基因转化方法与转基因植株鉴定全.ppt

基因转化方法与转基因植株鉴定 LOREMIPSUMDOLOR 遗传转化的主要方法农杆菌介导的遗传转化基因枪法电击法注射法化学药剂诱导转化花粉管通道法 一 农杆菌介导的基因导入 植物细胞 TransferringgenesintoplantcellsbycointegrationusingT DNA Tiplasmids andagrobacterium 基因导入方法 转化步骤可简单概括为以下方面 1 获取目的基因 用限制酶切割下目的基因 2 基因表达载体的构建 将目的基因与载体 大多数选用质粒 用DNA连接酶连接起来 3 将目的基因导入受体细胞 将含目的基因的重组质粒导入农杆菌 农杆菌为受体细胞 4 目的基因的检测与鉴定 用DNA分子杂交技术 分子杂交技术 抗原 抗体杂交 个体生物学水平鉴定 这个方法需要导入重组后的细胞的植物体 详见第五步 几种方法进行检验 根据要求选取不同方法 5 最后将成功表达的细胞导入植物体内 对植物体进行个体生物学水平鉴定 技术特点 转化拷贝数低携带目的基因片段大整合后外源基因结构变异小操作简便等优点该技术已成为转化成功最多的一种转化方法 基因枪法 particlegun 又称微弹轰击法 microprojectilebombardment或particlebombardment 该法借助高速运动的金属粒子将附着于其表面的核酸分子引入受体细胞 外源基因进入受体细胞核后整合到染色体组 然后通过组织培养再生出完整个体 植株 程序与方法 轰击微弹的制备 基因枪轰击参数 受体材料 轰击样品 优点 受体材料来源广泛靶受体类型广泛缩短了转基因周期 转基因植株变异率低及通常具有正常的育性缺点 转化效率不高多拷贝插入费用较高 基因枪 particlegun 又称微弹轰击法 microprojectilebombardment particlebombardment biolistic 最早是由Cornell大学研制的火药基因枪 1990年 美国杜邦公司推出了商品基因枪PDS 1000系统 基因枪的组成部分有 点火装置 发射装置 挡板 样品室 真空系统组成 基因枪转化的基本步骤如下 DNA微弹的制备DNA 微弹载体的制备靶外植体准备DNA微弹轰击轰击后外植体的培养 基因导入方法 三 电击法 Genetransferbyelectroporation 优点 不受宿主限制操作简便对植物细胞不产生毒性转化效率较高 特别适于瞬间表达缺点 易造成原生质体的损伤存在原生质体再生困难 注射法开始用于动物卵细胞 后来被用于植物 用显微注射仪把外源DNA溶液注入到子房或胚囊中 由于子房或胚囊中产生高的压力及卵细胞的吸收 使外源DNA进入受精的卵细胞中 从而获得转基因植株 对于子房大 多胚珠的作物 可以说是一种简便可行的转化途径 化学药剂诱导转化常用的化学诱导剂 聚乙二醇 PEG 多聚鸟氨酸 PLO 聚乙烯醇 PVA PEG是一种细胞融合剂 PEG法是最常用的化学基因转化方法 它是将Ti质粒与原生质体共同培养在含有PEG和Ca2 的溶液中 在高pH值条件下 原生质体摄取外源DNA分子 然后经再生获得转基因植株 优点 不受宿主范围的限制操作简便成本底缺点 一般只适用于原生质体的转化 而原生质体再生植株并不容易 转化效率低 再生植株常不可育或形态异常 多拷贝插入等现象 四 花粉管通道法 花粉管通道法是利用植物授粉后所形成的天然的花粉管通道 又叫花粉管引导组织 经珠心通道 将外源DNA携带入胚囊 转化受精卵或其前后的生殖细胞 精子 卵子 由于它们仍处于未形成细胞壁的类似 原生质体 状态 并且正在进行活跃的DNA复制 分离和重组 所以很容易将外源DNA片段整合到受体基因组中 以达到遗传转化之目的 花粉管通道法步骤 去除花冠 用微量注射器从断面沿花柱中轴插入子房长度的约 处 再退回 毫米左右 注入含外源目的基因的缓冲液 正常管理 收获种子 经筛选获得转基因植株 技术特点 直接 简便易行 不需要组织培养的继代 从而排除了植株再生的障碍 但转化效率较低 适合于花器官较大的植物 该方法可用于任何开花植物 将供体总DNA的片断 在受体自花授粉后一定时期涂抹于柱头上 使能沿着花粉管通道进入胚囊 转化受精卵或其前后的细胞 实际应用时一般切除柱头进行涂抹 这样可减少DNA进入胚囊的距离 提高转化率 但会影响结实率 转基因植物的鉴定 转基因植物的鉴定 遗传鉴定表达鉴定表型分析鉴定 利用报告基因Northern杂交Western杂交 直接鉴定DNA分子是否整合到基因组上 1 扩增目的片段 2 杂交信号鉴定 Southern杂交 检测拷贝数 一 Southernblot检测 Southernblot制作探针 根据试剂盒的要求确定DNA用量 一般不超过100ng 反应结束后对探针最好用层析柱进行纯化 不同的植物用于Southern杂交的DNA量不同 一般每泳道的拟南芥DNA的用量为10 25ug 一般用高于酶切需要量DNA的10倍酶量 DNA的浓度不要过高 注意不同的酶要求的反应温度不一样 酶切后取少量样品检测酶切是否完全 如果不完全 可加酶后继续酶切 DNA酶切 根据酶切后的目的片断大小 一般采用0 7或0 8 的agarose 但当酶切后目的片断较小时 要适当提高胶的浓度 记住电泳时两边的泳道要加标准分子标记 电泳是电压不要过高 一般为1v cm 最好电泳完毕后进行染色 电泳完毕要用比例尺对胶进行照相 DNA凝胶电泳 一般用尼龙莫一般实验室多采用毛细管法转膜缓冲液一般为10X的SSC或SSPE 转膜时间一般为48hr 用UV确认转膜是否完全 固定 UV0 4MNaOH 80oC烘烤1 5 2小时 转膜 二 Northernblot 从植物中提取RNA方法1 热酚法试剂 提取缓冲液 100mMLiCl1 SDS100mMTris HCl p8 0 10mMEDTATE缓冲液饱和酚氯仿4MLiCl乙醇75 乙醇300mM醋酸钠 pH5 2 电泳槽用5 过氧化氢处理2个小时以上 DEPC处理水清洗2次 灭菌 RNA专用瓶中加入80mlDEPC处理水及1 2克琼脂糖 微波炉加热溶解 60oC水浴上放置15分钟 加入5ml20 xMOPS及15ml甲醛溶液 灌胶 与通风橱中进行 变性凝胶制备 RNA加样缓冲液 35ul37 甲醛100ul甲酰胺5ul20XMOPS20ul10 xDye合计160ul 4ulRNA样品 4ulDEPC或甲酰胺中溶解10 20ugRNA 加入16ulRNA加样缓冲液 混合 65oC加热10分钟 冰中放置5分钟 电泳用RNA样品的准备 把制作的凝胶置于电泳槽中 加1XMOPS缓冲液 用20XMOPS继DEPC处理水配置 5V cm 预电泳5 10分钟 于凝胶孔中加入热变性后的RNA样品 3 4V cm 电泳1 2两个小时 电泳结束后 用比例尺照相 RNA电泳 转膜 10XS