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光谱分析技术 光学导论 光谱 复色光经色散系统分光后 按波长 或频率 的大小依次排列的图像 光学导论 基于测量物质的光谱而建立起来的分析方法称为光谱分析法 吸收光谱 发射光谱 分子光谱 原子光谱 光学导论 吸收光谱 颜色的差异 定性颜色的深浅 定量 光学导论 发射光谱 化学发光 热 电激发发光 光致发光 光学导论 光谱分析法的准确分类 分子光谱吸收 根据吸收波段不同细分 紫外 可见红外发射 根据发射原理不同细分 光致发光 荧光 磷光化学发光 光学导论 光谱分析法的准确分类 原子光谱吸收发射 根据发射原理不同细分 热 电激发发光 发射光致发光 荧光 光学导论 光谱分析 光学分析 光学分析 光谱分析 非光谱分析 非光谱分析 基于物质与辐射的相互作用 测量辐射的某些性质 如折射 散射 干涉 衍射和偏振等变化的分析方法 光学导论 光谱分析与非光谱分析的区别 光谱分析涉及 颜色 谱 能量 的变化非光谱分析涉及光的传播方向等物理性质的变化 不涉及 谱 光学导论 光的本质 电磁辐射 波粒二象性 波 波长 频率 速度 c 真空中的 3 108m s 1 波长 相邻两个波峰或波谷间的直线距离单位可以是nm m cm m频率 在1秒时间内经过某点的波数 即每秒内振动的次数 单位Hz s 1 周期T 频率的倒数 波数 波长的倒数 光学导论 射线 x射线 紫外光 红外光 微波 无线电波 10 2nm10nm102nm104nm0 1cm10cm103cm105cm 电磁波谱 将电磁辐射按照波长或频率的大小顺序排列起来即称为电磁波谱 光学导论 光学导论 粒 光子 能量E 普朗克常数h 电子伏特eVh 6 626 10 34J s1J 6 241 1018eV h hc 当物质所吸收的电磁辐射能量能够满足该物质由低能态 基态 跃迁至高能态 激发态 将产生吸收光谱 当物质通过电 热或光等激发至激发态 再从激发态过渡到低能态或基态时 将产生发射光谱 吸收光谱 发射光谱 光学导论 某分子的外层价电子从基态跃迁到激发态需要20eV 请问该分子吸收光的波长 解 1eV 1 602 10 19J根据公式 hc 则 hc 6 626 10 34 3 108 20 1 602 10 19 0 62 10 7m 62nm 紫外 可见分光光度法 什么是紫外 可见光谱 远紫外光区 10 200nm近紫外光区 200 400nmUVC 200 280nmUVB 280 320nmUVA 320 400nm可见光区 400 780nm红外光区 780nm 1mm 什么是紫外 可见分光光度法 基于分子外层价电子跃迁产生的在紫外 可见光谱区的吸收光谱进行分析的一种常用的光谱分析方法 ultravioletandvisible UV vis spectrophotometry 基本原理 分子的三种运动状态对应有一定的能级 即在分子中存在着 电子能级振动能级转动能级这三种能级都是量子化的 分子能量的变化 E Ee Ev Er Ee Ev Er 基本原理 基本原理 分子吸收光 电磁波 后产生的能量的变化 远红外光谱 转动光谱 中红外光谱 振动光谱 紫外 可见光谱 电子光谱 基本原理 带状光谱发生电子跃迁时必然要发生振动能级和转动能级的跃迁 这使得紫外 可见吸收光谱呈现带状 典型的紫外 可见吸收光谱图 吸收峰 最大吸收波长 max 基本原理 价电子 电子 饱和的单键 电子 不饱和的双键 三键n电子 孤对电子分子中分子轨道有成键轨道与反键轨道 它们的能级高低为 n n 非键轨道 反键轨道 反键轨道 成键轨道 成键轨道 n n 1 跃迁 饱和烃 C C C H 能量很高 200nm4 n 跃迁 含杂原子不饱和基团 C N C O 能量最小 200 400nm 基本原理 影响紫外 可见吸收光谱的因素 1共轭效应共轭体系越长 与 的能量差越小 红移效应和增色效应越明显 2立体化学效应空间位阻 跨环效应3溶剂的影响溶剂效应4体系pH的影响 Tips 由于溶剂对电子光谱图影响很大 因此 在吸收光谱图上或数据表中必须注明所用的溶剂 与已知化合物紫外光谱作对照时也应注明所用的溶剂是否相同 在进行紫外光谱法分析时 必须正确选择溶剂 朗伯 比尔定律 定量分析的基础 当强度为I0的一定波长的单色入射光束通过装有均匀待测物的溶液介质时 该光束将被部分吸收Ia 部分反射Ir 余下的则通过待测物的溶液It 即有 I0 Ia It Ir 朗伯 比尔定律 如果吸收介质是溶液 测定中一般是溶液 式中反射光强度主要与器皿的性质及溶液的性质有关 在相同的测定条件下 这些因素是固定不变的 并且反射光强度一般很小 所以可忽略不记 这样 I0 Ia It 朗伯 比尔定律 透光率 透光率表示透过光强度与入射光强度的比值 用T来表示 计算式为 T It I0T常用百分比 表示 吸光度 透光率的倒数的对数叫吸光度 用A表示 A lgT lg I0 It 朗伯 比尔定律 当用一束强度为I0的单色光垂直通过厚度为b 吸光物质浓度为c的溶液时 溶液的吸光度正比于溶液的厚度b和溶液中吸光物质的浓度c的乘积 朗伯 比尔定律 Io It b a A lg I0 It Kbc 朗伯 比尔定律 吸光系数 当溶液浓度c的单位为g L 溶液液层厚度b的单位为cm时 K叫 吸光系数 用a表示 其单位为L g 1 cm 1摩尔吸光系数 当溶液浓度c的单位为mol L 液层厚度b的单位为cm时 K叫 摩尔吸光系数 用 表示 其单位为L mol 1 cm 1 aM M为吸光物质的分子量 工作原理基仪器结构框图 光源 碘钨灯 氘灯 单色器 测量池 参比池 样品池 光电倍增管 数据处理和仪器控制 紫外 可见分光光度计 紫外 可见分光光度计 单光束分光光度计 双光束分光光度计 紫外 可见分光光度计 吸收池的材料 玻璃 360nm 2 25mm 紫外 可见分光光度计 石英 200nm 2 5mm 紫外 可见分光光度计 吸收池的形状 紫外 可见分光光度计 思考题 为什么紫外可见分光光度计的最大吸收值只能到3或者5 超过该值便会造成数据溢出 生物分子的紫外 可见吸收光谱 糖 紫外可见光谱在糖的分析中 主要作定量检测 最大吸收波长为218nm 多糖最大吸收波长为206nm 生物分子的紫外 可见吸收光谱 脂 脂肪 230 240nm 于有机溶剂中 如乙醇 正己烷等 类脂 维生素A 326nm于乙醇 番茄红素 番茄红素在溶剂正己烷中的谱图 番茄红素在溶剂石油醚中的谱图 生物分子的紫外 可见吸收光谱 生物分子的紫外 可见吸收光谱 蛋白质 Proteinsinsolutionabsorbultravioletlightwithabsorbancemaximaat280and200nm Aminoacidswitharomaticringsaretheprimaryreasonfortheabsorbancepeakat280nm Peptidebondsareprimarilyresponsibleforthepeakat200nm 酪氨酸 色氨酸 苯丙氨酸 生物分子的紫外 可见吸收光谱 核酸 嘌呤和嘧啶在250 280nm有强的吸收作用 综合起来在260nm吸收值最大 Tips 1 吸收强度 单核苷酸 单链DNA 双链DNA 增色效应 减色效应 2 A260 A280 1 8 2 0 DNA较纯A260 A2802 0 DNA样品中含有RNA 微生物的紫外 可见吸收光谱 600nm测细菌等微生物的浊度 用于估计细菌的生长情况 比如 得到的OD600的数值如果在0 6 0 8之间 表明细菌处于旺盛生长的对数生长期 OD600 3表明细菌已经饱和等 核酸蛋白测定仪 EppendorfBioPhotometerplus ELISA原理图 固相的抗原或抗体 免疫吸附剂 酶标记的抗原或抗体 标记物 酶作用的底物 显色剂 酶标仪 酶标仪 TecanInfinite 200Pro多功能酶标仪 ELISA 分子荧光光谱 什么是荧光光谱 某些物质经紫外 可见光照射后 能立即放出能量较低 亦即波长较长 的光 光致发光 当照射停止后 如化合物的发射在10 9秒钟内停止 则称荧光 fluorescence 超过此限度即称为磷光 phosphorescence 什么是荧光光谱 基本原理 Ee0 Ev0 Ev1 Ev2 Ev3 Ev4 Ee1 Ee2 荧光发射 当分子处于单重激发态的最低振动能层时 去活化的一种形式是以10 9 10 7s左右的短时间内发射光子返回基态 这一过程称为荧光发射 激发光谱 激发光谱 固定荧光发射波长 扫描激发波长 荧光激发光谱与紫外 可见吸收光谱类似 Why 横坐标是入射光 激发光 的波长 纵坐标是发射光 荧光 的强度 发射光谱 固定激发光波长 扫描发射波长 横坐标是发射光 荧光 的波长 纵坐标是发射光 荧光 的强度 发射光谱 荧光光谱 2 三维荧光光谱 IF f ex em 蒽的激发光谱 固定发射波长 扫描激发波长 IF f ex em 蒽的发射光谱 固定激发波长 扫描发射波长 蒽的三维等高线光谱图 蒽的三维等荧光强度光谱 荧光量子产率 荧光效率 kF为荧光发射过程的速率常数 取决于荧光物质的分子结构 Ki为其他过程 如振动弛豫等 的速率常数总和 主要取决于化学环境 同时也与荧光物质的分子结构有关 荧光与有机化合物的结构 1 是有机化合物产生荧光的主要跃迁类型 2 产生荧光的有机物质 都含有共轭双键体系 共轭体系越大 荧光越容易产生 产生荧光的条件 荧光物质的刚性和平面性增加 有利于荧光发射 3 刚性平面结构 荧光与有机化合物的结构 荧光强度与浓度的关系 荧光的淬灭 荧光淬灭 荧光分子与溶剂分子或其它溶质分子相互作用引起荧光强度降低或消失的现象 荧光淬灭剂 这些溶剂分子或其它溶质分子称为荧光淬灭剂 如卤素离子 重金属离子 氧分子 硝基 羰基 羧基化合物等 荧光能量共振转移 FRET 能量共振转移 FRET FluorescenceResonanceEnergyTransfer 相互作用的研究 荧光分光光度计 光源 氙灯 激发单色器 样品池 光电倍增管 数据处理仪器控制 发射单色器 问题 荧光分光光度计与紫外 可见分光光度计有何异同点 紫外 可见分光光度计 荧光 磷光 分光光度计 荧光分光光度计 样品池 1 样品池的材料 与紫外 可见分光光度计的吸收池一样 2 吸收池的形状 紫外 可见分光光度计的吸收池两面透光荧光分光光度计的样品池四面透光 问题 紫外 可见分光光度计的吸收池与荧光分光光度计的样品池有什么区别 荧光分光光度计 紫外 可见分光光度计测量池 吸收池 荧光分光光度计样品池 I0 It I0 It IF p 荧光分光光度计 荧光光谱的应用 芳香族化合物存在共轭的不饱和体系 是有机化合物荧光测定的主要类型 1 有机化合物的鉴定 荧光光谱的应用 2 分子标记与追踪 在生物学研究中 科学家们利用能发光的荧光分子对生物体进行标记 将荧光分子通过化学方法 挂在 其他 不可见 的分子上 原来不可见的部分就变得可见了 生物学家利用这种标记方法 把原本透明的细胞 细胞器或生物分子从黑暗的显微镜视场中 揪出来 量子点 无机纳米粒子 荧光染料 有机小分子 荧光蛋白 蛋白质 荧光光谱的应用 2 1荧光在核酸研究中的应用 电泳 MidoriGreen Ethidiumbromide 荧光光谱的应用 SYBRGreenI 2 2荧光在核酸研究中的应用实时定量荧光PCR RT qPCR 2 3荧光在核酸研究中的应用 分子信标 荧光光谱的应用 Taq Man 荧光光谱的应用 2 4荧光在蛋白质研究中的应用 几种含苯基侧链的氨基酸可以发出荧光 且受微环境变化的影响 因此可用于作为内源荧光探针来研究蛋白质构象 荧光光谱的应用 2 5ELISA中的 荧光 荧光光谱的应用 下村修等人于1962年在一种学名为Aequoreavictoria的水母中发现能发光的蛋白 绿色荧光蛋白 greenfluorescentprotein GFP 分子质量为26kDa 由238个氨基酸构成 2008年诺贝尔化学奖授予了下村修以及另外两位科学家 美国科学家马丁 沙尔菲和美籍华裔科学家钱永健 以表彰他们发现和发展了绿色荧光蛋白质技术 细胞标记 荧光光谱的应用 活体标记 荧光光谱的应用 1 传统的荧光分子在发光的同时 会产生具有毒性的氧自由基 导致被观察的细胞死亡 这叫做 光毒性 因此 在绿色荧光蛋白发现以前 科学家们只能通过荧光标记来研究死亡细胞静态结构 而绿色荧光蛋白的光毒性非常弱 非常适合用于标记活细胞 在GFP出现之前这完全不可想象 2 荧光蛋白与靶蛋白的连接可直接通过二者表达基因的融合 转导至宿主细胞 在宿主细胞中翻译表达出靶蛋白与荧光蛋白的复合体 绿色荧光蛋白 荧光光谱的应用 可以发出各种颜色荧光的荧光蛋白 荧光光谱的应用 荧光光谱的应用 量子点