艾滋与梅毒实验室检查医学PPT.ppt

免疫学实验室检查 1 医药交流PPT 内容介绍1 HIV实验室检查2 梅毒实验室检查3 丙肝实验室检查 2 医药交流PPT 简介 艾滋病 医学全名为 获得性免疫缺陷综合征 AcquiredImmuneDeficiencySyndrome AIDS 是人体感染了人类免疫缺陷病毒 HIVhumanimmunodeficiencyvirus 又称艾滋病病毒所导致的传染病 值得一提的是 HIV本身并不会引发任何疾病 而是当免疫系统被HIV破坏后 人体由于失去抵抗能力而感染其他的疾病导致死亡 通俗地讲 艾滋病就是人体的免疫系统被艾滋病病毒破坏 使人体对威胁生命的各种病原体丧失了抵抗能力 从而发生多种感染或肿瘤 最后导致死亡的一种严重传染病 这种病毒终生传染 破坏人的免疫系统 使人体丧失抵抗各种疾病的能力 当艾滋病病毒感染者的免疫功能受到病毒的严重破坏 以至不能维持最低的抗病能力时 感染者便发展为艾滋病病人 随着人体免疫力的降低 人会越来越频繁地感染上各种致病微生物 而且感染的程度也会变得越来越严重 最终会因各种复合感染而导致死亡 艾滋病主要通过血液 不正当的性行为 吸毒和母婴遗传四种途径传播 国际医学界至今尚无防治艾滋病的有效药物和疗法 因此 艾滋病也被称为 超级癌症 和 世纪杀手 3 医药交流PPT 目前流行趋势从1981年发现第一例病例起 至2011年 已有超过2500W人死于HIV感染 3400W人携带 感染HIV 年新增感染HIV人数超过250W 年死亡170W 约97 的发病出现在中低收入国家 其中15 24岁感染者约占总数的39 我国概况从1985年中国发现第一例HIV病例起 截止2013年8月份 发现HIV及其携带者超过60W人 死亡超12W人 近年15至24岁所占感染者比例逐年增加 同性恋之间感染所占比例也逐年上升 尤以男男性行为增加最为迅速 50岁以上异性传播比例也有增长趋势 HIV传播途径HIV主要存在于感染者和病人的血液 精液 阴道分泌物 乳汁和伤口渗出液中 故性接触 包括同性 异性和双性性接触 血液及血制品 包括共用针具 介入性医疗操作等 和母婴垂直传播 包括产前 产中和产后 为其主要传播途径 正常的人际间交往如拥抱 共同用餐等不会传播HIV 4 医药交流PPT HIV构造及其抗原 人类免疫缺陷病毒直径约120纳米 大致呈球形 病毒外膜是类脂包膜 来自宿主细胞 并嵌有病毒的蛋白gp120与gp41 gp41是跨膜蛋白 gp120位于表面 并与gp41通过非共价作用结合 向内是由蛋白p17形成的球形基质 Matrix 以及蛋白p24形成的半锥形衣壳 Capsid 衣壳在电镜下呈高电子密度 衣壳内含有病毒的RNA基因组 酶 逆转录酶 整合酶 蛋白酶 以及其他来自宿主细胞的成分 如tRNAlys3 作为逆转录的引物 gp120和gp41构成感染因子主要结构 HIV 1型与HIV 2型区别在于含有VPU基因 VPU基因为HIV 1所特有 对HIV的有效复制及病毒体的装配与成熟不可少 5 医药交流PPT 艾滋病窗口期 从感染艾滋病病毒到血液中能够检测出艾滋病病毒抗体这段时间称为 窗口期 一般为2周 3个月 有极少数人可长达6个月 在 窗口期 作艾滋病病毒抗体检测 结果呈 阴性 但是体内有病毒 有较强的传染性 可以将病毒传播给他人 6 医药交流PPT 艾滋病潜伏期 潜伏期 从艾滋病病毒侵入人体到出现临床症状之前这段时间 艾滋病平均潜伏期为7 10年 处于潜伏期的感染者没有症状 体表外观等一般状况正常 与常人无异 对早期发现及预防造成很大困难 潜伏期不是静止期 更不是安全期 病毒在持续繁殖 具有强烈的破坏作用 有传染性 可以将病毒传播给他人 7 医药交流PPT 8 医药交流PPT HIV抗体检测 1 酶联免疫法 ELISA 可使用血液 唾液 尿液样品 ELISA多为单纯HIV抗体检测试剂 HIV抗原抗体联合检测试剂可同时检测血液中HIV 1P24抗原和HIV 1 2抗体 HIV抗原或抗体包被于固相载体 加入待检样品和酶标记的HIV抗原或抗体 加底物显色 用酶标仪测定结果 有效试验的阴性和阳性对照必须符合试剂盒规定 2 化学发光或免疫荧光试验这类试剂采用发光或荧光底物 既可检测抗体 也可联合检测抗原抗体 HIV抗原或抗体包被于固相载体 加入待检样品和酶或荧光标记的HIV抗原或抗体 加发光或荧光底物 用发光或荧光仪测定结果 有效试验的阴性和阳性对照必须符合试剂盒规定 3 快速检测 RT 及其它抗体检测试验免疫层析试验 以硝酸纤维膜为载体 HIV抗原线状固定在膜上 待检样品 血液或唾液 沿着固相载体迁移 阳性结果在膜上抗原部位显示出有色条带 有效试验的质控带必须显色 其他还有免疫渗滤实验和凝胶凝集实验等 9 医药交流PPT HIV抗原检测 病原检测主要指用病毒分离培养 电镜形态观察 病毒抗原检测和基因测定等方法从宿主标本中直接检测病毒或病毒基因 由于前两种方法难度大 且需要特殊设备和专业技术人员 因此仅抗原检测和RT PCR 反转录 PCR 可用于临床诊断 HIV 1P24抗原检测可用于HIV 1抗体不确定或窗口期的辅助诊断 HIV 1抗体阳性母亲所生婴儿早期的辅助鉴别诊断 HIV 1抗原 抗体ELISA试剂检测呈阳性 但HIV 1抗体确认阴性者的辅助诊断 P24抗原检测一般用ELISA双抗体夹心法试剂HIV核酸检测可用于HIV感染的辅助诊断 病程监控 指导治疗方案及疗效判定 预测疾病进展等 常用的HIV病毒载量检测方法包括逆转录PCR实验 RT PCR 核酸序列扩增实验 NASBA 分支DNA杂交实验 bDNA 以及实时荧光定量PCR技术 10 医药交流PPT HIV实验室生物安全防护 菌种的分类根据其危险性决定 包括实验室感染的可能性 感染后发病的可能性 症状轻重及愈后情况 有无致命危险及有效的防止实验室感染方法 用一般的微生物操作方法能否防止实验室感染 我国有否此种菌种及曾否引起流行 人群免疫力等情况 依其危险程度的大小 我国的菌种分为四类 致病性病原微生物可根据其易感程度分为四类 第一类 第二类病原微生物统称为高致病性病原微生物 人类免疫缺陷病毒 HIV 属第二类病原微生物 是高致病性病原微生物 HIV抗体检测 包括筛查和确证实验 抗原检测和相关的免疫学检测应在符合 级生物安全实验室 BSL 2 要求的艾滋病检测实验室中进行 HIV分离培养 浓缩 中和试验 细胞培养及研究工作及其它需要应用活病毒的研究工作 应在 级生物安全实验室 BSL 3 中进行 HIV核酸提取和检测均应在符合 级生物安全实验室 BSL 2 要求的艾滋病检测实验室中进行 HIV病毒株应保存在符合 级生物安全实验室 BSL 3 要求的艾滋病实验室 HIV阳性样品 包括全血 血清 血桨和其他组织 液 核酸提取物应保存在符合BSL 2要求的艾滋病实验室 11 医药交流PPT 二类生物安全实验室定义生物安全实验室 biosafetylaboratory 也称生物安全防护实验室 biosafetycontainmentforlaboratories 是通过防护屏障和管理措施 能够避免或控制被操作的有害生物因子危害 达到生物安全要求的生物实验室和动物实验室二级实验室要求 对人体 动植物或环境具有中等危害或具有潜在危险的致病因子 对健康成人 动物和环境不会造成严重危害 有有效的预防和治疗措施 实验设施二级生物安全柜高压消毒锅普通冰箱恒温培养箱定时器冰冻离心机试管试管架移液管无菌吸管痰盒等等实验室安全制度准入制度个人防护制度标本接收制度废弃物处理制度 12 医药交流PPT 准入制度要点实验室应进行全员安全培训并强化 普遍性防护原则 安全意识 所有的血液 未固定的组织和组织液样品 均应视为有潜在的传染性 都应以安全的方式进行操作 所有管理和检测人员都应接受省级以上艾滋病检测实验室主持的安全培训 包括上岗前培训和复训 并接受管理人员的监督 必须对新上岗人员进行安全教育和培训 使他们清楚实验室工作的潜在危险 通过考核等方式确认他们具备安全操作的能力后方可单独工作 必须对新调入人员 外来合作 进修和学习的人员进行生物安全培训 经实验室主任批准后 方可进入实验室 生物安全培训和监督应有客观详实的记录 实验室主任应详细了解所有工作人员的教育和培训背景 特长 性格特点等 要根据人员特点 工作种类 所涉及的生物材料合理安排工作区域 要定期对实验室环境进行安全检查 个人防护制度要点鉴于我国性病 结核病实验室的基本情况 实验工作内容 感染控制的原理 个人防护为是最重要的 也是最后一道防护屏障 必须给予足够重视 穿戴顺序 口罩 帽子 防护服 护目镜 鞋套 双层手套 脱下顺序 外层手套 护目镜 防护服 内层手套 帽子 鞋套 口罩防护用品使用后应进行无害化处理后再做废弃处置遇有手部皮肤有开放性伤口及其他不适于工作的情况 应暂停工作 皮肤的微小伤口 擦伤 皲裂等 应用防水敷料严密覆盖 工作人员上岗前必须进行HIV抗体和乙型肝炎病毒 丙型肝炎病毒等肝炎病毒标志物检测 应接种乙肝疫苗 应每年对工作人员采血检测HIV抗体 血清应长期保留 进实验室工作前要摘除首饰 修剪长的带刺的指甲 以免刺破手套 严禁在实验室内进食 饮水 吸烟和化妆 操作过程中 如发现防护服被污染应立即更换 如手套破损 应立即丢弃 洗手并换上新手套 不能用戴手套的手触摸暴露的皮肤 口唇 眼睛 耳朵和头发等 13 医药交流PPT 实验室应设置应急冲洗眼睛装置 意外事故处理发生意外事故时 应针对事故的类型立即进行紧急处理 主要包括 皮肤针刺伤或切割伤 应立即用肥皂和大量流水冲洗 尽可能挤出损伤处的血液 用70 乙醇或其它消毒剂消毒伤口 皮肤污染 用水和肥皂冲洗污染部位 并用适当的消毒剂浸泡 如70 乙醇或其它皮肤消毒剂 粘膜污染 用大量流水或生理盐水冲洗污染部位 衣物污染 尽快脱掉污染的衣物 进行消毒处理 污染物泼溅 小范围污染物泼溅 应立即进行消毒处理和清洗 发生大范围污染物泼溅事故时 应立即通知实验室主管领导和安全负责人到达事故现场 查清情况 确定消毒的程序 发生空气污染时 可采用低温蒸汽甲醛气体对空气进行消毒 但甲醛有致癌作用 不宜用于生物安全柜和实验室的常规空气消毒 如果发生重大泼溅事故 应采取以下措施进行 从污染处疏散人员 但要防止污染扩散 控制污染扩散 锁门并禁止人员进入 通知实验室主管领导 安全负责人等 查清情况 确定消毒处理的程序 14 医药交流PPT 标本接受制度要点检测方法不同 要求的标本不同全血 血清 血浆 唾液 尿液以及DBS样品可用于HIV抗体检测 抗凝全血可用于CD4 和CD8 T淋巴细胞测定 血浆可用于HIV 1病毒载量 基因型及耐药检测 DBS样品可用于HIV 1基因型及耐药检测 全血 血浆 淋巴细胞富集液 外周血淋巴细胞 PBMC 及DBS 干血斑样品 样品可用于HIV核酸的定性检测 PBMC 全血 淋巴细胞富集液等可用于HIV 1分离培养 样品的编码和记录应制定样品编码的标准操作程序 SOP 规定样品编码的原则和方法 为样品制定唯一性编码 编号 保证其唯一性 采血前 先对装有样品的离心管或滤纸进行标记 核对后编码 要将标签贴在试管的侧面 最好使用预先印制好的 专门用于冷冻储存的耐低温标签 应使用专门的样品记录本或登记表记录样品 同时录入电脑保存 样品保存用于抗体和抗原检测的血清或血浆样品 短期 1周 内进行检测的可存放于2 8 一周以上应存放于 20 以下 用于核酸检测的血浆和血细胞样品4天内进行检测的可存放于4 3个月以内应存放于 20 以下 3个月以上应置于 70 以下 艾滋病检测筛查实验室检测的筛查阳性样品应及时送确证实验室 筛查阴性样品 可根据具体需要决定保存时间 建议至少保存1 2个月 特殊用途或专项项目的样品根据具体要求确定保存时间 艾滋病检测确证实验室收到的筛查阳性样品 无论确证结果如何 均应将剩余的样品保存至少10年 特殊用途或专项项目的样品根据具体要求确定保存时间 15 医药交流PPT 废弃物处理制度要点应按照 实验室生物安全通用要求 GB19489 2004 和 消毒技术规范 2002年版 处置实验室废弃物 艾滋病实验室产生的所有废弃物 包括不再需要的样品 培养物和其它物品 均应视为感染性废弃物 应置于专用的密封防漏容器中 安全运至消毒室 经高压消毒后再进行处理或废弃 艾滋病检测实验室物品常用的化学消毒方法废弃物缸 5000mg L次氯酸钠 生物安全柜工作台面和仪器表面 75 乙醇 溢出物 5000mg L次氯酸钠 污染的台面和器具 2000mg L次氯酸钠 也可以用过氧化氢或过氧乙酸 器械可用2 戊二醛消毒 物理消毒法高压蒸汽消毒 121 保持15 20min 干燥空气烘箱消毒 干烤消毒 140 保持2 3h 16 医药交流PPT 17 医药交流PPT HIV孕妇检测流层 18 医药交流PPT VCT的替代策略 19 医药交流PPT HIV感染孕妇所生儿童 20 医药交流PPT 筛查实验室的一些工作要点 做为筛查实验室 应有2种方法不同但性能均符合要求的HIV抗体检测试剂备用 试剂间的特异性和敏感度应有区别 不一定两者均要达到很高的标准 不现实 以便进行复检时互为补充 质控样品检测关系工作开展的有效性 应严格执行 使HIV筛查工作质量能有保证 科室的应养成生物安全观念 注意清洁区 半污染区及污染区的位置 在各区的行为均应遵守实验室SOP中的规范 认真做好各项记录工作 记录的目的是保证实验室工作的可溯源性 也是保证实验室自身工作质量的可靠性的唯一证据 21 医药交流PPT 梅毒实验室检查 梅毒螺旋体 属于密螺旋体属 苍白密螺旋体苍白亚种 Treponemapallidumsubspeciespallidum 苍白亚种梅毒苍白螺旋体地方亚种地方性梅毒极细亚种雅司病密螺旋体属品他螺旋体品他病 22 医药交流PPT 梅毒螺旋体 23 医药交流PPT 传播途径 性接触是主要的传染途径未经治疗的患者在感染后的1年内最具有传染性 随着病期的延长 传染性越来越小 到感染后2年 通过性接触一般无传染性 母婴传播在妊娠7周时 梅毒螺旋体即可通过胎盘传染未经治疗者 虽已无性传播 病期 2年 但妊娠时仍可传染给胎儿 病期越长 传染性越小 输血传染间接传播 日常用品 接吻 哺乳 医疗器械等途径 接触部位附有梅毒螺旋体 24 医药交流PPT 梅毒的分期 25 医药交流PPT 梅毒的诊断 梅毒的诊断早期梅毒 一期 二期和早期隐性梅毒 和晚期梅毒 三期和晚期隐性梅毒 必须依靠病史 症状及实验检查进行综合分析梅毒的实验室检查结果对诊断有决定性意义 26 医药交流PPT 梅毒血清学检测分类 非梅毒螺旋体抗原血清学试验 非特异性梅毒抗体 梅毒螺旋体抗原血清学试验 特异性梅毒抗体 27 医药交流PPT 非梅毒螺旋体抗原血清学试验 原理 抗心磷脂抗体 人体感染了梅毒螺旋体后 组织受到破坏 释放出来的一种类脂成分 与梅毒螺旋体结合形成完全抗原 刺激机体产生类脂质抗体 反应素 主要是IgM和IgG混合抗体 抗体产生时间感染3周 4周 硬下疳出现1周 2周一般在感染后5 7周 或硬下疳出现后2 3周 产生 抗体作用无保护作用 治疗监测 未经治疗的病人 其血清内的反应素可长期存在 经正规治疗后 反应素可以逐渐减少至转为阴性 28 医药交流PPT 原理和方法 反应原理抗原抗体结合形成复合物 凝集成网状沉淀颗粒被肉眼所见抗原基本成分心磷脂 卵磷脂和胆固醇方法包括 快速血浆反应素环状卡片试验 RPR 不加热血清反应素 USR 甲苯胺红不加热血清试验 TRUST 性病研究实验室试验 VDRL 等 29 医药交流PPT 四种非特异性试验方法比较 30 医药交流PPT RPR TRUST检测流程 试验前期准备RPR仪 水平旋转仪器 必须滴 RPR试剂50 l移液器 吸头记号笔 废物缸工作服一次性手套 口罩 帽子生物安全柜 31 医药交流PPT 梅毒自动旋转仪 32 医药交流PPT 测速 100转 MIN 2转 33 医药交流PPT 检测流程 定性 加样 吸取50 l血清 浆 放在卡片圈中 并均匀地涂布在整个圈内 加抗原 将抗原轻轻摇匀 用试剂盒提供的针头加1滴抗原 反应 将卡片置梅毒自动旋转仪8分钟立即在亮光下观察结果 34 医药交流PPT 检测流程 定量 稀释液准备 在圈内加入50 l生理盐水 根据需要确定稀释度 勿将盐水涂开 加样 吸取50 l血清 浆 与各圈中盐水作系列稀释 并涂布满整个圈内 重复定性试验后两步 35 医药交流PPT 凝集反应强度分级 3 4 圆圈内出现中到大的红色絮状物 液体清亮 2 圆圈内出现小到大的红色絮状物 液体较清亮 1 圆圈内出现小的红色絮状物 液体浑浊 圆圈内仅见红色集中于中央一点或均匀分散 36 医药交流PPT RPR定量试验 中等至大的凝块为阳性 圈4和7 有明确但很小的凝块为弱阳性 圈2和3 颗粒均匀分布 圈1 5 8 10 或稍粗糙 圈6 为阴性 37 医药交流PPT 38 医药交流PPT 临床意义 早期梅毒 一期 二期 经足量规则抗梅毒治疗后3个月 VDRL试验抗体滴度下降2个稀释度 6个月下降4个稀释度 一期梅毒1年后转为阴性二期梅毒2年后转为阴性 晚期梅毒治疗后血清滴度下降缓慢 2年后约50 病人血清反应仍为阳性早期梅毒硬下疳出现1周 2周后 血清可呈阳性 经治疗后血清滴度可下降并阴性 故可作为疗效观察 判愈 复发或再感染的指征 39 医药交流PPT 假阳性问题 假阳性 非梅毒患者的血清反应呈阳性 技术性假阳性由于标本的保存不当 如细胞污染或溶血 试剂质量差或过期 或实验室操作错误所造成 生物学假阳性是由于患者有其他疾病或生理状态发生变化 使梅毒血清试验出现阳性 40 医药交流PPT 急性生物学假阳性反应的疾病 风疹水痘传染性单核细胞增多症传染性肝炎上呼吸道感染肺炎球菌性肺炎病毒性肺炎牛痘疹 41 医药交流PPT 慢性生物学假阳性反应的疾病 系统性红斑狼疮自身免疫性溶血性贫血盘状红斑狼疮结节性多动脉炎类风湿性关节炎桥本氏甲状腺炎 风湿性心脏病干燥综合征毒品瘾者慢性肾炎肝硬化老年麻风 是唯一产生慢性生物学假阳性的感染性疾病 42 医药交流PPT 假阳性问题 梅毒假阳性反应的处理技术性假阳性反应一般是由于操作错误引起的假阳性反应 经过重复试验即可除外 对急性生物学假阳性反应 应做TPHA TPPA 等试验进行排除 43 医药交流PPT 前带现象 原理指二期梅毒患者非梅毒螺旋体抗原血清试验中 有时血清中存在高浓度的抗体时出现的弱阳性 不典型或阴性反应的结果 处理将血清稀释后再进行试验 44 医药交流PPT 血清固定 耐血清性 血清固定 指经抗梅毒治疗后 非梅毒螺旋体抗原血清试验在一定时期内不阴转 早期的耐血清性常与治疗量不足或不规则治疗 复发 再感染或有神经系统梅毒等因素有关 45 医药交流PPT 梅毒螺旋体抗原血清学试验 46 医药交流PPT 试验原理 检测血中特异性抗梅毒螺旋体特异蛋白为抗原的抗体 IgG和IgM 特异性IgM型抗梅毒螺旋体抗体 感染2周后即可测出 47 医药交流PPT 实验方法 梅毒螺旋体颗粒凝集试验 TPPA 梅毒螺旋体血球凝集试验 TPHA 梅毒酶联免疫吸附试验 TP ELISA 梅毒免疫层析法 梅毒快速检测 RT 荧光螺旋体抗体吸收试验 FTA ABS 化学发光免疫分析法 CLIA 梅毒螺旋体蛋白印迹试验 WB 48 医药交流PPT TPPA TPHA原理 TPPA试验原理与TPHA试验基本相同TPPA试验用梅毒螺旋体致敏明胶颗粒TPHA试验中梅毒螺旋体致敏羊红细胞特点梅毒螺旋体 Nichols株 全抗原 49 医药交流PPT 操作步骤 1 试剂准备 试验前将试剂和待检标本恢复到室温 2 加稀释液 每份样本做4孔 加标本稀释液加至微量反应板孔内 第1孔100微升 第2 4孔各25微升 3 样本稀释 取血清25微升加至第1孔 混匀后取25微升至第2孔 混匀后取25微升至第3孔 混匀后取25微升至第4孔 混匀后弃去25微升 4 加对照液 第3孔加未致敏颗粒25微升 第4孔加致敏颗粒25微升 5 混合 将反应板置振荡器振荡30秒 6 反应 置有盖湿盒 孵育2h 或放4 冰箱过夜观察结果 50 医药交流PPT 结果判断 1 观察加未致敏颗粒的第3孔 不出现凝集为有效试验 2 观察凝集反应强度 分级如下 4 颗粒光滑覆盖整个孔底 有时边缘有折叠 3 颗粒光滑覆盖大部分孔底 2 颗粒光滑集聚覆盖孔底 周围有一颗粒环 1 颗粒光滑集聚覆盖孔底 周围有一明显颗粒环 颗粒沉集孔底 中央形成一小点 一 颗粒紧密沉积孔底中央 51 医药交流PPT 52 医药交流PPT TP ELISA 原理用重组梅毒螺旋体抗原包被固相板条 加上梅毒血清和单克隆抗体酶标记物 形成抗原抗体复合物与酶标记物结合 用酶联检测仪判定试验阳性反应 特点本法可用于大规模血清检测 53 医药交流PPT 免疫层析 54 医药交流PPT 临床应用 梅毒螺旋体试验的作用是作为证实试验它们可以帮助确定非梅毒螺旋体试验阳性反应是真阳性还是假阳性 一旦这些试验呈阳性 则患者终身阳性 55 医药交流PPT 方法特点 特异性强 敏感性高很少出现假阳性 据统计 在普通人群中 有1 的生物学假阳性发生 如系统性红斑狼疮患者血清可使FTA ABS试验呈假阳性反应 但大多数病例中螺旋体呈串株状荧光 传染性单核细胞增多症 可能由于嗜异性抗体所致 可使TPHA呈假阳性 麻风患者也可使特异试验呈阳性 56 医药交流PPT 临床意义 作为RPR初筛阳性标本的确证试验 不能作为疗效观察的