植物检疫学论文

梨火疫病研究进展摘要：梨火疫病菌是我国禁止进境的植物检疫性有害生物，是一类重要的细菌性病害。梨火疫病主要的寄主是蔷薇科仁果树上的危害重，传染快的一种毁灭性的细菌性病害。关键词：梨火疫病 进境检疫性 细菌病害 研究进展1 梨火疫病菌的简史与分布1878年，首先由Burrill报道，在纽约发生，后来由Erwin F.Smith 命名，是第一个被确定的植物细菌性病害。主要分布在北美洲和西北欧。近年来在中欧，地中海，东南欧及大洋洲和亚洲部分地区也有发生，现已有40余个国家有分布。1997年，澳大利亚报道有该病发生。另外在日本北海道（1972）和韩国(1997）发生的“梨细菌性枝枯病”已从生理生化，致病性和分子生物学等方面都证明与梨火疫病相似，但在分子检测时稍有差别，韩国人称之为“亚洲火疫病”。2 梨火疫病病原生物学2.1 病原菌 病原为Erwinia amylovora (Burrill)Winslow et al，又称解淀粉欧文氏菌，属薄壁菌门肠杆菌科，直杆菌，有荚膜，周生鞭毛，能运动，大小为0.91.81.8 0.61.5?m，多数单生，有时成双或短时间内34个呈链状。革兰氏染色阴性，兼性厌氧，过氧化物酶阳性，氧化酶阴性。在蔗糖营养培养基上，菌落白色，粘性，圆顶状，27培养2天，菌落直径37cm，有1稠绒毛状的中心环，表面光滑，边缘整齐。水解明胶，不水解酪蛋白，不还原硝酸盐，不产吲哚和H2S，生长最适温度2527，最高温度3334，生长所需的温度范围为637，致死温度4550。病菌世代时间在25下为74.9分钟，最适 pH为6。梨火疫病菌以简单的细胞分裂繁殖，一个细胞在条件适宜时，3天内在寄主植物组织中能达到109细胞，每个细胞都是一个侵染源，感染寄主而引起病害的发展。除蛋白酶外，病菌不产任何有助于侵入寄主的酶，主要是在环境条件适宜时，通过胞间组织侵入薄壁组织的病菌产生胞外多糖。胞外多糖在病害发展过程中起重要的作用，其是菌脓的重要成份。菌脓的理化性质随湿度变化而变化，干时皱、硬，大时膨胀易被雨水扩散，中等湿度的菌脓粘易被昆虫、风传播。2.2 梨火疫病病菌危害症状 梨火疫病最典型的症状是花、果实和叶片受火疫病菌侵害后，很快变黑褐色枯萎，犹如火烧一般，但仍挂在树上不落，故此得名。目前国际上将其症状据受侵害的部位，分成5个阶段。2.2.1 花枯萎 病原直接侵染开放的花引起花枯萎。一般发生于早春，病菌直接从花器侵入，初为水渍状斑，花基部或花柄暗色，不久萎蔫。病菌可扩展至花梗及花簇中其它的花；在温暧潮湿条件下，花梗上有菌脓渗出。随着枯萎发展，花梗、花等变褐至黑褐色，在某些情况下仅限于花梗，条件适宜时可继续侵染并杀死小枝并形成小溃疡斑。 2.2.2 溃疡枯萎 溃疡枯萎是指前一季越冬溃疡边缘的病菌重新复活的结果。最初的症状是在复活的溃疡附近的健康树皮组织上出现窄的水渍状区，几天后，树皮内部组织出现褐色条斑，随后病菌侵入附近的繁殖枝内部并引起萎蔫死亡。这些枝条特别是嫩枝与下面谈及的枝枯萎有明显区别，即在萎蔫之前枝尖芽褪色（黄至桔黄色）。 2.2.3 枝枯萎 花被侵染后，枝和嫩枝是最易感病的植物部位。细菌直接侵入前 13叶的枝尖，然后杀死整个枝条及支持枝。最初症状是枝尖萎蔫，但萎蔫前不褪色，象拐杖状。枝枯萎发展很快，条件适宜时，几天内可移动1530cm以上，造成整枝死亡，病枝、枝皮、叶通常变黑。潮湿时，枝条上出现菌脓。生长后期，终芽前出现的枝枯萎一般不会萎蔫，且仅在枝的最上部出现坏死。随着病菌不断深入，并侵染主干，皮层收缩，下陷，形成溃疡斑。 病菌亦可直接从气孔、水孔等自然孔口或蕾苞，或由风引起的伤口侵入叶片，初叶边坏死，并向中脉、中柄、茎扩展，后变黑，通常有菌脓。 2.2.4 损伤枯萎和砧木枯萎 这二种比较特殊，前者主要是由于晚霜、冰雹或大风损伤引起，如果实，很容易引起果实枯萎。后者仅限于高感品种EMAL-26、 EMLA-9和MARK-39砧木。通常是由感病的接穗在这些砧木上发病后引起，最终成溃疡带而杀死树体。3 梨火疫病菌的越冬场所及传播 3.1 梨火疫病菌的越冬场所 梨火疫病菌在病株病疤边缘组织处越冬，挂在树上的病果也是它的越冬场所，如冬季温和，病菌还能在病株树皮上度过，来年早春病菌在上年的溃疡处迅速繁殖，遇到潮湿、温和的天气，从病部渗出大量乳白色粘稠状的细菌分泌物，即为当年的初侵染源，通过昆虫、雨滴、风、鸟类以及人的田间操作将病菌传给健株。病菌亦通过伤口、自然孔口（气孔、蜜腺、水孔）、花侵入寄主组织，有一定损伤的花、叶、幼果和茂盛的嫩枝最易感病。3.2 梨火疫病菌的传播途径 梨火疫病的传播，除风、雨、鸟类和人为因素外，昆虫对梨火疫病的传播扩散起一定的作用。据记载，传病昆虫包括蜜蜂在内有77个属的100多种昆虫，其中密蜂的传病距离约为200400m，一般情况下，梨火疫病的自然传播距离约为每年6km。 在传病的气候因子中，雨水是果园短距离传播的主要因子，从越冬或新鲜接种源至花和幼枝， 经常在溃疡斑下面枝条上观察到圆锥形侵染类型。其次风亦是中短距离传播的重要因子，往往在沿着盛行风的方向，病原菌以单个菌丝、菌脓或菌丝束被风携带到较远距离。 梨火疫病远距离传播主要是感病寄主繁殖材料，包括种苗、接穗、砧木、水果、被污染的运输工具、候鸟及气流。但对于如我国、澳大利亚等国，目前最有可能亦最危险的传播途径是通过病接穗、苗木、果实的传带。Psaltidas(1990)认为，梨火疫病在地中海地区扩散，并不能排除烟雾。4 梨火疫病的检验与检测方法 由于梨火疫病在世界各国均很重视，研究亦相对较多，其检验方法亦很多，从经典的分离培养、致病性测定、症状观察等到先进的分子生物学技术，包括DNA探针、PCR技术的应用及脂肪酸分析、单克隆抗体的应用等等，但在目前检疫上仍采用免疫荧光染色结合致病性测定确诊的方法。4.1 产地检验 产地检验是一项最基本的检验方法，主要通过症状检验确认。重点是在应检验病虫害发生盛期或危害高峰期到田间检查与观察。如日本对进口新西兰的苹果的检疫措施就要求每年在苹果花期，果实生长期和收获期3次到新西兰的苹果出口基地进行产地检验，以保证进口的苹果不带火疫病菌。在梨园做检疫时，主要是看当年生新梢有无枯死，下垂呈牧羊鞭状；梢上有无溃疡斑，以及有无粘性的菌胶存在。 4.2 症状观察 梨火疫病的症状很典型，是鉴定的重要方法，但必须与其他症状相似的梨梢枯病区分开。4.3 分离培养 对于症状明显材料可直接分离病原，而症状不明显的材料如水果、幼枝等，可先进行IF（免疫荧光法）检测，再进行分离。分离可采用选择性培养基和鉴别性培养基进行。 4.3.1 MS培养基 这是Miller和Schroth专为梨火疫病菌设计的选择性培养基。梨火疫病菌菌落为红橙色，背景为兰绿色。配方如下：琼脂20g，甘露醇10g， L-天门冬酰胺3g，牛胆酸钠2.5g，磷酸氢二钾2.0g，烟酸0.5g，MgSO47H2O0.2g，次氮基三乙酸0.2g，硫酸十七烷基钠0.1ml，0.5%溴麝香草酚兰水溶液9ml，0.5%中性红2.5ml，蒸馏水970ml，pH7.3灭菌后加1%放线菌酮5ml，1%硝酸铯水溶液1.75ml。 4.3.2 CG培养基 这是Cross和Googman设计的高糖培养基，梨火疫病菌在28培养60小时后形成典型的火山口状菌落，特别是在立体显微镜下。配方如下：水380ml，蔗糖160g，营养琼脂12g，结晶紫0.8ml（1%乙醇溶液），0.1%放线菌酮20ml。 4.3.3 Zeller改良高糖培养基 梨火疫病菌在此培养基上27培养23天后，菌落大小为37mm，橙红色半球形，高度凸起，中心色深，有蛋黄状中心环，表面光滑，边缘整齐。配方如下：牛肉浸膏8g，蔗糖50g，放线菌酮50mg，0.5%溴百里酚兰9ml，0.5%中性红2.5ml，琼脂20g，水1000ml，pH7.4。另外，梨火疫病菌在NA+5%蔗糖等培养基上，典型菌落果聚糖阳性，在紫外灯下无荧光。 4.4 幼梨切片接种 以菌苔或菌悬液接种幼梨横切片，梨火疫病菌在梨片上形成乳白色高度隆起的球状菌脓，而其他细菌不产生菌脓或菌脓平铺不隆起。 4.5 免疫学技术 血清学技术是目前检测梨火疫病菌的主要方法之一，主要缺点是受抗血清质量和专化性的限制。多克隆抗体制备简单，但通常和近缘细菌有交叉反应；单克隆抗体专化性好，但一般只能检测一个或几个血清型的细菌，并且制备复杂，技术和设备要求较高。通常要将几种单抗混合使用。Elrod经血清学技术研究后发现梨火疫病菌是一个非常同质的种，各菌株间的血清学关系非常明显。Gorris等利用梨火疫病菌的两个免疫原组分获得8个单抗，用双抗夹心ELISA对这些单抗进行了评价，发现所有梨火疫病菌均能和这些单抗反应，同时对这些抗体在其他血清学技术中的应用进行了评价，认为这些抗体混合或单独使用，可适用于各种免疫学检测技术。4.6 现代分子技术 随着分子生物学技术在许多领域的发展和应用，尤其是PCR技术的诞生及计算机辅助分析，细菌在种以及种以下的分类及检测研究也深入到分子水平，因而大大提高了细菌检测的准确性和灵敏度，且简便快速。近期的核酸分析检测技术(核酸探针、PCR技术等)使对梨火疫病菌实行灵敏、快速的鉴定成为可能。4.6.1 核酸探针技术 核酸探针技术是利用带有适当标记物(放射自显影或化学显色)的核酸片段，体外通过碱基配对与特定的靶序列结合形成双链复合物，为可见信号。目前应用较多的是32P标记的总DNA制成的探针，专化性很好，不与其它细菌发生交叉反应，可检测出102105菌体。用地高辛标记pEA29质粒上05kb的sal I片段制成的非放射性探针，与放射性探针相比专化性增强但灵敏度稍低，处理大量样品时非常费时，已被灵敏度及专化性更高的PCR所取代。4.6.2 PCR 技术PCR 技术最早是利用pEA29质粒0.9kb的Pst片段，经过部分测序，合成两个17 mer的寡核苷酸引物，对 E.a DNA 进行特异性扩增，检测灵敏度可达50个菌体细胞，并在6小时内可得结果。利用 E.a 基因组DNA，16S核糖体等基因序列，相继开发出多种检测梨火疫病菌的方法。Mc Manus等人（1995）利用16S巢式PCR技术检测，灵敏度可达检测单个菌体且特异性更强，采用的PCR-斑点印迹（PCR dot blot）和反印迹杂交检测水平为20个菌体。钱国良等利用实时荧光PCR技术，对梨火疫病菌进行了准确灵敏的检测，检测灵敏度达到4个菌体，在3小时内可完成检测。【参考文献】1李大春，林泓 .梨火疫病菌检测方法研究进展.2010年进出境植物检疫学术研讨会论文集,20102朱建裕，廖晓兰,等梨火疫病菌实时荧光PCR和诱捕PCRELISA检测方法的建立植物检疫，20033尚琳琳，周国梁，仇书红，等美国进境樱桃果实中梨火疫病菌的检测植物病理学报，20094李雪松.梨火疫病的发生与防治.河北农业科技,20085胡白石,许志刚,等.梨火疫病的进境风险分析.植物保护学报，20016云陆，等应用聚合酶链反应技术检测梨火疫病菌的研究植物检疫。1997，7宝庆，等梨火疫细茁的巢式PCR检测植物病害研究与防治，北京：中国农业科技出版社，19988洪芳，等梨火疫病菌的免疫检测农业生物技术学报，19989龙海，杨伟东，等.亚洲梨火疫病致病相关因子的研究进展.植物检疫，200810葛泉卿.梨火疫菌的株系和近缘种.植物检疫，200311刘华威.王晓鸣,等.梨种质对梨火疫病的抗性研究.植物遗传资源学报，200812陈 晨，陈 娟，等.梨火疫病菌在中国的潜在分布及入侵风险分析