倍)和Ct是一条直线(标准曲线)1。定量量的目标“未知的样品感兴趣的是完成测量Ct与用标准曲线确定开始拷贝号码。最常见的来源已知的样品是一个质粒为感兴趣的基因标准曲线生成基于串行稀释的一个起始金额。另一种选择,且更容易产生质粒不在,如果是使用一个合成single-stranded核苷酸为整个感amplicon。这个方法的优势在于它有明显提高获取一个简化的过程中为amplicons标准曲线多达100个英国石油公司(bp),包括大多数实时PCRamplicons。此外,它也不易偏见的时候由于被分光光度计定量的相对的纯度这寡核苷酸。连同更精确的测量可能性的标准,并对其具体的计算因此,中国的间谍/鼹鼠寡核苷酸(份数),这是不可能的事近似的份数在上面的模板未知样品,虽然不是从绝对副本号码。最后一种选择一个标准曲线法是使用一个细胞线与一个已知的复制数或表达水平的基因的兴趣。标准曲线法是用于环境当绝对是至关重要的调研人员定量(例如,在测量小数量的基因可以在几个或许多样品25、26)和在定量的病毒载量27-29。相对定量也被称为相对定量比较阈值方法(2-Ct法)。该方法消除了这个需求对标准曲线和数学方程用于计算相对表达水平的一个目标相对于参考控制或校验如nontreated样品或RNA从正常组织或样品,在时间上的一个time-course零研究。目标基因的数量的样品,标准化内生家政基因和相对的正常化文章介绍了由2-Ct,被赋予了,在那里Ct =Ct(样)-Ct),Ct(校验的Ct的目标基因扣减Ct家政基因。因为这计算是正确的,为了获得可靠的结果,它当务之急是放大效率的客房管理部吗和目标基因是一致的,或在90%以上。这可以通过看如何建立Ct(的两个样品和校验)随模板淡化。如果情节的互补DNA(一)与Ct稀释接近于零,这将意味着efficiences的目标和家政基因都很相似。如果一个家政基因无法找到其放大效率是相似的目标、标准曲线法是那么可取。另外,新底漆可以被设计和/或优化一个类似的效率达到的目标和家务基因amplicons。家政基因和归一化在实时定量PCR实验具体错误将会介绍了细微的差别是由于在首发的金额RNA的RNA,质量上的差异,一或效率合成和PCR扩增。为了尽量减少这些为sample-to-sample错误和正确的变异,一个细胞RNA是同时放大与目标,这服务对作为一个内部参考其他RNA价值观可以正常化。最常见的基因用于正常化,基因,是-actin称为家事,细胞骨架蛋白,glceraldehyde-3-phosphate),脱氢酶(GAPDH组合酶30,rRNA分期核糖核酸(RNA)。这些基因应该以一种恒定理论上被表达水平在不同的吗一个有机体,组织的各个阶段的发展状况,并他们的表达水平也应该保持相对恒定的不同的实验条件。然而,所有这些家务基因是完美的。有证据表明,GAPDH表达水平的变化,通过血糖,胰岛素,热休克和细胞增殖率和-actin水平也可以改变通过实验rRNA治疗31-35.生产较少可能不相同条件下影响mRNA转录36,37。然而,它并不总是很具代表性的总数在一个细胞mRNA人口是一个多rRNA表达比mRNA更高层次。其它替代家政基因已经被提出,但没有被完全满意没有一种单一的明确的参考和基因已被确认迄今为止。有些作者建议使用几种在一次实验家政基因,平均水平基因表达的多重家事都可以使用38归一化。重要的是,选择的基因,为每个具体家政实验时必须十分小心谨慎的可靠结果取决于选择的最相关的家务根据细胞基因的兴趣、具体试验的治疗。Amplicon检测两个一般来说,化学反应是可得到的。这些包括doublestranded(ds)DNA-intercalating代理(dna结合染料)和荧光探针。前者包括SYBR绿1或ethidium溴化,是最简单且最具性价比的安家amplicon-specific标记方法为探针杂交不是必须的。只有当SYBR插层连接绿色1到dsDNA。荧光信号的强度,因此是dsDNA依赖的数量存在于这种反应。该方法的主要缺点是,它是不具体自从染料中形成的对所有dsDNAs裹PCR非特异性PCR反应(即产品和primer-dimers)。与fluorogenic探针,由于非特异性扩增mispriming或primer-dimer神器不产生信号作为具体品种间杂交探针和模板是必要的对荧光光谱。同时,fluorogenic传感器贴上不同的染料,因此,识别的记者允许检测的amplicons可能已经产生了由一个或几个底漆,在一个单一的PCR反应双-多元化的实时PCR的术语。然而,不同的探剂必须开发检测不同序列。现在的各种化学反应进行详细描述。dsDNA-intercalating代里(dna结合染料)1是一个nonsequence-specific SYBR绿色小槽fluorogenic链球菌那intercalates进dsDNA染料(它是我的没有绑定single-stranded DNA)(图3)。SYBR绿色1展品少在溶液中荧光当绑定但能发出强烈的荧光信号在绑定到dsDNA39。增加在荧光信号发生的期间当DNA聚合和这些数字是变性。荧光测量是在年底进行每一步的伸长PCR循环监测不断增加数量的放大DNA。这种技术的优势它是相对便宜的,因为它能被用于任何副太阳镜底漆可以是任何目标。然而,就像任何出现的dsDNA产生荧光,特异性为分析有很大的影响减小了的非特异性PCR产物扩增和primer-dimers40。融化产生和比较曲线绘制荧光为温度的函数)利用变异(罗氏分子诊断学;或RotorGene,聪明,iCycler循环仪,Mx4000)是一个不错的方法增加的特异性反应40。特点融化峰熔化温度(Tm)的amplicon能够使这个游戏有别于放大制品,融化在吗在较低的温度下更广泛的山峰上。它是可能的以上的软件获得primer-dimers荧光的融化温度但低于目标。另一个可控问题是,再amplicons创造一个更强的信号。通常,SYBR绿色是用于singleplex反应;然而,再加上熔点分析时,可用来多元化的反应。绿色的SYBR 1反应已用在许多场合(如病毒载量检测方法41细胞因子quantifaction中【42 - 44】)。水解(例如,TaqMan探针探头)概述了该化学早些时候已经进行综述(图1)。一个正向和反向底漆和一个探针被使用。分析的效率主要取决于5至3核酸酶活性最常用的酶Taq20但是任何聚合酶酶在5核酸酶活性可以使用45。有一个核苷酸探针的共价保税记者quencher荧光染料染5和3结束后,分别。各种各样的荧光记者染料也有使用包括6-carboxyfluorescein tetrachloro-6-carboxyfluorescein(FAM),(我们),hexacholoro-6-carboxyfluorescein(十六进制),或维克。要么6-carboxytetramethylrhodamine Quenchers包括(TAMRA)或4 -(benzene-4-carboxylic dimethylaminoazo)酸(DABCYL)。当探测器是完整的接近记者和quencher忧心忡忡,染料允许荧光不发生。在PCR如果放大探测器到目标聚合酶和Taq满目疮痍的探测器,允许增加荧光光谱。荧光强度的增加平方成正比的数额amplicon产生的。这TaqMan化学是目前应用最广泛的实时PCR检测和已经被使用了多种目的32,46岁,47。TaqMan小groove-binding探针有最近被发展出来。在这种化学反应、标准TAMRAquencher是3号位,取而代之的是结束nonfluorescent quencher和未成年人groove-binder分子也成立3号位,列车的终点站。后者稳定复杂的probe-target由折叠进了小凹槽dsDNA。此外,Tm的探头增加时,允许使用的很短的oligoprobes(14个核苷酸在长度),并提供更准确allelic歧视。因此,TaqMan小groove-binding探针检测来说是很理想的单身核苷酸多态,49岁的48和定量分析methylated等位基因(约50。二元杂交探针该方法已令人信服地证明研究使用变异仪器(图4)。两个杂交使用探针-一个携带了捐赠fluorophore结束在其3贴上,另一个是在其承兑人fluorophore 5结束。后两个探针杂交变性步骤,对他们的目标序列在头尾安排在退火步骤。这使两种染料,在近距离允许变得忧心忡忡。捐赠人之一。本文介绍了染料的能量传递,允许另一方消散荧光在不同波长。测量荧光成正比DNA合成的数量在PCR反应。这个反应的特异性,因此是增加荧光信号只是发现当两个独立的探头杂交以它们的正确目标序列。该方法具有广泛用于检测后的极小残留病变治疗51和病毒载量,52岁,有54个量化53。分子灯塔还含有共价捆绑荧光淬火染料single-stranded两端的DNA分子。然而,他们设计的目的也是采取一种发卡或同时在溶液中stem-and-loop结构带来的自由荧光染料和quencher,在近距离为变得忧心忡忡发生(图5)55。循环部分的分子互补核酸分子和目标阀杆是由互补序列退火的手臂两头的探针序列。附近的fluorophore和quencher的在这个发夹配置抑制记者荧光。当探测器hybridizes顺序回路中,一个互补的核酸目标序列中酸的退火步,一构象突变发生交火,茎分开。这样就导致了线性结构,从而从flurophore分离的quencher不发生染料(烦恼)和增加荧光污染物排放。一种新的杂交发生在每个周期的退火一步合成法和强度荧光显示amplicon的数量在积累以往的轮回的尽头。分子灯塔是保持不变的而且他们必须rehybridize在PCR目标序列每个周期为荧光光谱。分子灯塔是特别适合于识别56-58点突变。蝎子类似分子航标、蝎子采取一种stem-and-loopfluorophore配置5quencher和第3(图6)。具体的探针序列是持有在发夹弯的循环,这是连接到5的序列PCR底漆终点站吗由一个nonamplifiable单体(称为PCR塞)。这从化学改性的stemloop防止PCR复制序列嫉妒心强的蝎子的质疑底漆。在PCR、蝎子推广,形成amplicon底漆。在退火阶段,在具体的探针序列蝎子的尾巴卷回杂交配套amplicon目标序列中,因此开放的发夹弯循环。这就防止了荧光从被熄灭,信号被观察到的59。作为蝎子之尾,amplicon现在的部分同一缕DNA、效率与公平的互动是分子内。这些的好处是源自于这一事实,探测器的元素物理上的耦合到底漆元素,这意味着吗导致的反应是一个unimolecular信号的产生事件。这与电压的碰撞与要求其他技术,如TaqMan或分子灯塔。unimolecular重排的好处是显著的有效的反应是瞬时和荧光信号强多了。同时,并得到更好的识别特异性是达成以蝎子。蝎子探针已经被用于病毒载量和突变检测60支全垒打,61。双蝎子一个变种的蝎子。然而,蝎子(或形成鲜明对比),fluorophore分子灯塔分离和quencher染料在不同和补充oligonucleotides。蝎子的优势是双的quencher明显增高,分离的记者fluorophore,减少fluorophore淬火当探测器是注定要在目标上,从而提高信号强度比传统蝎子62。amplicon底漆、探头及设计应该去呵护备至的设计成的分析方法。引物,进行了探索和amplicons被设计来辛苦的规格和TaqMan系统提供了它自己的底漆/探针从应用生物系统设计软件被称为底漆表达出来,这可能是使用最广泛的耐药性为开发设计实时定量PCR扩增程序考难。Primer3,一个自由的程序从麻省理工技术(MA),美国),也可以被用来产生良好的实时PCR检测,包括设计结合了内在的杂交探针。amplicon PCR产物的对应该合理可能是小的,英国石油公司(bp)的长度通常为设计的肥料使用探针杂交(和 1 - 2C)。特异性的底漆的最小量是通过选择底漆那只有一个或两个G / Cs内在过去的5核苷酸3结束。如果使用的是一我的方法,SYBR绿色PCR引千万不要形成一个可观的primer-dimer波段。一个甜美的曲线分析每一种产品的才能确保观察到的荧光信号是那里的理想的PCR产物。在mRNA用杂交表达截流式合流制探头,探头顺序应该跨度的子/子边界如果可能的。有8 - 10C探测器Tm的高底漆可以是确保探测器完全化在底漆延伸。TaqMan探针不应包含一个G在他们的5由于淬火效果结束的G在这个问题上的立场记者的荧光,甚至在探头暴露。多元化的实时PCR这个词是多元化的实时PCR用于描述使用多重fluorogenic探针的歧视的数倍在一个单一的amplicons管。多路复用的主要优点在打分析能力提供内部控制,低成本和保存的重要试剂珍贵的样品。对该技术的主要限制已经有限的可用的数量、荧光发射荧光团淬火染料及常见的用在实时的工具一个单色光源。引入nonfluorescentquenchers固有荧光,它们没有,已成为突破,已允许增加了很多的光谱特性使用fluorogenic每反应进行了探讨,并就可辨。初始实时包含过滤器,以最小化优化仪器重叠的发射光谱从荧光团。更新系统有使用,无论是多个发光二极体寿命整个可见光谱,或者一个钨灯,散发着光在一个广泛的范围的波长。然而,尽管有这些进步,只有四色多元化的反应通常是可能的63岁,64,其中一种颜色可能会被用作一个内部控制。最近的一种进步的注意,这是关键因素能量转移的组合荧光标签65岁,66,将会有所帮助提高实时PCR多元化的发展。现有的设备有各种各样的工具在市场上,每一个有自己的个性特点的(表1)。伟大的时必须十分小心选择哪台仪器购买这一点是很重要的比赛,仪表的能力实验室的需求。成本不应该是唯一的因素时,决策提供了科学依据较便宜的机型选择;无法补偿方差的估计在光学系统,因此没有能够检测小的差异。提高企业的生产率,仪器的可能更重要的是必需的。ABI棱镜7700序列的检测系统(SDS)应用生物系统公司是第一个从投入商用thermocycler实时PCR的,但是现在已经停止。荧光波长雷射光连续从500-660海里允许检测多元化PCR。这ABI棱镜7700最近已经被英国棱镜7900HT规格,具有相似的SDS 7700但全部自动化和设计,特别是对于非常高通量的应用程序(384个样品每运行)。另一个近期引进的是便宜的ABI棱镜7000 SDS标准。它保留了Peltier-based于96孔块热循环7700格式的,但是代替ABI激光与tungsten-halogen盏同时进行阐明了所有样品威尔斯。该软件提供的仪器多用户友好的且是微软基于窗口,它允许容易的出口数据和放大情节。其中最主要的优势ABI工具是数据的收集从一种被动的参考信号的正常化各个反应为之光学系统。此外,应用生物系统的发射应用生物系统- 7500 7300真实的PCR系统,它代表的时间更少昂贵的选择。从廉价的变异的罗氏分子生物化学品归纳用一条蓝lightemitting荧光激发二极管,读者是三硅光电二极体与不同的波长检测的过滤器,允许光谱特性不同的荧光团。因此,多元化的PCR,可以进行。一个完整的PCR循环运行30 - 40表现在20 - 30分钟;然而,只有一个有限数量的样品(最高32)可以分析,同时进行。分析了作为变异结果所表演的专一性甜美的曲线,它使得使用的SYBR dsDNA-binding染料等绿色我更可靠。然而,作为样品必须放置在毛细管中一样反对的管子,它是实践研究较少调查员。从BioRad智商的iCycler仪器设备钨-卤素灯允许励磁广泛的荧光团(400-700海里)。它能多元化的四种不同荧光团每样本管。同时,它具有光学模块允许荧光光谱中被看到课程的PCR扩增。此外,96个样品同时,从而提供一个跟踪快速的分析方法。一个最近启动了模块允许它放大384个样品任何一个时间。Mx4000(Stratagene影城的)可探测的数倍化学成分分析,包括TaqMan荧光PCR、杂交探针和分子的航标。光源的Mx4000系统是一个石英tungsten-halogen灯,生成广泛范围的350-750海里,激励的存在四种光电倍增管与探测范围350-830海里。该仪器是理想的表演影城PCR。重要的是,该系统包含一个完整的个人独立于计算机操作仪器嵌入式处理器,这给了一些保护,防止数据丢失。聪明的循环仪(Cepheid)也检测多个荧光PCR的化学物质。与多达96独立可编程的反应网站,聪明的循环仪可以同时进行运行多个实验,对不同协议和在不同次。这使多个用户使用智能循环仪同时进行。四个不同的荧光团即可在各个反应检测。转子基因3000,设计了由编的研究,是离心热循环仪可媲美光- 循环仪。它使用四个不同的发光二极管光在来源,兴奋和530,585 470海里。625励磁采用六个过滤器和检测在photomultipliers 510,555、610、660,580和610海里。该仪器的设计对所有其他截然不同仪器仪表:实时吗在标准的反应进行了microfuge管36 -或72-well内转子觅到500每分钟转速。这是equilibration意味着,以消除任何时间和温度变化的非均匀性,并sample-to-sample以内0.01C是宣称。专家意见实时PCR技术的引入改变了分子诊断领域,并启用分子诊断的转变,向高通量,自动化技术与较低的返工时间。它允许敏感、针对性、可再生的量化mRNA的。实时PCR检测法具有非常大的动态范围的量化的对数几十年,7 - 8高技术敏感性( 5份)和高精度( 2%的标准32偏差)。而且没有一post-PCR步骤是必要的,这样的crosscontamination避免了由于PCR的可能性产品。实时定量PCR的缺点与常规PCR包括相比这一事实:Amplicon尺寸不能监测 没有开放系统现有仪器有限 多路复用能力几个系统和一些fluorogenic是不相容的化学实时PCR技术是仅作为可靠的陪伴控制及相关品质保证计划。这主要包括质量标准和选择与客房部的基因(寻找理想的家政基因或议定书中),使用适当的控制标准曲线及需要完全优化、确认和评估与每一位新检测攻击以前标准化检测。没有这样的关怀,实时PCR将提供的一种巨大量的速度,但不准确的数据。五年的观点确认选择基因表达水平微阵列实验将继续进行使用实时PCR方法6867岁。这是因为目前的芯片技术需要大量的原材料和显示只有有限的动态范围为量化。因此,两者的结合技术,其中基因的筛选进行其所涉及的疗法和精确的量化和高通量筛选进行实时PCR是最理想的方法。同样的,实时PCR技术将会继续被结合先进了显微解剖技术13或核酸,辍学paraffin-fixed档案样品得到第14条、第15条。这检测和分析的最小残余疾病和病毒负荷不均匀,将会仍然是一件重要的应用51,69。而且,可以测量或DNA复制数基因表达在特定的细胞与困难和是孤立的目前只有在非常小的数值。实时技术将应用于临床样品的分析,以帮助临床医师吗病人的预后与管理。结合胎儿细胞分选技术从母体或者脱氧核糖核酸(DNA)循环利用实时PCR将使早期产前众多的先天性疾病诊断的使用最小创伤性的方法70 - 72。对改进的设计实时仪表和推进的组合标签将会大大增强忧心忡忡未来的多元化实时PCR。此外,主要的生物技术公司最近正在项目allelespecific吗使用的所有单自动发达核苷酸多态中能识别排序程序。这些检测很可能将成为一个重要的领域分子诊断学在未来。关键问题引入实时定量PCR技术革新了分子诊断学的领域,已经启动了转移的分子诊断学向高通量、自动化技术与较低的返工时间。dual-labeled引入聚核苷酸fluorogenic进行了探索和发现Taq DNA聚合酶有5至3exonuclease活动已允许快速发展的实时定量PCR。门槛循环(Ct)的定义是小数PCR循环数的记者荧光大于最小检测水平(例如,阈值)。Ct是实时PCR的一项基本原则,是生产精密的重要组成部分并可重复数据。两种不同的方法通常是用来量化计算得到的结果实时PCR - standard-curve或绝对的定量分析方法和相对定量分析也被称为比较阈值分割方法(2-Ct法)。化学发现几个可供选择:双链dna结合剂(DNA-intercalating例如,SYBR染料),水解(例如,TaqMan探针杂交)、双探针分子航标和蝎子的探针,探头。在实时定量PCR、规范化,家政基因公认的方法intersample变化更正不同的实验(即细微差异在大量的输入RNA和细微的差别在PCR扩增效率)。大时必须十分小心选择并实时检测仪表买的,重要的是要匹配的仪器与实验室能力的需要。参考1 Higuchi R,G,Dollinger Fockler C,沃森:实时PCR分析r动能监测的DNA扩增反应。11日,1026-1030生物技术(1993)。2 Kariyazono T,Ihara H,哦,K孙俐。22q11.2快速检测的删除与定量实时PCR。组分。细胞。15,71 - 73探针(2001)。3 Nigro JM、高桥马,Ginzinger DG孙俐。19q 1p和检测的损失oligodendroglioma由定量微卫星分析、实时定量PCR检测。是。杂志。4、j .1253-1262(2001年)。4 Ginzinger DG、戈弗雷特,Nigro J孙俐。在DNA复制数的测量利用微卫星位点定量PCR分析。60岁,5405-5409癌症(a)(2000)。5 Ingham 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