地中海贫血的分子基础及产前诊断-徐湘民.ppt

和 地中海贫血的分子基础及产前诊断 徐湘民南方医科大学 医学遗传学教研室南方医院产前诊断和遗传病诊断技术中心 Zhongshan2007 November30 遗传性血红蛋白病Geneticdisordersofhumanhemoglobin 异常血红蛋白Abnormalhemoglobin Structuralvariants 地中海贫血 地贫 Thalassemias thalassemia thalassemia 遗传性持续性胎儿血红蛋白Hereditarypersistenceoffetalhemoglobin HPFH 地中海贫血是全球最大的单基因遗传病之一 中国南方不同高发地区人群携带率1 23 研究背景 全球血红蛋白病人群负荷 中国南方地中海贫血人群携带率 Xu etal JClinPathol2004 57 517 22 Cai etal ChiJEpidemiol2002 23 281 5 广州市主要出生缺陷的发生率 1998 2001 Pedigreefor thalassemiainatypicalfamily 地中海贫血 常染色体隐性遗传病 地贫是严重致死 致残性遗传性血液病 常染色体隐性遗传病 受累基因 地贫 珠蛋白基因 16p13 3 地贫 珠蛋白基因 11p15 3 突变纯合子 重型地贫 致死中间型地贫 致残 病理学基础 链比例失衡 地贫纯合子 致死性出生缺陷 重型 地贫 胎儿水肿综合征 早产死胎或出生前后死亡 可导致严重产科并发症 无理想治疗方法 重型 地贫 出生后1年内发病 多于未成年前因严重贫血而夭折 输血和去铁治疗可维持 代价昂贵 家系样品采集现场 中间型地贫是严重致残性遗传病 研究地中海贫血的意义 重症地贫患儿的出生是世界公认的公共卫生问题 通过产前诊断阻止重症患儿出生是首选预防措施 WHO优先推荐在发展中国家实施预防的遗传性疾病 预防地贫是中国南方高发区减少出生缺陷的战略需求 研究背景 中国需要解决的研究主题 发展用于临床和预防的分子诊断技术 高发地区人群中的遗传流行病学调查 开展人群水平的地中海贫血预防 指导制定计划 大人群监控和预防 用于基因分型 用于产前诊断 诊断筛查预防 地中海贫血的研究策略 研究背景 遗传流行病学调查 建立一系列诊断标准和诊断技术 地中海贫血的临床特征 小细胞低色素性溶血型贫血 中 重度 黄疸肝脾肿大 脾大明显 骨髓扩增发育迟缓合并感染Bart s水肿胎 地贫 宫内或出生后半小时内死亡 地中海贫血的血液学表型特征 RBC参数MCV MCH 细胞形态变化 Hb电泳分析HbA2 或 HbBart sHbH HbE 地贫血象 红细胞着色不足 异形红细胞和骨髓成红血细胞增多症 血红蛋白电泳图谱 12345 1 正常人HB2 轻型 地贫3 异常HBE杂合子4 新生儿HBBart s 地贫标准型 5 HBH NormalAA2AEBart sAFHA 500V 25min 地贫发生的分子病理学经典机制 地贫 基因缺失使基因功能丢失 地贫 结构基因变异使转录异常 50kb 10kb0kb10kb20kb30kb SEA Deletion 4 2 Deletion 3 7 Deletion 2 1 导致 地贫的不同类型的基因缺失 Globingenesaffectedbythalassemiadeletion 地贫疾病严重程度的单倍型顺序 2 1T 2 1 2T 1 1T Hematologicaldataoftheproposituseandherfamilymembers Differentpointmutationsreducing globingeneexpression Rund Rachmilewitz N Engl J Med 2005 353 1135 46 世界上不同种族的常见 地贫突变类型 种族突变类型 地中海人IVS 1 position110 G A CD39 nonsense CAG TAG IVS 1 position1 G A IVS 2 position745 C G IVS 1 position6 T C IVS 2 position1 G A 黑人 29 A G 88 C T Poly A AATAAA AACAAA 东南亚人 中国人CD41 42 Frameshift CTTT IVS 2 position654 C T 28 A G HbE G A CD17 nonsense AAG TAG IVS 1 position5 G C 亚洲印地安人IVS 1 position5 G C 619 bpdeletionCD8 9 Frameshift G IVS 1 position1 G T CD41 42 Frameshift CTTT Resultsofbloodanalysis DNAdiagnosisandmRNAdetectioninthefamilymembers Sequencingofthe globingeneamplifiedfromtheproband HeterozygosityfortheC Tsubstitutionatposition 90ofthe globingene 近年来发现的部分中国南方新突变 地中海贫血的产前诊断 胎儿取样技术 DNA诊断技术 地贫的诊断 地贫的诊断 羊膜穿刺 amniocentesis 抽取胎儿样品示意图 植入前基因诊断Preimplantationgeneticdiagnosis PGD 超声产前诊断Prenataldiagnosis Ultrasoundmeasurement 母体外周血分离胎儿细胞进行产前诊断Prenataldiagnosis Fetalcellsinthematernalcirculation 母体血浆或血清中胎儿DNA分析AnalysisoffetalDNAinmaternalplasmaandserum 目前及今后的胎儿产前诊断新技术 DingC ChiuRW LauTK LeungTN ChanLC ChanAY CharoenkwanP NgIS LawHY MaES XuX WanapirakC SanguansermsriT LiaoC AiMA ChuiDH CantorCR LoYM MSanalysisofsingle nucleotidedifferencesincirculatingnucleicacids Applicationtononinvasiveprenataldiagnosis ProcNatlAcadSciUSA 200420 101 29 10762 7 单碱基延伸产物的质谱分析 MF F 父亲的突变类型 SABER singleallelebaseextensionreaction 鉴定母血浆DNA中的父亲 地贫突变 地中海贫血的产前诊断 胎儿取样技术 DNA诊断技术 地贫的诊断 地贫的诊断 DNA诊断技术 多重PCR multiplexPCR 等位基因特异性性寡核苷酸杂交 ASO 反向点杂交 RDB 变性高效液相色谱 DHPLC 基于微孔板 microtiterwell based 高通量检测 实时PCR real timePCR 50kb 10kb0kb10kb20kb30kb SEA Deletion 4 2 Deletion 3 7 Deletion 2 1 导致 地贫的不同类型的基因缺失 Locationofprimersanddetectionof SEAdeletionbygap PCR Genotypingofthe SEAallelesbyGap PCR ChongSS etal Blood 2000 95 1 360 2 寡核苷酸探针杂交技术 ASO探针检测 地贫基因诊断结果 PCR B B B B B B gDNA Hybridization Detection Streptavidin POD ColorSignal M Membrane ASO NMNMNM Substrate TMB 反向点杂交技术 RDBanalysis applicationtorapidprenataldiagnosisforeight thalassaemiamutations GenotypeFatherCDs41 42 CTTT NMotherIVS 2 654 C T NFetusCDs41 42 IVS 2 654NormalcontrolN N Human globingeneandthePCRamplicons 68uniquelyprofiledDHPLCpatternsobservedfrom795DNAsamples 实验结果 实验结果 实验结果 实验结果 实验结果 中国南方 和 地中海贫血的预防计划人群筛查预防计划的策略 医院水平 Hospital based 的预防计划 社区水平 community based 的预防计划 家系扩展筛查 screeningextendedfamilies Carrierscreeningfor and thalassemiainpregnancy theresultsofan11 yearprospectiveprograminGuangzhouMaternalandNeonatalHospitalGuangzhouMaternalandNeonatalHospitalLiaoCLiJHuangYNLiQMFengQZhongHZCuiYYSouthernMedicalUniversityMoQHLiLYHuaLZhangJZZengRJiaSQXuXM PrenatDiagn2004 25 163 71 地贫携带者筛查及产前诊断流程 OutcomesofscreeningprograminGZMNH1993 2003 cont d Prenataldiagnosisin83fetusesat riskfor thalassemia cont d Resultsin266pregnancieswhereaprecisediagnosiswasachieved ThreeHbHdiseaseinvolved 筛查发现的阳性孕妇或阳性夫妇 地贫1 地贫 地贫 地贫5 7 3 6 4 4 1 8 Totalof4503couplesscreened OutcomesofscreeningprograminGZMNH1993 2003 49221例被筛查的孕妇 4587 9 3 地贫特征 病例 2804 5 7 地贫 1783 3 6 地贫 139例其他异常Hb个体44495例正常表型个体 4503 98 2 阳性孕妇的配偶被筛查 281 6 2 例高风险妊娠 198重型 地贫 83重型 地贫 84 1 8 例配偶未接受筛查 281 100 例高风险妊娠孕妇进入跟踪随访 4222例非风险妊娠 269 95 7 孕妇实施产前诊断 187 地贫 83 地贫 1双胞胎 72 26 7 孕妇要求终止妊娠 54重型 地贫 18重型 地贫 1双胞胎 69重型地贫被预防 51水肿胎 18重型 地贫 1双胞胎 12孕妇不接受产前诊断 197例孕妇继续妊娠 3例HbH病出生 2例水肿胎出生 自行研制的东南亚型 地贫 链免疫学检测试剂盒 A B 产前遗传学的临床和公共卫生问题利用有效的公共卫生教育资源 首先使医生和公众了解更多的地贫知识和知晓选择遗传服务及其对待产前诊断的态度是我们面临的一个重要课题 2 为满足大规模预防工作的需要 我们须大力加强专科医生 遗传咨询师