生物传感器的三代历程.docx

生物传感器的三代历程根据酶与电极间的机理可将生物传感器分为三代:1 第一代生物传感器用酶的天然电子传递体氧来沟通与电极之间的电子通道，直接检测酶反应底物的减少或产物的生成的传感器，称为第一代生物传感器。第一代安培型酶生物传感器的响应，检测机理叙述如下:A. 氧化还原酶类:以葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase GOD）为例，用氧化还原酶的天然电子受体氧来作为酶的氧化还原活性中心的电子受体，其响应机理如下: 酶膜： GOD (FAD) + glucose + H2O2 GOD (FADH2) + gluconic acidGOD (FADH2) + O2 GOD (FAD) + H2O2 电极： 过氧化氢电极 H2O2 2H+ + O2 + 2e- 或氧电极 O2 + 4H+ + 4e- 2H2OB. 非氧化还原酶类:以乙酰胆碱脂酶(acetylcholinesterase,ACH)为例:酶膜: Acetylcholine + ACH Acetic acid + choline电极：pH电位传感器此类生物传感器通过检测反应物的消耗(O2的减少)或产物的增加(H2O2或H+)来反映被测物的浓度变化。检测O2的消耗一般采用Clark型氧电极，但是这种检测易受环境中氧分压波动的影响，响应时间较长且难以进行活体分析，其灵敏度也不太高。为提高灵敏度可以采取化学循环放大的方法33。自70年代化学修饰电极发展起来后，化学修饰电极代替传统氧电极检测氧取得了很好的效果，金属卟啉类催化氧还原效率高、响应快，在生物传感器方面的应用也取得了成功34。无论 采 用 什么方式检测，O2消耗量总是受氧分压的影响，因此人们把注意力转向检测H2O2的生成。H2O2在金属电极和碳电极上氧化的过电位均较高，一般在+0.6 V+0.8 V vs. Ag/AgCl。这样高的检测电位使抗坏血酸、尿酸、乙酰氨基酚等电活性物质干扰严重。解决这一问题是采用各种选择性渗透膜去掉干扰物质；另一方法就是采用化学修饰电极降低过电位，如普鲁士蓝修饰电极等35，但其灵敏度始终受到体系中溶解氧浓度的限制。1.2 第二代生物传感器为克服第一代生物传感器受氧分压影响和H2O2过电位高、干扰多、受氧溶解度限制等，自70年代起人们开始用小分子的电子传递媒介体来代替氧沟通酶的活性中心与电极之间的电子通道，通过检测媒介体的电流变化来反映底物浓度的变化，构造了第二代生物传感器。第二代安培型酶生物传感器的响应及检测机理分述如下:A. 氧化还原酶以GOD为例:酶膜: GOD (FAD) + glucose + H2O2 GOD (FADH2) + gluconic acid GOD (FADH2) + Medox GOD (FAD) + Medred电极: Medred Medox + nH+ + ne-B. 过氧化物酶（Peroxidase）以辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase HRP)为例:酶膜: H2O2+ HRP Compound + H2OCompound + Medred Compound + MedoxCompound + Medred HRP + Medox电极: Medox + H+ + e- MedredC. 脱 氢 酶(Dehydrogenase,DH) .酶膜: SH2 + NAD+ + DH S + NADH + H NADH + Medox Complex Medred + NAD+电极: Medred Medox + nH+ + ne-优良的电子媒介体应具备如下性质:. 可与酶的氧化还原型辅基快速反应;. 能吸附或滞留在电极表面;. 呈现可逆的电极反应动力学;. 具有较低的氧化还原电位，并与pH无关;. 氧化还原形式能稳定存在;. 对氧惰性或非反应活性;. 无毒或毒性很低。自八十年代中期以来，介体型酶电极的发展在改善酶电极性能方面取得长足的进步，Turner课题组率先发表了这方面的研究成果36，由于采用二茂铁作为电子传递媒介体在电极表面和酶催化反应层间起传递电荷的作用，替代了氧的作用，而且二茂铁的氧化(产生信号的反应)可以在很低的电位下(通常+0.15 V至+0.25 V)发生，而不一定需要催化的或贵金属电极。在如此低的电位下，其它可氧化化合物的干扰是很小的，因此电流测定灵敏度更高，响应更稳定。二茂铁基的葡萄糖传感器如图1-3所示。此后，介体型酶电极逐渐成为生物传感器家族中的主角，研究工作主要集中在电子传递媒介体的选择和其在电极表面的修饰方法的研究方面。已见报道的电子媒介体数量较多，最常见的有铁氰化物、二茂铁及其衍生物、吩嗪类及吩噁嗪、吩噻嗪类化合物(如甲基蓝、亚甲蓝、硫堇、麦尔多拉蓝、劳氏紫、吩嗪甲酯、甲苯胺蓝、紫精化合物等)37和聚对苯二胺等。此外，Ru、Os的化合物38、有机导电盐(39)、金属卟啉、酞箐401等也常作为媒介体使用。媒介体存在的方式有两种:一种是溶解在试样的溶液中，另一种是固定在生物敏感膜内。由于前者必须向试样中不断加入媒介体，这类传感器不利于商品化、实用化。而后者，在测量时无需加入其它试剂(被称reagentless41，为活体检测提供了方便，因此已成为传感器研制的一种趋势。在构造reagentless型安培酶传感器时，需要固定媒介体。固定媒介体的方法，己报道的有以下几种:(1) 靠静电相互作用固定媒介体。用具有离子交换功能的无机、高分子材料，富集媒介体，作为媒介体库。使用的无机材料有分子筛、蒙脱土、粘土等42。使用的高分子材料主要是Nafion和Easterman AQ等43。负载的媒介体有紫精类和阳离子染料类化合物44。这种方法的优点是固定化方法简单，不需要复杂的化学合成，可以方便地调节媒介体的载量.缺点是在使用过程中媒介体不可避免地泄露。(2) 共价键合媒介体。共价键合又可分几种方式。一种是媒介体化学修饰酶，也就是把媒介体化学合成到酶分子上45。另一种方法是把媒介体化学合成到高分子链上46。比如含钌、锇的吡啶类配合物的聚乙烯基吡啶，含钌、锇的咪唑类配合物的聚乙烯咪唑，含二茂铁的聚丙烯酰胺，含二茂铁的聚吡咯，聚乙烯二茂铁，聚烯丙胺二茂铁，烷基吡咯取代的紫精。再一种方法是在自组装膜上键合上一层媒介体，然后再共价键合酶分子47。这类方法的优点是媒介体固定牢固，缺点是化学合成比较麻烦。(3) 物理包埋法。碳糊电极可以同时固定媒介体和酶分子，因而电极的制备简单，可以包埋多种媒介体，而缺点是碳糊包埋的媒介体不稳定，使用时会不可避免地发生泄露。当前发展起来的溶胶凝胶法也可以方便地固定媒介体和酶分子，并且由于其物理包埋和孔径阻碍作用，四硫富瓦烯(Tetrathiafulvalene TTF)等媒介体可以被牢牢的固定住48。1.3 第三代生物传感器尽管媒介体型第二代生物传感器有许多优点，人们仍在追求酶与电极间的直接电子转移，因为基于这种原理制备的传感器与氧或其它电子受体无关，无需引入外加媒介体.因此固定化相对简单，无外加毒性物质，是最理想的生物传感器。利用酶自身与电极间的直接电子转移来完成信号的转换的生物传感器被称为第三代生物传感器。迄今为止 ，报道较多的主要是过氧化物酶传感器，以HRP为例，其响应机理: 酶层: HRPred + H2O2 HRPox+ H2O电极: HRPox + e- HRPred蛋白质电化学表明，电子交换速率依赖于蛋白质的性质、电极材料和电极/电解质界面的状态49，只有一些分子量相对低的电子载体细胞色素C、细胞素C5,铁氧化还原蛋白、黄素氧化还原蛋白和一些其它蛋白质，可以在金属酶电极上观测到电子的直接传递50。高分子量酶的活性中心深埋在多肽结构内部，因而很难发生直接电子传递。有机金属具有许多其它导电材料目前为止具有的特性，这种酶电极具有一个基本特征。首先，能够在现场产生媒介体，有机金属成分的变化可以改变媒介体的性质和它的溶解性，而且有机金属的耐腐蚀性也很重要。第二，有机金属的表面张力远低于金属电极。因而酶吸附在有机金属上时变性会很少。而且有机金属成分变化可以改变它的静电位，这样就可以吸附大量活性的酶。第三，有机金属的结构与半导体聚合物一样可以在高导电基质上引入生物催化剂51，在导电有机盐(具有电子导电性的电荷传递有机复合物)构成的电极上由GOD引起的葡萄糖氧化反应与氧浓度无关。这种电极作用的机理还不清楚，不清楚还原态的酶的氧化是在电极表面52进行还是通过低浓度的电极溶解产物的媒介体53而进行。对氧化酶来说如GOD，真正依靠GOD与电极之间直接的电子转移来实现检测葡萄糖浓度的还不多。Koopal的一系列工作还可以看作上直接电化学54，他们采用独特的方式将GOD固定在聚吡咯中。但最近有人认为该传感器的响应是葡萄糖在金属铂膜上直接氧化的结果。著名的Heller把二茂铁修饰到GOD上以获得直接电化学（不能算是真正的直接电化学），只是一种比较有效的第二代媒介体型的传感器。但是许多含血红素的酶的直接电化学却屡有报导.许多基于过氧化物酶直接电化学的检测过氧化氢和有机过氧化物的第三代生物传感器被制备出来55。辣根过氧化物酶、细胞色素C过氧化物酶、霉菌过氧化物酶、乳过氧化物酶及微过氧化物酶，血红素九肽均可与合适的电极表面进行直接电子转移，用作过氧化氢传感器和与过氧化氢有关的双酶传感器56。同时含有血红素和黄素或吡咯并喹啉(Pyrroloquinoline quinone PQQ)辅基的一些酶也能实现直接电子转移57，如PQQ蔗糖脱氢酶，D-葡萄搪酸酯脱氢酶等都能在无媒介体条件下直接检测蔗糖和D-葡萄糖酸。第三代传感器工作电势较低(通常+0.2+0.4 V ).具有媒介体传感器的所有优点，而且它们是典型的固体状态的传感器。在制备过程中没有可溶或部分溶解的化合物。基于这种原理制成的传感器已成功的用于检测鼠大脑中的葡萄糖浓度58-59。最常见的第三代传感器是使用PPy60.61，四氰基喹啉并二甲烷(2,5-Cyclohexadiene-1,4-diylidene)-dimalononitrile TCNQ)和PA聚合物62-65等，通过恒电位或循环伏安法制备。利用有机导电盐固定酶有两种方式，用其作为新的电极材料，或者将酶固定在有机聚合物中。酶包埋在电合成的聚合物中而制备的电流式酶电极是典型的第三代传感器制备方法。这种方法通常涉及一种较适宜的单体在含有酶的支持电解质中的电化学氧化，从而在电极表面形成一层聚合物膜。这样可以更好的利用有机导电盐的性能。这种方法的优点是:一步就能完成所有化学物质的制备，可以控制酶的空间分布和酶层厚度，有可能制备多层和/或多酶结构。但是，电化学固定酶具有一些缺点:导电聚合物基酶膜对于阴离子内源(Endogenous)电活性物质缺少选择性透过性(如抗坏血酸、尿酸)，这些电活性物质能直接在聚合物表面直接氧化，因而抗干扰性较差。在体内的进一步应用受到所涉及的电极材料的生物相容性的限制。一些底物和酶事实上与一定的聚合基质或电聚合过程中的电极表面产生的化学环境不相容66。并且似乎只有酶在电极表面表现出有效的非变性吸附时，电化学固定才是成功的67。甚至在形成较厚的导电聚合物时，将酶包埋至生长的膜中也要求聚合物和酶间具有静电亲和力。例如，正电荷蛋白质不能有效地包埋聚吡咯膜中68。而且包埋酶聚合物的老化(即扩散分离性能的改变)和固定酶量较少(典型是一个单层)，会显著地减少这些生物传感器的长期稳定性。克服上述问题的一个方法是“杂化”生物传感器设计。导电聚合物常常与导电媒介体结合使用。较为成功的是在聚阴离子搀杂聚吡咯修饰的电极上生长垂直于表面的四硫富瓦烯四氰基喹啉并二甲烷(TTF-TCNQ)树状晶体结构，并通过戊二醛将GOD交联于其中691。 GOD与电极的牢固结合使传感器性能非常稳定。工作电压较低(0.25V vs. Ag/AgCI) 使用寿命较长，连续使用100天仍保留最初电流的40%，受氧及其体液中的电活性物质干扰较小。将电合成非导电聚合物的选择透过性优点，与经典酶固定方法相结合也得到了较好的结果。Toshio Y.等70在聚1,2一二氨基苯膜修饰的电极上通过溶胶一凝胶法固定GOD。这样可以利用聚1,2一二氨基苯的选择透过性，以及溶胶凝胶法的高酶负载。Guerrieri A.等71通过戊二醛将葡萄糖氧化酶与牛血清蛋白交联至过氧化聚吡咯修饰的电极上。交联过程保持了固定化酶的高负载和长期稳定性，同时保留了底层过氧化聚毗咯的选择透过性。这样制备的葡萄糖传感器具有高灵敏度、较宽的线性范围(达12毫摩尔)，完全避免了干扰，响应时间仅为儿秒钟。连续工作24小时，响应无明显变化，储存寿命超过3个月。但是，在这些情况下，电聚合物只起选择透过性膜的作用。而未作为酶电子传递发生的部位。利用聚吡咯制备的生物传感器，工作电位仍很高(0.650.7V)。这样很难说聚吡咯所起的作用是直接电子传递。因而导电有机材料制备第三代传感器很困难。需要寻求其它新型的材料和方法制备直接传递电子的传感器。近年来一些文献中报导了在金溶胶、石英玻璃、石墨、多孔二氧化硅72-73以及粘土74等无机材料中固定酶，它为生物传感器的发展翻开了新的一页。金溶胶纳米颗粒由于吸附生物大分子后仍能保留其生物活性，因而最初广泛用于电子显微镜中标记生物分子75.77. A .L.