治疗性克隆研究的现状与展望课件.pptVIP

治疗性克隆研究的现状与展望 Currentstatusandprospectoftherapeuticclonestudy Islettransplantationinsevenpatientswithtype1diabetesmellitususingaglucocorticoid freeimmunosuppressiveregimen A M JamesShapiro etal UniversityofAlbertaHospital Edmonton Canada NewEnglJMed2000 343 4 230 238 核心内容如下 胰岛分离纯化后即刻进行移植移植足够数量的胰岛组织 两名或以上供体 抗免疫排斥反应采用非类固醇激素的药物和单克隆抗体 2 医药交流课件 胰岛移植示意图 3 医药交流课件 Edmonton方案的最新进展 国际多中心临床试验结果显示 一年以上不依赖胰岛素治疗者达64 三年以上不依赖胰岛素治疗者达53 血清中能检测到C肽者达72 值得一提的是 有四家开始参与该研究的中心未能获得任何一例的成功胰岛移植是治愈糖尿病的潜在希望 ADAannualMeeting 2004 Orlando 4 医药交流课件 胰岛移植面临的两大挑战 胰岛组织来源 远远满足不了需要免疫排斥反应 移植失败的重要原因 5 医药交流课件 DefinitionofStemCells Self renewalMulti lineagedifferentiation Cornea Pancreas Nerve Liver Skin 6 医药交流课件 ClassificationofStemCells DifferentiationcapacityTotipotentstemcellsPluripotent multipotent stemcellsOligopotent unipotent stemcellsSourceEmbryonicstem ES cellsSomatic adult stemcells 7 医药交流课件 WhatisEScells Primitive undifferentiated cellsfromtheembryothathavethepotentialtobecomeawidevarietyofspecializedcelltypes EScells Pluripotentstemcells Invitrofertilization Totipotentcells Blastocyst Innercellmass ICM NIH sdefinition 8 医药交流课件 胚胎干细胞的研究历程 1981年 Martin从小鼠囊胚中分离出胚胎干细胞并在体外培养1995年 Thomson从恒河猴囊胚中分离并建立了第一个灵长类动物的胚胎干细胞系 MartinGR PNAS 1981 78 12 7634 7638ThomsonJA etal PNAS 1995 92 17 7844 7848 9 医药交流课件 1999年 杂志将干细胞研究评为世界十大科学成就之首 列在了人类基因组计划之前 里程碑 1998年 美国学者Thomson和Gearhart分别从体外受精形成的囊胚中及从5 9周龄流产胎儿的性腺脊和肠系膜中建立了人胚胎干细胞系 Thomson和Gearhart采用不同的途径成功培养干细胞的过程 ThomsonJA etal Science 1998 282 5391 1145 1147ShamblottMJ etal PNAS 1998 95 23 13726 13731GearhartJD Science 1998 282 5391 1061 1062 10 医药交流课件 Milestone In2004 ScientistsfromKoreaandU S Areportedthederivationofapluripotentembryonicstemcellline SCNT hES 1 fromaclonedhumanblastocyst HwangWS etal Science2004 303 5664 1669 1674 11 医药交流课件 人胚胎干细胞的来源 Gearhart取自终止妊娠的胎儿早期性器官组织Thomson取自体外受精胚胎囊胚期的内细胞团Moon通过体细胞核转移技术获得 ThomsonJA etal Science 1998 282 5391 1145 1147ShamblottMJ etal PNAS 1998 95 23 13726 13731HwangWS etal Science2004 303 5664 1669 1674 12 医药交流课件 Gearhart 13 医药交流课件 Thomson 14 医药交流课件 Moon 15 医药交流课件 16 医药交流课件 人胚胎干细胞 hES 的特点 形态 圆形或椭圆 体积较小 核质比较大 体外抑制分化培养时成鸟巢状 集落生长并紧密堆积 细胞界限不明显 ThomsonJA etal Science 1998 282 5391 1145 1147HwangWS etal Science2004 303 5664 1669 1674彭红梅等 北京大学学报 医学版 2004 36 6 605 608 17 医药交流课件 增殖速度 18 24h分裂增殖一次hES体外培养要解决的关键问题是维持细胞的分裂增殖而抑制其分化hES必须在含有白血病抑制因子 LIF 的培养基及成纤维细胞饲养层 freedercells 的条件下才能保持增殖而不分化具有分化成外 中 内三个胚层的潜能能形成嵌合体动物 从而成为联系细胞和个体之间的桥梁 ThomsonJA etal Science 1998 282 5391 1145 1147HwangWS etal Science2004 303 5664 1669 1674彭红梅等 北京大学学报 医学版 2004 36 6 605 608 18 医药交流课件 人胚胎干细胞的鉴定 人胚胎干细胞具有正常稳定的二倍体核型和带型胚胎干细胞具有较高的端粒酶活性及碱性磷酸酶的表达人胚胎干细胞系端粒酶活性都很高 说明其可在体外未分化状态下进行长期培养 ThomsonJA etal Science 1998 282 5391 1145 1147HwangWS etal Science2004 303 5664 1669 1674 19 医药交流课件 hES细胞有特异性表面抗原的表达 鼠和人胚胎干细胞表达的表面抗原有种属差异 Gearhart等认为SSEA 1阳性可能是源于原始生殖细胞的多能干细胞分化的标志 HwangWS etal Science2004 303 5664 1669 1674ThomsonJA etal Science 1998 282 5391 1145 1147ShamblottMJ etal PNAS 1998 95 23 13726 13731ThomsonJA etal PNAS 1995 92 17 7844 7848 20 医药交流课件 具有转录因子Oct 4的表达小鼠Oct 4只限定在多潜能细胞中表达 人和小鼠的胚胎干细胞都表达Oct 4 当胚胎干细胞分化时 其表达水平大大降低Oct 4可能是哺乳动物不同发育阶段多潜能细胞所特有的少数特异性调控分子之一 ThomsonJA etal Science 1998 282 5391 1145 1147HwangWS etal Science2004 303 5664 1669 1674彭红梅等 北京大学学报 医学版 2004 36 6 605 608 21 医药交流课件 人胚胎干细胞具分化的多潜能性 hES 注射 小鼠皮下 Ectoderm Mesoderm Endoderm Nerve Skin Adrenal Blood Heart Muscle Bone Pancreas Liver Bothinvivoandinvitro 22 医药交流课件 彭红梅等 北京大学学报 医学版 2004 36 4 431 434 碱性磷酸酶染色 SSEA 1染色 裸鼠皮下接种 腺样体结构 神经组织结构 软骨组织结构 23 医药交流课件 彭红梅等 北京大学学报 医学版 2004 36 6 605 608 拟胚体 EB 培养 分子标志的表达 1周 2周 3周 4周 hES1周2周3周4周MEF Lanes Oct 4 Nestin NSE GFAP SNAP NFH PDX 1 Insulin Glucagon AFP Globulin GAPDH MEF mouseembryonicfibroblastsNSE neuronspecificenolaseGFAP glialfibrillaryacidicproteinSNAP synaptosome associatedproteinNFH neurofilamentheavychain 24 医药交流课件 FromEmbryonicStemCellstoInsulin SecretingCells 25 医药交流课件 胚胎干细胞分化为胰岛 细胞的路径 EScells Ectoderm 26 医药交流课件 FrommouseEScellstoinsulin secretingpancreaticisletcluster Five stageprotocol LumelskyN etal Science2001 292 5520 1389 1394 Stage1ExpansionofEScells Stage2GenerationofEBs Stage3Selectionofnestin cells Stage4Expansionofpancreaticendocrineprogenitorcells Stage5Inductionofdifferentiationandmorphogenesisofinsulin secretingisletcluster 2 3days 4days 6 7days 6days 6days 27 医药交流课件 LumelskyN etal Science2001 292 5520 1389 1394 28 医药交流课件 LumelskyN etal Science2001 292 5520 1389 1394 29 医药交流课件 主要结论 从小鼠ES细胞诱导分化产生可表达胰岛素和其它胰腺内分泌激素的细胞该细胞可自聚集形成类似正常胰岛的三维结构葡萄糖可促发这些细胞群释放胰岛素 其机制类似体内的刺激作用移植到糖尿病小鼠体内时 这些胰岛素产生细胞出现快速的血管化 并保持胰岛样结构 但没有明显的降血糖作用 LumelskyN etal Science2001 292 5520 1389 1394 30 医药交流课件 FromhumanEScellstoinsulin secretingcells SchuldinerM etal PNAS2000 97 21 11307 11312AssadyS etal Diabetes2001 50 8 1691 1697SegevH etal StemCells2004 22 3 265 274 5day 10day Furtherinduction 31 医药交流课件 AssadyS etal Diabetes2001 50 8 1691 1697 32 医药交流课件 Insulin GK Glut 2 Glut 1 Oct 4 Ngn 3 PDX 1 b actin Differentiation days 0 7 15 22 28 10 30 uhES EB dhES NHF NC AssadyS etal Diabetes2001 50 8 1691 1697 NHF normalhumanfibroblasts 33 医药交流课件 DifferentiationofHumanEmbryonicStemCellsintoInsulin ProducingClusters HANNASEGEV BETTINAFISHMAN ANNAZISKIND MARGARITASHULMAN JOSEPHITSKOVITZ ELDOR STEMCELLS2004 22 3 265 274www StemC 34 医药交流课件 Insulinstaining TUNEL nuclei DAPIstainfornuclei Merge A C Insulinstaining FITC Insulinuptake InsulinstainingofEScellprogenyfrominsulinuptakeRajagopalJ etal Science2003 299 5605 363 35 医药交流课件 Insulin C peptide DNA Insulin Caspase 3 Insulin DNA TUNEL Insulin DNA Insulin FITC Ins DNA ArtifactualinsulinreleasefromdifferentiatedembryonicstemcellsHanssonM etal Diabetes2004 53 10 2603 2609 36 医药交流课件 HanssonM etal Diabetes2004 53 10 2603 2609 37 医药交流课件 KeyMessagesfromthesetwoStudies EScellsdifferentiatedinmediawithoutexogenousinsulindidnotstainforinsulin anddifferentiatedEScellssubsequentlyculturedininsulin deficientmedialostinsulinstainingAlthoughdifferentiatedcellscontainedimmunoreactiveinsulin theydidnotcontainC peptideVariableinsulinreleasefromthesecellsuponglucosechallengecouldbefound butC peptidereleasewasnotdetectedManyoftheinsulin immunoreactivecellswereundergoingapoptosisornecrosisThesecellstookupfluoresceinisothiocyanate FITC labeledinsulinfromtheculturemediumSuggestingthatcontaininginsulininthesecellsisnotasaresultofbiosynthesisbutfromtheuptakeofexogenousinsulin RajagopalJ etal Science2003 299 5605 363HanssonM etal Diabetes2004 53 10 2603 2609 38 医药交流课件 Conclusion Insulindetectingalonecanoverestimategenuinebcelldifferentiationwhenexogenousinsulinispresent Therefore severalmethodsshouldbecombinedforreliableanalysisofinsulinexpressionincluding C peptidestainingandreleasingElectronmicroscopyNorthernblotInsituhybridizationMetaboliclabeling Demonstrationofbi phasicinsulins