微生物检测实验指导(XXXX版).doc

食品微生物实验指导刘后伟、林丹琼、刘旭光适合专业：绿色食品加工专业 食品营养与检测专业 农产品检测专业实训一 显微镜的操作与使用实验1: 显微镜的构造、性能和使用方法1. 目的要求(1) 熟悉普通光学显微镜的构造及各部分的功能。(2) 学习并掌握油镜的原理和使用方法。2. 基本原理显微镜由机械装置和光学系统两大部分组成。 油镜物镜的基本原理 微生物学研究用的显微镜的物镜通常有低倍物镜（16mm，10）、高倍物镜（4mm，4045）和油镜（18 mm，95100）三种。油镜通常标有黑圈或红圈，也有的以“OI字样表示，它是三者中放大倍数最大的。根据使用不同放大倍数的目镜，可使被检物体放大10002 000多倍。油镜的焦距和工作距离（标本在焦点上看得最清晰时，物镜与样品之间的距离）最短，光圈则开得最大，因此，在使用油镜观察时，镜头离标本十分近，需特别小心。使用时，油镜与其他物镜的不同是载玻片与物镜之间不是隔一层空气，而是隔一层油质，称为油浸系。这种油常选用香柏油，因香柏油的折射率n=152，与玻璃相同。当光线通过载玻片后，可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射。如果玻片与物镜之间的介质为空气，则称为干燥系，当光线通过玻片后，受到折射发生散射现象，进入物镜的光线显然减少，这样就减低了视野的照明度。 利用油镜不但能增加照明度，更主要的是能增加数值孔径，因为显微镜的放大效能是由其数值孔径决定的。所谓数值孔径，即光线投射到物镜上的最大角度（称为镜口角）的一半正弦，乘上玻片与物镜间介质的折射率所得的乘积，可用下列公式表示：NAnsin 式中 NA=数值孔径； n=介质折射率； =最大入射角的半数，即镜口角的半数。 因此，光线投射到物镜的角度愈大，显微镜的效能就愈大（图-5），该角度的大小决定于物镜的直径和焦距。同时，的理论限度为90，sin90=1，故以空气为介质时（n=1），数值孔径不能超过1，如以香柏油为介质时，则n增大，其数值孔径也随之增大。如光线入射角为120，其半数的正弦为sin60=087，则： 以空气为介质时： NA=1087=087 以水为介质时： NA=133087=115 以香柏油为介质时： NA=152087=132 显微镜的分辨力是指显微镜能够辨别两点之间最小距离的能力。它与物镜的数值孔径成正比，与光波长度成反比。因此，物镜的数值孔径愈大，光波波长越短，则显微镜的分辨力愈大，被检物体的细微结构也愈能明晰地区别出来。因此，一个高的分辨力意味着一个小的可分辨距离，这两个因素是成反比关系的，通常有人把分辨力说成是多少微米或纳米，这实际上是把分辨力和最小分辨距离混淆起来了。显微镜的分辨力是用可分辨的最小距离来表示的。 式中=光波波长。 我们肉眼所能感受的光波平均长度为055m，假如数值孔径为065的高倍物镜，它能辨别两点之间的距离为042m。而在042m以下的两点之间的距离就分辨不出，即使用倍数更大的目镜，使显微镜的总放大率增加，也仍然分辨不出。只有改用数值孔径更大的物镜，增加其分辨力才行。例如用数值孔径为125的油镜时，能辨别两点之间的 因此，我们可以看出，假如采用放大率为40倍的高倍物镜（NA=065），和放大率为24倍的目镜，虽然总放大率为960倍，但其分辨的最小距离只有042m。假如采用放大率为90倍的油镜（NA=125），和放大率为9倍的目镜，虽然总的放大率为810倍，但却能分辨出022m间的距离。3. 材料及器材显微镜、擦镜纸、二甲苯、香柏油、微生物制片标本等。4. 方法与步骤(1) 观察前的准备A. 置显微镜于平稳的实验台上，镜座距实验台边沿约34cm。镜检者姿势要端正，一般用左眼观察，右眼便于绘图或记录，两眼必须同时睁开，以减少疲劳，亦可练习左右眼均能观察。B. 调节光源，对光时应避免直射光源，因直射光源影响物像的清晰，损坏光源装置和镜头，并刺激眼睛。如阴暗天气，可用日光灯或显微镜灯照明。 调节光源时，先将光圈完全开放，升高聚光镜至与载物台同样高，否则使用油镜时光线较暗。然后转下低倍镜观察光源强弱，调节反光镜，光线较强的天然光源宜用平面镜；光线较弱的天然光源或人工光源宜用凹面镜。在对光时，要使全视野内为均匀的明亮度。凡检查染色标本时，光线应强；检查未染色标本时，光线不宜太强。可通过扩大或缩小光圈、升降聚光器、旋转反光镜调节光线。(2) 低倍镜观察 检查的标本需先用低倍镜观察，因为低倍镜视野较大，易发现目标和确定检查的位置。 将金黄色葡萄球菌染色标本置镜台上，用标本夹夹住，移动推动器，使观察对象处在物镜正下方，转动粗调节器，使物镜降至距标本约 05cm处，由目镜观察，此时可适当地缩小光圈，否则视野中只见光亮一片，难见到目的物，同时用粗调节器慢慢升起镜筒，直至物像出现后再用细调节器调节到物像清楚时为止，然后移动标本，认真观察标本各部位，找到合适的目的物，并将其移至视野中心，准备用高倍镜观察。(3) 高倍镜观察 将高倍镜转至正下方，在转换物镜时，需用眼睛在侧面观察，避免镜头与玻片相撞。然后由目镜观察，并仔细调节光圈，使光线的明亮度适宜，同时用粗调节器慢慢升起镜筒至物像出现后，再用细调节器调节至物像清晰为止，找到最适宜观察的部位后，将此部位移至视野中心，准备用油镜观察。(4) 油镜观察A. 用粗调节器将镜筒提起约2cm，将油镜转至正下方。B. 在玻片标本的镜检部位滴上一滴香柏油。C. 从侧面注视，用粗调节器将镜筒小心地降下，使油镜浸在香柏油中，其镜头几乎与标本相接，应特别注意不能压在标本上，更不可用力过猛，否则不仅压碎玻片，也会损坏镜头。D. 从接目镜内观察，进一步调节光线，使光线明亮，再用粗调节器将镜筒徐徐上升，直至视野出现物像为止，然后用细调节器校正焦距。如油镜已离开油面而仍未见物像，必须再从侧面观察，将油镜降下，重复操作至物像看清为止。E. 用同样的方法观察枯草芽孢杆菌染色标本。F. 观察完毕，上旋镜筒。先用擦镜纸拭去镜头上的油，然后用擦镜纸蘸少许二甲苯（香柏油溶于二甲苯）擦去镜头上残留油迹，最后再用干净擦镜纸擦去残留的二甲苯。切忌用手或其他纸擦镜头，以免损坏镜头。用绸布擦净显微镜的金属部件。G. 将各部分还原，反光镜垂直于镜座，将接物镜转成八字形，再向下旋。同时把聚光镜降下，以免接物镜与聚光镜发生碰撞危险。5. 实验作业(1) 分别绘出你在低倍镜、高倍镜和油镜下观察到的金黄色葡萄球菌及枯草芽孢杆菌的状态，包括在三种情况下视野中的变化，同时注明物镜放大倍数和总放大率。(2) 在使用高倍镜和油镜进行调焦时，应将镜筒徐徐上升还是下降？为什么？(3) 用油镜观察时，为什么要在载玻片上滴加香柏油？实训二 培养基的配制和灭菌实验目的1. 明确培养基的配制原理。2. 掌握配制培养基的一般方法和步骤。实验内容学习细菌、放线菌、酵母菌及霉菌四大类微生物培养基的配制。实验原理培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。各类微生物对营养的要求不尽相同，因而培养基的种类繁多。培养细菌常用牛肉膏蛋白胨培养基，培养放线菌常用高氏I号培养基，培养霉菌常用蔡氏培养基或马铃薯培养基，培养酵母菌常用麦芽汁培养基或马铃薯葡萄糖培养基。另外还有固体、液体、加富、选择、鉴别等培养基之分。在这些培养基中，就营养物质而言，一般不外乎碳源、氮源、无机盐、生长因子及水等几大类。琼脂只是固体培养基的支持物，一般不为微生物所利用。它在96以上熔化成液体，而在45左右开始凝固成固体。在配制培养基时，根据各类微生物的特点，就可以配制出适合不同种类微生物生长发育所需要的培养基。培养基除了满足微生物所必需营养物质外，还要求有一定的酸碱度和渗透压。霉菌和酵母菌的pH偏酸；细菌、放线菌的pH为微碱性。所以每次配制培养基时，都要将培养基的pH值调到一定的范围。牛肉膏蛋白胨培养基配方牛肉膏 3.0 g蛋白胨 10.0gNaCl 5.0g水 1000mLpH 7.47.6高氏I号培养基配方可溶性淀粉 20gNaCl 0.5gKNO3 1gK2HPO43H2O 0.5g MgSO47H2O 0.5gFeSO47H2O 0.01g琼脂 1525g水 1000mL pH 7.47.6马铃薯培养基配方马铃薯（去皮） 200g葡萄糖（或蔗糖） 20g琼脂 1525g水 1000ml自然pH察氏培养基配方蔗糖 30gNaNO3 2gK2HPO4 1gKCl 0.5gMgSO47H2O 0.5gFeSO47H2O 0.01g琼脂 1525g蒸馏水 1000ml自然pH实验及器材牛肉膏，蛋白胨，NaCl，琼脂，1mol/LNaOH, 1mol/LHCl，KNO3，K2HPO43H2O，MgSO47H2O，FeS047H2O，马铃薯，蔗糖等。试管，三角瓶，烧杯，量筒，玻棒，培养基分装器，天平，牛角匙， pH试纸(pH 5.59.0)，棉花，牛皮纸，记号笔，麻绳，纱布等。实验步骤1牛肉膏蛋白胨培养基配制方法(1) 称量：按培养基配方比例依次推确地称取牛肉膏、蛋白胨、NaCL放人烧杯中。牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯，也可按在称量纸上，称量后直接放入水中，这时如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。蛋白胨很易吸湿，在称取时动作要迅速。另外，称药品时严防药品混杂，一把牛角匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净，擦干，再称取另一药品。瓶盖也不要盖错。(2) 溶化：在上述烧杯中先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解。将药品完全溶解后，补充水到所需的总体积，如果配制固体培养基时，将称好的琼脂放入己溶的药品中，再加热溶化，最后补足所损失的水分。在琼脂溶化过程中，应控制火力，以免培养基因沸腾而溢出容器。同时需不断搅拌以防琼脂糊底烧焦。配制培养基时，不可用铜或铁锅加热溶化，以免离子进入培养基中，影晌细菌生长。(3) 调pH在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH，如果偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/LNaOH,边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH，直至pH达7.6。反之，用mol/LHCL进行调节。 对于有些要求pH较精确的微生物，其pH的调节可用酸度计进行。 pH不要调过头，以避免回调而影响培养基内各离子的浓度。配制pH低的琼脂培养基时，若预先调好pH并在高压蒸气下灭菌，则琼脂因水解不能凝固。因此，应将培养基的成分和琼脂分开灭菌后再混合，或在中性pH条件下灭菌，再调整PH。(4) 过滤 趁热用滤纸或多层纱布过滤，以利某些实验结果的观察。一般无特殊要求的情况下可以省去（本实验勿需过滤）。(5) 分装 按实验要求，可将配制的培养基分装人试管内或三角烧瓶内。1) 液体分装：分装高度以试管高度的l4左右为宜。分装三角瓶的量则根据需要而定，一般以不超过三角瓶容积的一半为宜，如果是用于振荡培养用，则根据通气量的要求酌情减少；有的液体培养基在灭菌后，需要补加一定量的其他无菌成分，如抗生素等，则装量一定要准确。2) 固体分装：分装试管，其装量不超过管高的1/5，灭菌后制成斜面。分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。3) 半固体分装：试管一般以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。 图1-1 培养基的分装 A 漏斗分装装置 ；B 自动分装装置 1 铁架 ；2 漏斗 ；3孔胶管 ；4弹簧夹 ；5玻璃 ；6流速调节 ；7 装量调节 ；8开关分装过程中，注意不要使培养基沾在管(瓶)口上，以免沾污棉塞而引起污染。(6) 加塞图1-2 棉塞的制作培养基分装完毕后，在试管口或三角烷瓶口上塞上棉塞（或泡沫塑料塞及试管帽等），棉塞的作用有二：一方面阻止外界微生物进入培养基，防止由此而引起的污染；另一方面保证有良好的通气性能，使培养在里面的微生物能够从外界源源不断地获得新鲜无菌空气。因此棉塞质量的好坏对实验的结果有着很大的影响。一只好的棉塞，外形应象一只蘑菇，大小、松紧都应适当。加塞时的棉塞的总长度的3/5应在口内，2/5在口外。 (7) 包扎 加塞后，将全部试管用麻绳捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称、组别、配制日期。三角烧瓶加塞后，外包牛皮纸，用麻绳以活结形式扎好，使用时容易解开，同样用记号笔注明培养基名称、组别、配制日期。(8) 灭菌 将上述培养基以0.103MPa，121，20min高压蒸气灭菌。(9) 搁置斜面 将灭菌的试管培养基冷至50左右以防斜面上冷凝水太多，将试管口端捆在玻棒或其他合适高度的器具上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜 。(10) 无菌捡查将灭菌培养基放人37的温室中培养2448h，以检查灭菌是否彻底。2高氏I号培养基配制方法(1) 称量和溶化 按配方先称取可溶性淀粉、放入小烧杯中，并用少量冷水将淀粉调成糊状，再加入少于所需水量的沸水中，继续加热，使可溶性淀粉完全溶化。然后再称取其他各成分依次逐一溶化。对微量成分FeSO47H2O可先配成高浓度的贮备液按比例换算后再加入，方法是先在100mL水中加入1g的FeSO47H2O配成0.01gml，再在1000mL培养基中加1mL的0.0l gm1的贮备液即可。待所有药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。如要配制固体培养基，其溶化过程同牛肉膏蛋白胨培养基配制方法。(2) pH调节、分装、包扎、灭菌及无菌检查同牛肉膏蛋白胨培养基配制方法。3马铃薯培养基配制方法取去皮马铃薯200g，切成小块，放入1500mL的烧杯中煮沸30min，注意用玻棒搅拌以防糊底。然后用双层纱布过滤，取滤液加糖（酵母菌用葡萄糖，霉菌用蔗糖），加热煮沸后加入琼脂，继续加热融化并补足失水。再按前所述，进行分装、加塞、包扎、0.1MPa灭菌20 min。4察氏培养基配制方法方法同牛肉膏蛋白胨培养基配制。实验结果及讨论针对实验原理、步骤、现象进行讨论。实验作业（选做3题）1牛肉膏应置于何种容器中称量为宜?2配制高氏合成一号培养基时，可溶性淀粉需经什么处理后才能倒入到沸水中? 3何谓培养基的自然pH?4培养基配好后，为什么必须立即灭菌?如何检查灭菌后的培养基是无菌的5在配制培养基的操作过程中应注意些什么问题?为什么?6配制合成培养基加入微量元素时最好用什么方法加入?天然培养基为什么不需要另加微量元素?7有人认为自然环境中微生物是生长在不按比例的基质中，为什么在配制培养基时要注意各种营养成分的比例?8你配制的高氏I号培养基有沉淀产生吗?说明产生或未产生的原因。9细菌能在高氏I号培养基上生长吗?为了分离放线菌，你认为应该采取什么措施?实训三 革兰氏染色法1. 目的要求了解革兰氏染色的原理，学习并掌握革兰氏染色的方法。2. 基本原理革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。它是1884年由丹麦医师Gram创立的。革兰氏染色法不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。 革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料初染液；媒染剂；脱色剂和复染液。碱性染料初染液的作用象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘是常用的媒染剂。脱色剂是将被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95的酒精。复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，从而将细胞区分成G+和G-两大类群，常用的复染液是番红。3. 材料及器材(1) 大肠杆菌，枯草芽孢杆菌(2) 革兰氏染色液，载玻片，显微镜等4. 方法与步骤(1) 涂片将培养1416小时的枯草芽孢杆菌和培养24小时的大肠杆菌分别作涂片（注意涂片切不可过于浓厚），干燥、固定。固定时通过火焰12次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。(2) 初染 加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟，水洗。(3) 媒染 滴加碘液冲去残水，并覆盖约一分钟，水洗。(4) 脱色 将载玻片上面的水甩净，并衬以白背景，用95酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约2030秒钟，立即用水冲净酒精。(5) 复染 用番红液染12分钟，水洗。(6) 镜检 干燥后，置油镜观察。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。(7) 同法在一载玻片上以大肠杆菌与枯草芽孢杆菌混合制片，作革兰氏染色对比。革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反应。革兰氏染色过程：5. 实验作业(1) 在你所作的革兰氏染色制片中，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌各染成何色？它们是革兰氏阴性菌还是革兰氏阳性菌？(2) 作革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？其染色成败的关键一步是什么？当你对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样能确证你的染色技术操作正确，结果可靠？实验四 乙酰甲基甲醇试验(V.P试验)一、实验目的了解鉴别不同肠杆菌科各菌属的乙酰甲基甲醇试验原理，并掌握其操作方法二、原理某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合、脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中的氧氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称为V.P(+)反应。CH3 CH3 CH3 NH3 N=CH-CH3 CO CO CO NH=C NH=C COOH CHOH CO NH3 N=CH-CH3 CH3 CH3三、实验材料 (1)菌种 大肠埃希氏菌(Escherichia coli),枯草芽孢杆菌(Bacillus subttilis)的斜面菌种。 (2)培养基 葡萄糖蛋白胨水培养基的试管 (3)其它 酒精棉球，酒精灯，接种针，恒温箱等。四、方法与步骤发酵液试管标记接种培养观察记录。(1)标记试管 取5支装有葡萄糖蛋白胨水培养基的试管，分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌、普通变形杆菌、枯草芽孢杆菌和空白对照。 (2)接种培养 以无菌操作分别接种少量菌至以上相应试管中，空白对照管不接菌，置37恒温箱中，培养24 48 h。 (3)观察记录a. 取出以上试管，振荡2 min。另取5支空试管相应标记菌名，分别加入35 mL以上对应管中的培养液，再加入400 gL氢氧化钠溶液1020滴，并用牙签挑人约0.51 mg微量肌酸，振荡试管，以使空气中的氧溶人，置37恒温箱中保温15 30 min. b. 也可以取上述试管，加入和培养液一半的6%的萘酚，摇匀，再加入培养液1/3的40%氢氧化钠溶液，充分摇匀，观察结果。五、实验结果若培养液呈红色，记录为VP试验阳性反应(用“+”表示)；若不呈红色，记录为VP试验阴性反应(用“-”表示)。注意：原试管中留下的培养液用作甲基红试验。实验五 甲基红试验(M.R试验)一、实验目的1、了解鉴别肠杆菌科各菌属的甲基红试验原理2、学习甲基红试验的操作技术。二、原理肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一步分解中，由于糖代谢的途径不同，可产生乳酸等有机酸。培养液指示剂珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基pH值下降至pH 4.5以下，使甲基红指示剂变红。三、实验材料 (1)菌种 同V.P试验 (2)培养基 同V.P试验 (3)其它 酒精棉球，酒精灯，接种针，恒温箱等。四、方法与步骤 于V.P试验留下的培养液中，各加入23滴甲基红指示剂，注意沿管壁加入，仔细观察培养液上层。五、实验结果 若培养液上层变成红色, 即为阳性反应；若仍呈黄色，则为阴性反应，分别用“+”或“-”表示。 实验六 吲哚试验一、实验目的1、掌握吲哚试验(Ehrlich法)的原理和方法：2、学习吲哚试验(Ehrlich法)试验的操作技术。二、原理 有些细菌含有色氨酸酶。能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚(靛基质)。吲哚本身没有颜色，不能直接看看见，但当加入对二甲基氨基苯甲醛试剂时，该试剂与吲哚作用形成红色的攻瑰吲哚。三、实验材料 (1)菌种 大肠杆菌(Eschichiacoli)，枯草芽孢杆菌。 (2)培养基 蛋白胨水培养基。 (3)其它 二甲基氨基苯甲醛溶液，乙醚，酒精灯，接种针，恒温箱等。四、方法与步骤标记试管接种培养观察记录。取装有蛋白胨水培养基的试管3支，分别标记大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和空白对照。置37恒温箱中培养2448 h。在培养基中加入乙醚l2ml，经充分震荡使吲哚萃取至乙醚中静置片刻后乙醚层浮于培养液的上面。此时沿管璧缓慢加入510滴吲哚试剂(加人吲哚试剂后切勿摇动试管，以防破坏乙醚层影响结果观察)。五、实验结果 如有吲哚存在，乙醚层呈现玫瑰红色，此为吲哚试验阳性反应，否则为阴性反应，阳性用“+”；阴性用“-”表示。实验七 半乳糖苷酶试验一、实验目的1、了解-半乳糖苷酶试验的用途与原理：2、学习-半乳糖苷酶试验的操作技术。二、原理 在邻硝基酚-D-半乳糖苷培养基(ONPG培养基)中含有邻硝基酚-D-半乳糖苷和pH75的0.01molL的磷酸缓冲液。当试验产生-半乳糖苷酶时，邻硝基酚-D-半乳糖苷被水解，释放出邻硝基酚，此物为酸碱指示剂，它的指示范围是pH6.8(无色)pH8.6(黄色)，故能使pH7.5的培养液成为黄色，否则不变色。三、实验材料 (1)菌种 大肠杆菌(Eschichiacoli)，爱得华氏菌（Edwardsiella sp） (2)培养基 ONPG培养基 (3)其它 酒精棉球，酒精灯，接种针，恒温箱等。四、方法与步骤 取ONFG培养基试管三支，于其上分别做好培养基名称和“大肠杆菌”、“爱檀华氏苗”、“空白对照”等标记，然后分别将试验菌相应地接人ONPG培养基中，连同对照，置36土1培养13h和24h，观察结果。五、实验结果 试管中培养基颜色变黄者为该试验阳性，记“十”号，否则记“一”。实验三 含碳化台物的利用试验一、实验目的 学会测定某菌能否利用某一含碳化合物的方法。二、原理 细菌能否利用某些含碳化合物作为唯一碳源，反映该菌是否含有代谢这种含碳化合物有关的酶，因而可作为鉴定的依据。做这项测定的基础培养基配方很多，因酶的种类而异培养基可制成液体分装试管，也可加1.5一2水洗琼脂制成平板。可用来测定的底物种类很多，有单糖类、双糖类、糖醇类、脂肪酸类、羟基酸类、各种有机酸类、醇类、各种氮基酸类、胺类以及磺氢化合物等。糖的含量一般为l，醇类、酚等底物在培养基中含量一般为0.1一0.2，氨基酸的含量一般为0.5。因碳氢化合物不溶于水，可在液体中撮搞培养或加入45左右的固体培养基中，用力振荡后立即倒成平板。有些底物不宜加压灭菌，可用过滤法灭菌后加入无菌的基础培养基中，某些醇类和酚类则不需灭菌。三，实验材料 (1)菌种 大肠杆菌(E.coli)和枯草芽孢杆菌(B.subtilis)。 (2)培养基 细菌基础培养基(附录5)。试验时，往基础培养基中加糖类1或醇、酚0.10.2，或氨基酸0.5。四、方法与步骤将实验菌种首先制成悬液，以避免带人少量碳源而干扰实验结果平板接种用接种环点种，液体培养基用直针接种每一测定苗都必须接种未加碳水化合物的空白基础培养基作对照。适温培养2、5、7D后观察。五、实验结果凡测定菌在有碳水化合物的培养基中的生长情况明显超过在空白基础培养基的生长量者为阳性，否则为阴性。如两种培养基上生长情况差别不明显，可在同一培养基上连续移种三次，如差别仍不明显，则为阴性。实验四 丙二酸盐试验一、实验目的1、了解丙二酸钠试验的用途及原理2、学习丙二酸试验的操作技术。二、原理 由于微生物的酶系统不同，故有的菌能利用醋酸盐作为氮源，有的菌则不能，当醋酸盐被分解利用后，培养基中产生碱性物质，使培养基县碱性，促使培养基中酸碱指示剂麝香草酚蓝由绿色变成蓝色，可利用此反应来鉴别有关微生物。三、实验材料 (1)菌种 大肠杆菌(Eschichiacoli)及沙门氏菌（Salmonella sp） (2)培养基 丙二酸钠培养墓(附录6)。 (3)其它 酒精棉球，酒精灯，接种环，恒温箱等四、方法与步骤 取丙二酸钠培养基试管三支，于其上分别做好培养基名称和“大肠杆菌”及“沙门氏菌”及“空白对照”等标记。然后对应地将菌种接入丙二酸钠培养基试管中，连同空白对照置于37恒温箱培养48h，观察结果。五、实验结果 培养基由绿色变成蓝色者，表明实验菌能利用醋酸盐作为碳源，故丙二酸钠实验结果为阳性，记“十”号，培养基不变蓝色者为阴性，否则记“一”。将观察结果以表格方式记录。实验五 葡萄糖铵试验、实验目的1)了解葡萄糖铵试验的用途及原理。2)学习掌握葡萄糖铵试验的操作技术。二、原理 有的菌种能利用铵盐作为氮源而生长，有的菌则不能用，在葡萄糖铵培养基中。磷酸二铵是唯一的氮源，故以能否在该培养基上生长来作为鉴别有关细菌的依据之一。三、实验材料1) 菌种 大肠杆菌(Escherichia coli)和福氏志贺菌（Shigelle flexneri）2) 培养基 葡萄糖铵培养基(附录-8),普通营养琼脂斜面。3) 其它 酒精棉球，酒精灯，接种针，无菌生理盐水8mL(二支)四、方法与步骤1） 做标记 取葡萄糖铵培养基、普通营养琼脂斜面、无菌生理盐水个2支，分别于其上做好培养基名称和菌名等标记。2） 制备菌悬液 将苗种相应接人理盐水管内，研磨并搅动使其均匀。要求每一接种环内含菌数在20100个为宜（或肉眼观察不见浑浊）。3） 接种 用无菌接种环分别取大肠杆菌菌液一环，在对应的葡萄糖铵斜面培养基和普通营养琼脂斜面培养基上划线接种，并以同样的方法接种福氏志贺菌。4） 培养 将种接好的试管置36土1恒温箱培养24h，观察结果。五、实验结果 在葡萄糖铵斜面上有正常大小菌落生长者为葡萄糖铵试验阳性，记“十”号；不生长或只生长为极微小的菌落，而在对照培养基上生长良好者，为阴性，否则记“一”。将观察结果以表格方式记录。实验六 酪蛋白分解试验 一、实验目的 (1)了解酪蛋白分解试验的用途及原理 (2)学习酪蛋白分解试验的操作技术 二、原理 某些菌具有酪蛋白分解酶，而有的菌则不具有。具有酪蛋白分解酶的细菌在 蛋白琼脂平板上可分解酪蛋白而令菌落周围形成透明圈。三、实验材料（1）菌种 蜡样牙孢杆菌和球形芽孢杆菌。(2) 培养基 酪蛋白琼脂培养基平板(附录19)(3) 其它 酒精棉球，酒精灯，接种环，恒温箱等。四、方法与步骤以划线接种法将试验菌接种于酪蛋白培养基上，然后置37恒温箱培养12d后，观察结果五、实验结果平板中菌落周围有透明圈者，为酪蛋白分解试验阳性。反之为阴性*注：1、培养基在倒时要摇匀（因为酪蛋白不溶解） 2、倒好后，培养基放置时间要较长（凝固时间较长）实验七 细胞色素氧化酶试验 一、实验目的 (1)了解细胞色素氧化酶试验的用途与原理 (2)学习细胞色素氧化酶试验的操作技术 二、原理 在不以氧为直接受氢体的生物氧化体系中，生物氧化需要在多种酶联合作用下方能进行。组成这类生物氧化体系的酶，主要是细胞色素类酵。这种酶在有分子氧与脱氢酶的存在下，可氧化二甲基对苯撑二胺和萘酚成吲哚酚蓝，其反应式同氧化酶试验三、实验材料 (1)菌种 大肠杆菌(Escherichiacoli)和枯草杆菌(13acillsubtilis)。 (2)试剂 同氧化酶试验。四、方法与步骤 取37培养20h的斜面培养物一支，将两种试剂各23滴顺斜面从上端滴下，并将斜面略加倾斜，使试剂混合液流经斜面上的培养物。如系平板培养物，则可用试剂混合液滴到菌落上。五、实验结果 在两分钟内呈现蓝色者为阳性，2min以后出现微弱或可疑反应者均作为阴性结果. 实验九 淀粉水解试验 一、实验目的 (1)了解淀粉水解试验的原理及用途。 (2)学习淀粉水解试验的操作技术。二、原理 许多菌产生淀粉酶，能把培养基中的淀粉水解为无色糊精的等小分子，或进分解为麦芽糖和葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不再变蓝色三、实验材料 (1)菌种 大肠杆菌(Escherichiacoil)和枯草芽抱杆酶(Bacillussubtilis)。 (2)培养基 在肉汤蛋白胨琼脂中添加0.2%的可溶性淀粉，分装0.1MPa20min灭菌。 (3)试剂 路哥氏碘液(附录132) (4)其它 酒精棉球，酒精灯，接种针，恒温箱等。 四，方法与步骤 将培养基熔化，倒成平板，凝固后，取菌种点种于平板上，每皿可点35个菌，37恒温箱培养24d后，观察结果五、实验结果取培养好的平皿，在平板上滴加路哥氏碘液以铺满菌落周围为度，平板呈蓝色，而菌落周围如有无色透明圈出现，说明淀粉已被水解，称淀粉水解试验阳性。透明圈的大小一般说明水解淀粉能力的大小。实验八 过氧化氢酶试验，实验目的1)了解过氧化氢酶试验的用途与原理。2)学习过氧化氢酶试验的操作技术。二、原理 在以需氧脱氢酶催化的氧化体系中，氧原子接受电子后，即与溶液中氢离子结合，生成过氧化氢，此物对微生物有毒性。有的菌具有过氧化氧酶，可将其分解成水和氧，但有的菌不具有此酶故过氧化氢酶试验是鉴别菌种的依据之一。 三、实验材料 (1)菌种 大肠杆菌(Escherichia coli)和某种乳酸杆菌(Lactobacillus sp)。 (2)培养基肉汤培养基(附录11),麦汁培养基. (3)试剂 3%过氧化氢溶液 (4)其它 酒精棉球，酒精灯，洁净小试管，接种环等。四、方法与步骤从斜面挑取一环菌种置于洁净试管内，滴加3%过氧化氢溶液约2mL,观察结果。五、实验结果于半分钟内产生气泡者，为过氧化氧酶试验阳性；不发生气泡者，为阴性。菌落总数测定1 范围本标准规定了食品中菌落总数的测定方法。本标准适用于各类食品中菌落总数的测定。2 术语与定义下列术语和定义适用于本标准。2.1 菌落总数 食品检样经过处理，在一定条件下培养后（培养基成分、培养温度和时间、PH、需氧性质等），所得1ml（或1g）检样中形成菌落的总数。本标准规定的培养条件下所得结果，只包括一群在平板计数琼脂上生长发育的嗜中温需氧菌或兼性厌氧菌的菌落总数。3 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：3.1 恒温培养箱：361，301。3.2 冰箱：25.3.3 恒温水浴箱：461.3.4 天平：感量0.1g.3.5 均质器。3.6 振荡器。3.7 无菌吸管：1ml（具0.01ml刻度）、10 ml（具0.1ml刻度）或微量移液器及吸头。3.8 无菌锥形瓶：容量250ml、500ml。3.9 无菌培养皿：直径90mm3.10 PH计或PH比色管或精密PH试纸。3.11 放大镜或菌落计数器或petrifilm自动判读仪。4 培养基和试剂4. 1 平板计数琼脂培养基：见第A.1章。4. 2 磷酸盐缓冲液：见第A.2章。4. 3 无菌生理盐水：称取8.5g氯化钠溶于100ml蒸馏水中，121高压灭菌15min。4.4 1mol/L氢氧化钠（NaOH）：称取40g氢氧化钠溶于1000ml蒸馏水中。4.5 1mol/L盐酸（HCL）:移取浓盐酸90ml用蒸馏水稀释1000ml。4.6 petrifilm菌落总数测试片和压板。第一法 平板菌落计数法5 检验程序 菌落总数的检验程序见图1检样25g（或25 ml）样品+225ml稀释液，均质10倍系列稀释选择2个3个适宜样品匀液，各取1ml分别加入无菌培养皿内每皿中加入15ml20ml平板计数琼脂培养基，混匀 培 养36148h2h计数各平板菌落数 计数菌落总数报 告 图1 菌落总数的检验程序6 操作步骤样品的稀释固体和半固体样品：称取25g样品置盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8 000r/min10 000r/min 均质1min2min,或放入盛有225ml稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min2min,制成1：10的样品匀液。液体样品：以无菌吸管吸取25ml样品置盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀,制成1：10的样品匀液。用1ml无菌吸管或微量移液器吸取1：10样品匀液1ml，沿管壁缓慢注于盛有9ml稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用一支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1：100的样品匀液。按6.1.3操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用一次1ml无菌吸管或吸头。根据对样品污染状况的估计，选择2个3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10倍递增稀释时，每个稀释度分别吸取1ml样品匀液加入两个无菌平皿内。同时分别取1ml稀释液加入两个无菌平皿左空白对照。及时将15ml20ml冷却至46的平板计数琼脂培养基（可放置于461恒温水浴箱中）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。培养6.2.1 琼脂凝固后，将平板翻转，361培养48h2h。水产品301培养72h3h.6.2.2 如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基（约4ml），凝固后翻转平板，按6.2.1条件进行培养。6.3 菌落计数可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位（colony-forming units,CFU）表示。6.3.1 选取菌落数在30CPU300CPU之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30CFU的平板记录具体菌落数，大于300的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。6.3.2 其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数;若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以，代表一个平板菌落数。6.3.3 当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。7 结果的表述7.1 菌落总数的计算方法7.1.1 若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每克（或毫升）中菌落总数结果。7.1.2 若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按式（1）计算： 式中： N-样品中菌落数； C-平板(含适宜范围菌落数的平板)菌落数之和； n1 -第一个适宜稀释度平板上的菌落数； n2-第二个适宜稀释度平板上的菌落数； d- 稀释因子（第一稀释度）。示例： 稀释度1；100（第一稀释度）1；100（第二稀释度）菌落数232，24433，357.1.3若所有稀释度的平板菌落数均大于300，则对所有稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计数。7.1.4若所有稀释度的平板菌落数均若有所有稀释度的平板菌落数均少于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计数7.1.5若所有稀释度（包括液体样品原液）的平板均无菌落数生成，则以少于1乘以最低稀释倍数计数。7.1.6若所有稀释度的菌落数均不在30300之间，其中一部分小于30或大于300时，则以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数计算。7.2 菌落总数的报告7.2.1菌落数在100以内时，按“四舍五入”原则修约，采用两位有效数字报告。7.2.2 大于或等于100时，第三位数字采用“四舍五入”原则修约后，取用两位数字，后面用0代替位数；也可用10的指数形式表示，按四舍五入原则修约后，采用两位有效数字。7.2.3 若所有平板上蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。7.2.4 若空白对照有菌落生成，则这次检测结果无效。7.2.5 称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/ml为单位报告。第二法菌落总数Petrifilm TM测试片法8 检验程序除将平板计数琼脂培养基改成PetrifilmTM 菌落总数测试片外，其他与第5 章相同。9 操作步骤9.1 样品的稀释按照6.1.1-6.1.2 制备1:10 的样品匀液后，用1 mol/L 氢氧化钠（NaOH ）或1 mol/L 盐酸( HCL ）调节pH 至6.6-7.2 。9.2 接种根据对样本污染状况的估计，选择2 个3 个适宜稀释度的样品匀液进行检验。将测试片置于平坦实验台表面，揭开上层膜，用吸管或微量移液器吸取1 mL 样品匀液，垂直滴加在测试片的中央，将上层膜盖下，允许上层膜直接落下，但不要滚动上层膜，将压板（凹面底朝下）放置在上层膜中央，轻轻地压下，使样液均匀覆盖于圆形的培养膜上，切勿扭转压板。拿起压板，静置至少1 min 以使培养基凝固。每个稀释度接种两张测试片