基于sf9昆虫细胞的蓝光诱导表达系统的构建毕业论文.doc

华中农业大学2011届本科毕业论文本科毕业论文(设计)题 目基于sf9昆虫细胞的蓝光诱导表达系统的构建Construction of Blu-ray Induced Expression System in sf9 insect Cells姓 名蔡泽蕲学 号2011304200107学 院生命科学技术学院专业班级生科1101指导教师徐富强职 称研究员中国武汉二一五 年 六 月华中农业大学学士学位论文基于sf9昆虫细胞的蓝光诱导表达系统的构建Construction of Blu-ray InducedExpression System in sf9 insect Cells学生姓名:蔡泽蕲学生学号:2011304200107学生专业:生物学基地班指导教师:徐富强 教 授指导小组:吴 阳 博后华中农业大学生命科学技术学院二一五年六月目录摘 要IAbstractIII缩略词表IV1 前言11.1 诱导型启动子11.1.1天然诱导型启动子11.1.2人工诱导型启动子11.1.3 光诱导启动子21.2 VP-EL222转录激活系统31.3 VP-EL222系统在293T细胞中的表现41.4 pMIB/V5-His载体51.5实验背景和目的52.材料与方法62.1 实验材料62.1.1 材料与试剂62.1.2部分主要试剂的配制62.2实验方法72.2.1 sf9细胞的传代培养72.2.2 分子克隆基本策略72.2.3 通用PCR体系及程序82.2.3 酶切体系和方法及胶回收试剂盒的使用82.2.4连接体系及方法92.2.5 转化用 E.coli DH5 感受态的制备92.2.6 转化的步骤92.2.7 质粒抽提试剂盒的使用102.2.8质粒DNA的非柱回收简单纯化步骤102.3载体构建流程102.4转染113结果与分析123.1载体鉴定图123.2转染结果123.3结果分析13参考文献15致谢17摘 要光诱导表达系统作为人工诱导表达系统中最璀璨的一员，正受到越来越重要的关注。光作为诱导因子控制基因表达比其它化学因子具有无可比拟的优势，如对时间和空间上的精确把握。尽管如此，当前主要的光控表达系统仍有很多弱点限制着它的应用，比如：蛋白本身的毒性、狭窄的调控范围以及反应缓慢的激活和去激活作用，相比传统的化学诱导表达系统没有压倒性优势。在我们这里将展示一个新的光控表达系统，它没有前述三大缺点，且已被证明广泛的适用性。通过这个系统，我们在多种哺乳动物细胞中测试了光控转录作用。这一方法对在时空上精确控制基因表达是一个强大的工具。本文将讲述这个新的光控表达系统在sf9昆虫细胞蛋白表达中的应用。Sf9昆虫细胞即草地贪夜蛾细胞。Sf9细胞是由G.E. Smith 和 C.L. Cherry 在1983年从细胞株IPLB-SF 21 AE得来的一个克隆。IPLB-SF 21 AE是1977年由Vaughn等从草地夜蛾蛹的卵巢组织得到的。sf9细胞属于半贴壁型细胞系，可以进行悬浮培养，也可以进行贴壁培养，在应用于蛋白的表达与制备纯化中，有着许多的优点。Sf9昆虫细胞是杆状病毒表达系统的平台。杆状病毒表达系统(baculovirus expression system)是近年来应用较多的真核表达系统，它可以在昆虫细胞中表达多种外源基因，包括真菌，植物，细菌，病毒的基因。杆状病毒是一类以昆虫细胞为天然宿主的双链DNA病毒，具有高度的种属特异性，不感染脊椎动物，对人畜无害。目前研究较多的是苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒 (AcMNPV)。而我们用来构建的这个光控表达系统所使用的载体pMIB/v5-his中的OpIE1和OpIE2正是一个杆状病毒的早期启动子，其中后者是比前者更强的启动子。该杆状病毒是黄杉毒蛾核多角体病毒（OpMNPV），它的天然宿主是道格拉斯冷杉毒蛾。尽管如此，这两个启动子仍然能够在sf9细胞、sf21、LD652Y等多种昆虫细胞中驱动基因表达。杆状病毒早期启动子可以在没有病毒因素的情况下利用细胞转录机制驱动基因表达。因此从某种程度上说，杆状病毒表达载体所具有的优点，我们使用的pMIB载体也同样具有。如：1）表达的重组蛋白能正确折叠，并形成二硫键； 2） 翻译后可进行修饰加工如糖基化、磷酸化、酰胺化及信号肽切割等，使重组蛋白在结构和功能上更接近天然蛋白； 3） 与其他I华中农业大学2015届本科毕业论文真核表达系统相比， 杆状病毒表达系统可以高效表达外源基因，表达量最高可达被感染 昆虫细胞总蛋白量的5 0 ；4）可以容纳大片段外源基因。该系统当前已有实验证明在293细胞中发挥作用，且效果良好，我们计划把它引入到sf9昆虫细胞中。我们的主要工作是构建承载该系统的质粒，然后转染sf9昆虫细胞，获得报告基因的表达情况。在引入这个系统之前我们需要对其进行定性测试，采取的方法是用红色荧光蛋白基因mCherry作为报告基因，通过mCherry的表达情况大致了解这个光控系统的运作行为。而本文就主要讲述对这个系统的探索与测试所做的努力。这个系统作为人工控制基因表达系统家族中的最有潜力的系统之一，具有足够的优势，有望在生命科学各个领域发挥作用，这里对它的应用只是一个很小的方面，它本身的应用并不仅限于昆虫细胞，对很多脊椎动物细胞都适用。此次在昆虫细胞中对该系统的实践则是首次。关键词：杆状病毒表达载体、光控表达系统、昆虫细胞。AbstractAs the most bright one of the artificial induced expression system, optogenetic gene expression system is being more and more popular. Light as induced factor to control gene expression has the incomparable advantages over other chemical factor, such as the accurate control of time and space. In spite of this, the current main optogenetic gene expression system still has many weaknesses that limit its application, such as: the toxicity of the protein itself, narrow scope of regulation, and the slow activation and deactivation, so that it is not overwhelming compared with the traditional chemical inducing expression system . Here we will show a new optogenetic gene expression system, which does not has the big three shortcomings, and has shown a wide range of applicability. With this system, we have tested in a variety of mammalian cells to confirm whether it can drive transcription of the target gene. The method for precise control of gene expression in time and space is a powerful tool. This paper will talk about the application of this new optogenetic gene expression system in sf9 insect cell . Sf9 insect cells is Spodoptera frugiperda cell . Sf9 cells is made up of G.E. Smith and C.L. Cherry from cell lines IPLB in 1983 - SF, a clone of the 21st AE to come. IPLB - SF, 21st AE is 1977 by Vaughn from ovarian tissue of meadow moth pupa. Sf9 cells belong to half adherent cell lines, which can suspension culture, and also can undertake adherent culture.Its application in protein expression and the preparation and purification has many advantages over others. Sf9 insect cells is a platform baculovirus expression system . Baculovirus expression system is more and more widely applied in eukaryotic expression system in recent years, which can carry a variety of foreign genes need to express in insect cells, including fungi, plants, bacteria, virus genes. Baculovirus is double-stranded DNA virus,the natural reservoir of which is insect cell.Since has a high degree of species specificity, it not infected vertebrates, positively harmless to human and animal. The present study is more alfalfa crazing armyworm nuclear polygonal body virus (AcMNPV). OpIE1 and OpIE2, two promoters of the vector pMIB/v5 - His which we used to construct the optogenetic gene expression system are early promoter of a baculovirus, and former promoter is more stronger. The baculovirus is Orgyia pseudotsugata multicapsid nuckear polyhedrosis virus (OpMNPV),the natural host of which is the Douglas fir tussock moth.In spite of this, the two promoters will still function in the sf9 cells, sf21, LD652Y and other insects to the drive gene expression. Baculovirus early promoter can drive gene expression of cells in the absence of viral factors . So to some extent, the pMIB vector we used also has the advantages that baculovirus expression vector has. Such as: 1) Folding correctly of recombinant protein , and the formation of disulfide bond; 2) Able to be modified after translation processing ,including: glycosylation, phosphorylation, amidation and signal peptide cutting etc., to make the recombinant protein more close to natural protein on the structure and function; 3) Expressing the foreign protein efficiently, 50% of total Iamount of protein level in a cell; 4) Able to accommodate large fragment exogenous gene. Currently existing experiment proves that this system play a role in 293 cells, and the result is very good.So we plan to introduce it to the sf9 insect cells. Our main work is to build a carrying plasmid of the system, then to transfect sf9 cell, getting the data of the expression level of reporter gene . Before introducing this system we need to carry on the qualitative test, mCherry gene which is a red fluorescent protein gene is made to be the reporter gene, through the expression of which we can learn the effect of the optogenetic gene expression system in sf9 cell. This paper is mainly about the exploration of the system .As a manual control gene expression system,this system is one of the most promising system of the family.With the grate advantages , it is expected to play a role in basic life science field, and the application of it here is only a small aspect.The application is never limited to the insect cells, also functional in many vertebrates cell. This assay to apply the system in sf9 cells is the first time in the word.Keywords: Baculovirus Expression Vector, Optical expression system, insect cells .缩略词表AmpAmpicillin氨苄青霉素LBLuria-Bertani culture medium LB 培养基FBS Fetal bovine serum胎牛血清PCRpolymerase chain reaction聚合酶链式反应GFPGreen Fluorescent Protein 绿色荧光蛋白BEVBaculovirus Expression Vector杆状病毒表达载体SNPSingle Nucleotide Polymorphisms单核苷酸的多态性SMStreptomycin链霉素 I1 前言1.1 诱导型启动子1.1.1天然诱导型启动子天然诱导型启动子(inducible promoter)是指自然界天然存在的在某些特定的物理或化学信号的刺激下，该种类型的启动子可以大幅度地提高基因的转录水平。目前已经分离了光诱导表达基因启动子、热诱导表达基因启动子、创伤诱导表达基因启动子、真菌诱导表达基因启动子和共生细菌诱导表达基因启动子等。长期进化过程中，生物通过启动不同基因的表达可在一定范围内适应光、温、水等环境的变化。这些基因的启动子通常包含比较保守的顺式作用元件，利用这些保守元件可以推测新基因的可能功能，也可用这些环境应答基因的启动子与抗逆基因融合，从而使转基因生物更好地适应逆境。由于生物生长环境及基因表达的复杂性，从外界环境的刺激到启动应答基因的表达之间的信号通路往往是相互交 叉的，这样启动子中包含的顺式作用元件通常也不止一种。1.1.2人工诱导型启动子在开发植物天然存在的诱导型启动子的基础上。人工构建可诱导表达系统以满足不同需求。目前研究最多、最深 入的可诱导表达系统是化学诱导表达系统。自第一次用化学诱导表达系统TetR，通过CaMV35S启动子成功调节cat基因的表达以来已有20多年的 历史，现已发展成日臻完善的植物表达外源基因的可诱导表达系统。该系统包括两个转录单元：一是与化学诱导物结合的转录因子的表达，另 一个转录单元包含一个应答元件，经诱导物处理后，通过它激活转录因子，从而激活或抑制目的基因的表达。 一个理想的化学诱导表达系统应具备以下特点：首先，外源基因在植物体自身不表达或低水平表达，当添加诱导 物后，高效诱导基因表达；其次，诱导物需要有较强的专一性；第三，诱导物可快速启动基因表达的“开”与“关”；而且诱导物对植物无毒 或低毒。根据控制基因表达的方式，可将化学诱导系统分为两大类：阻遏型启动子系统和激活型启动子系统。 人工诱导启动子使人为控制基因表达成为可能。 Weber, W. & Fussenegger, M. Inducible product gene expression technology tailored to bioprocess engineering. Curr. Opin. Biotechnol. 18, 399410 (2007).， Weber, W. & Fussenegger, M. Emerging biomedical applications of synthetic biology. Nat. Rev. Genet. 13, 2135 (2012).1）阻遏型启动子系统 该系统建立在阻遏蛋白与转录因子在空间构型相互作用的基础之上。当诱导物不存在时，激活蛋白与阻遏蛋白结 合，基因正常转录；添加诱导物后，诱导物与激活蛋白结合或阻止其与阻遏蛋白结合，阻遏蛋白则与启动子上的某些顺式作用元件结合，抑制 基因转录，如以四环素抑制子为基础的四环素抑制系统(tTA)。Love等用包含四环素抑制子的启动子Topl0与报告基因GFP相连转化拟南芥，发现 用100 ng/mL的四环素即可抑制GFP的表达，而且改变培养基中四环素的浓度，可调节GFP的表达水平。2）激活型启动子系统 在抑制型启动子系统中，抑制基因转录所需诱导物的量往往超出植物适应的范围，而且在真核生物中激活基因比 抑制基因转录更容易，近年发展了一些激活型启动子系统，如地塞米松诱导的GR系统、雌二醇诱导的ER系统、杀虫剂诱导的EcR系统等。激活型 启动子系统的优点是只有当诱导物存在时才能启动基因表达，去除诱导物后，基因表达很快被关闭，这样就可以人为地精确、快速控制基因的表达。1.1.3 光诱导启动子人工诱导型还有一颗新星，光诱导表达启动子，简称光控启动子。光控表达系统可以在空间和时间上精确控制转录，这和很多传统的诱导表达启动子不一样 Briggs, W.R. & Spudich, J.L. Handbook of Photosensory Receptors (Wiley-VCH, 2005).。光控启动子，由于其在时间和空间上对基因表达高精度的控制性而很受很多领域研究的欢迎。光作为光控启动子的诱导因子，具有其它各种诱导型启动子诱导条件无与伦比的优势。首先是敏捷度高，从接受刺激到产生效果只需要很短的时间，而当诱导物是其它物质时，从接受刺激到产生效果很大程度上受限于化学分子的扩散速率，而扩散速率由于很多其它因素有关，诸如温度、分子大小等，这些因素的存在使得实验条件不易精确控制。再者光在某种程度上是完全无毒的 Liu, H., Gomez, G., Lin, S., Lin, S. & Lin, C. Optogenetic control of transcription in zebrafish. PLoS ONE 7, e50738 (2012).、对细胞中其它的生化反应无任何影响的条件，这是非光诱导因子所不能做到的，光的激活和去激活作用完成一个循环后在细胞中可以做到零残留，这使得实验条件控制更加理想化，少了一个不可控的变量 Wang, X., Chen, X. & Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nat. Methods 9, 266269 (2012).， Polstein, L.R. & Gersbach, C.A. Light-inducible spatiotemporal control of gene activation by customizable zinc finger transcription factors. J. Am. Chem. Soc. 134, 1648016483 (2012).。另外，对于精确度的掌握，光的剂量控制显然比化学物质的剂量控制更方便也更科学。对于精度要求高的生物实验很是适合的。当前已被开发出来的光控启动子大多有一个共同的缺点：对目标基因表达量的调控范围较窄。如能在此方面有重大突破，将带来光遗传学的一场革命。本文将讲述的一个光控表达系统一定程度上相对其它光控系统具有一定的优势。光诱导启动子一般都会依赖于一个光敏转录因子，而这类光敏转录因子大多是通过人工改造光敏蛋白得到。 Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J.M. & Quail, P.H. A light-switchable gene promoter system. Nat. Biotechnol. 20, 10411044 (2002).， Levskaya, A. et al. Synthetic biology: engineering Escherichia coli to see light. Nature 438, 441442 (2005)， Yazawa, M., Sadaghiani, A.M., Hsueh, B. & Dolmetsch, R.E. Induction of protein-protein interactions in live cells using light. Nat. Biotechnol. 27, 941945 (2009).1.2 VP-EL222转录激活系统EL222转录因子，最初源于一个细菌的光-氧-压蛋白 Nash, A.I. et al. Structural basis of photosensitivity in a bacterial light-oxygen-voltage/helix-turn-helix (LOV-HTH) DNA-binding protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108, 94499454 (2011).，被蓝光照射时就会二聚化结合到DNA上。这个系统对控制表达的目标蛋白有足够大的的可调表达范围，敏捷的激活和去激活作用，以及对光强足够高的线性相关性。通过这个系统，已在多种哺乳动物细胞中测试了光控转录作用。这一方法对在时空上精确控制基因表达是一个强大的工具。这个系统的光依赖转录激活作用只需少量元件，一个光敏结构域LOV 1Huala, E. et al. Arabidopsis NPH1a protein kinase with a putative redox-sensing domain. Science 278, 21202123 (1997).，一个螺旋-转角-螺旋（H-T-H）DNA结合结构域。黑暗时LOV结构域结合者HTH结构域，覆盖了对于成为二聚体而结合到DNA所必需的HTH4位点。蓝光照射会触发光化学反应：LOV结构域中的黄素蛋白复合物打断了LOV和HTH的相互作用，使EL222二聚化，从而发挥DNA结合蛋白活性 Rivera-Cancel, G., Motta-Mena, L.B. & Gardner, K.H. Identification of natural and artificial DNA substrates for light-activated LOV-HTH transcription factor EL222. Biochemistry 51, 1002410034 (2012).， Zoltowski, B.D., Motta-Mena, L.B. & Gardner, K.H. Blue lightinduced dimerization of a bacterial LOV-HTH DNA-binding protein. Biochemistry 52, 66536661 (2013).。这些反应在黑暗中又会反过来进行，其逆反应在停止蓝光照射后将很快发生，这是快速去激活作用的基础。在EL222原始宿主中，发现这个基因的光依赖激活作用与基因组上的EL222结合位点毗邻，暗示这个蛋白质是一个光敏转录因子。对EL222机制的理解使我们能够在单一蛋白质复合系统中使用光依赖基因激活作用。在这里我们将报告一个经过基因工程改造的EL222。在接收适当蓝光照射条件下，能在不同真核表达系统中激活转录。通过这个方法，在293T细胞中应用这个系统已被证明了富集倍数超过200的过表达。与之对照，在最小泄露的非诱导条件下，黑暗条件和红光照射富集倍数只能有小于2的改变。这个系统有快速的激活（10s）和去激活能力（50s），这与另一种同样以LOV为基础的光控系统形成鲜明对比，该系统的去激活能力小于2小时。而且，这个系统可以实现对细胞进程的功能性调节，因为已经证明光控调节293T细胞的剪切作用。最后，在斑马鱼中已证明不论是全身还是组织特异性的基因都适用利用EL222来实现最低毒性的光控表达，扩大了这个表达系统的应用范围。总之，已掌握的资料和数据突出了EL222系统宽广的通用性以及它作为光遗传学工具的优势。1.3 VP-EL222系统在293T细胞中的表现此系统由Laura B Motta-Mena等最先从293T细胞中发展而来 Laura B Motta-Mena,Anna Reade,Michael J Mallory,Spencer Glantz.An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nature chemical biology,10,196-202(2014)，在推广该系统前，已经做了大量的验证实验。对于图1，左侧是转染后的实时数据，右侧是获得稳定细胞系后的数据。对比光照和黑暗，VP-EL222系统的转入与否，从图中可以很清晰地看到VP-EL222系统在293T细胞中工作效率很高。该实验中使用的报告基因是萤火虫荧光素酶基因，通过该酶的活性测定获得该基因的表达活性14。图1.VP-EL222系统在293T细胞中的表现。（a）四组细胞均被转染pC120-Fluc，第一组细胞转染空的不含VP-EL222的质粒，第二组转染含VP-EL222的质粒（pVP-EL222），第三组细胞为293T野生型，第四组细胞为转染pVP-EL222后获得稳定表达VP-EL222细胞系，四个组各自分光照和黑暗两小组。（b）转染pC120-mCherry后的293T野生型细胞和稳定表达VP-EL222蛋白的细胞在光照黑暗两种条件处理后的荧光显微镜下的图像。1.4 pMIB/V5-His载体pMIB/V5-His载体分A、B、C三型，这次实验中使用的是A型，从Invitrogen公司购买。该载体主要用于帅选被转染的细胞，以及用于在鳞翅类昆虫细胞系中稳定表达外源蛋白。原始载体全长约3.6kb，ori来自pUC质粒，还有用于在大肠杆菌中筛选的氨苄青霉素（AMP）抗性基因和在昆虫细胞中筛选的杀稻瘟菌素（Blasticidin）抗性。初始载体图谱（图2.）。该载体通常只用于在昆虫细胞中表达外源蛋白，在其上的多克隆位点中可以很容易插入一段外源序列，而此次我们需要其表达三个外源蛋白：mCherry红色荧光蛋白、EL222转录因子、GFP绿色荧光蛋白，所以，我们采取让后两者串联表达的方案（使用2A自剪切多肽）。也切掉了OpIE2启动子，详细构建步骤后面会说明。图2.pMIB/V5-His载体图谱。1.5实验背景和目的当前应用较广的杆状病毒表达系统已经使用较为成熟，它的优点已有目共瞩。但用作某些特定需求的基础研究则会显得力不从心，如当需要对目标蛋白进行实时控制时。前者在某种程度上更加类似于化学诱导系统，至于化学诱导启动子和光诱导系统的优劣比较，前面已有详述，此处不再赘述。在sf9昆虫细胞中建立一个光诱导表达系统，并获得稳定表达细胞系，将使对目标蛋白表达的调控更加灵活。特别是当我们的目的蛋白是作为功能蛋白时，此时对该蛋白的实时表达控制，即是对一个代谢通路的调节与控制。本实验中在sf9细胞中建立的光控表达系统，已有报道在293T细胞中实验成功，也可以说，这个系统是最初从293T细胞中建立起来的14，我们所做的工作是把该系统移植到sf9细胞中来。首先我们需要测试该系统是否能移植到sf9细胞中，以及其在sf9细胞中的稳定性，我们采用mCherry红色荧光蛋白基因作为报告基因。通过分析，定性得到该光控系统的调节能力。因此这篇文章作为先导文章，通篇并不涉及该光控表达系统的实际应用，只是为后面能深入应用该系统做铺垫。2.材料与方法2.1 实验材料2.1.1 材料与试剂pMIB/v5-his载体Invitrogen公司Gel Extraction kit胶回收试剂盒OMEGA bio-tek公司Plasmid mini kit质粒回收试剂盒OMEGA bio-tek公司E.coli DH-5感受态ATCC限制性内切酶NEB公司Sf9昆虫细胞Invitrogen公司胎牛血清FBSGIBCO公司CellfectinReagent 转染试剂Invitrogen 公司Graces Insect Cell Medium GIBCO 公司CIPNEB公司2.1.2部分主要试剂的配制I、培养基1）LB (Luria-Bertani)培养基蛋白胨 (Tryptone)10 g酵母提取物 (Yeast extract) 5 g氯化钠 (NaCl) 10 g于 1000 mL 双蒸水中溶解，121 高压蒸汽灭菌 20 min，4保存待用。2）LB 固体培养基将琼脂粉加入至 LB 液体培养基中达到终浓度为 1.0%即可，121 高压蒸汽灭菌 20 min，倒平板前加入相应抗生素，待凝固后 4 保存备用。II、核酸电泳所用溶液TAE buffer (50) PH8.5Tris 242 gNa2EDTA2H2O 37.2 g0.5 M EDTA (pH8.0) 20 mL加入 800 mL 双蒸水，加热溶解后，加入 57.1 mL 的冰醋酸，补水定容至 1000 mL，常温保存备用，配胶及做为电泳液前先稀释至 1 后再使用。III、溴化乙锭 (EB)溶液母液配制终浓度为 10 mg/mL 的 EB 溶液，并室温保存在棕色瓶子。IV、琼脂糖胶的制备使用电泳缓冲液TAE制备1.0的琼脂糖胶，微波炉加热2-4分钟，溶液澄清透明后停止加热，自然冷却后倒入胶模。20分钟后胶块凝固即可使用。VI、感受态制备所用溶液TSS缓冲液（1）PEG8000 0.5 gDMSO 0.25 mLMgCl21.015 g用称取好上述试剂后，加到 5 mL LB 培养基中充分溶解，过滤除菌后储存在 4冰箱。VII、sf9细胞培养液（50ml体系）Graces Medium44ml胎牛血清FBS5ml双抗1mlTotal50ml注：双抗指两种抗生素：青霉素和链霉素。2.2实验方法2.2.1 sf9细胞的传代培养使用 Graces Insect Cell Medium加血清及双抗的培养基，在 28细胞培养箱中贴壁培养 sf9 细胞，当细胞生长至 80%左右，直接将细胞轻轻吹起，每两天左右 1 比 3 传代一次。2.2.2 分子克隆基本策略载体构建的每一步均采用经典的分子克隆方法：1） 设计特异引物通过PCR扩增获得末端含有特定酶切位点的片段；2） 同时对载体和片段分别酶切，并纯化酶切产物；3） 使用T4连接酶，16连接载体片段过夜；4） 转化、摇菌、涂平板（实验中使用的都是氨苄抗性平板），平板于37烘箱中过夜；5） 挑斑摇菌，菌体浓度增大后用相应引物菌液PCR鉴定，扩大培养鉴定为阳性的菌；6） 保存菌种后（菌种保存在10-15甘油溶液中，-20），用质粒小提试剂盒抽提质粒，并测定浓度；7） 利用合理的限制酶对提到的质粒进行酶切鉴定；8） 挑取阳性质粒测序，测序正确后将质粒用于下一步使用。质粒需保存在-20。2.2.3 通用PCR体系及程序鉴定性质的菌液PCR及质粒PCR在本实验中皆使用同一种PCR体系：模板1l引物F1l引物R1ldNTPs1.6l10xBuffer2lEasyTaq0.5lddH2O12.9lTotal20lPCR程序：1） 95 5min；2) 95 30s；3) 60 30s；4) 72 ；5）72 10min。第四步延伸时间根据片段长度确定，约1kb/min。由第二步到第四步重复30个循环。对于菌液PCR，可以适当减少两个循环，以避免非特异性扩增产物的出现。对于需要回收后产物的PCR反应，我们使用Primer Star代替EasyTaq，对应的Buffer也跟着换，程序中变性温度提高到98。Primer Star是一种高保真的DNA聚合酶，可以一定程度上减少因PCR扩增带来的SNP。2.2.3 酶切体系和方法及胶回收试剂盒的使用载体及片段酶切方法及体系：DNA量1.5g酶14u-10u酶24u-10u10x Buffer4lddH2O Total40l酶切消化2小时后，对于载体先经过琼脂糖凝胶电泳，用胶回收试剂盒回收对应的大小的胶带，回收步骤如下：1） 切胶。带上相关防护用具后，在紫外线下切取目的条带。尽可能快，避免紫外线对DNA的损伤（控制在10s以内）；尽可能不切多余的胶块。如条件允许，最好在把胶块放在玻璃上以减少紫外线的损伤，或使用长波紫外线，或使用其它的DNA染色方法；2） 溶胶。将装有胶块的离心管短暂离心，依据刻度大致估算胶块体积，加入等体积的Binding Buffer 于60溶胶，期间因上下颠倒离心管以加速溶胶；3） 挂柱。将已经溶好的胶加入提供的柱子中，10000g 1min离心。去除滤液，加入500ml Binding Buffer 再次 10000g 1min离心，去滤液；4） 洗柱子。加入700ml Washing Buffer（已加乙醇），10000g 1min离心。去滤液，重复此步骤一次；5） 空转。13000g 2min离心，除去残留的Washing Buffer；6） 洗脱。根据预估DNA量加入适量60温水（一般30l），1-2min后 12000g 2min离心洗脱DNA；7） 浓度测定。利用Nanodrop 2000测定DNA浓度。注意：对于PCR产物及PCR片段的酶切产物的回收，直接加入Binding Buffer 后，从第三步开始回收。2.2.4连接体系及方法载体片段连接体系：载体150ng片段100ngT4 ligase（10u/L）0.5lT4 ligase Buffer（10x）1lddH2O Total10l16连接过夜后，将产物用于转化。有时候在连接之前（主要是指单酶切的连接反应），需要对载体进行去磷酸化，去磷酸化反应如下：载体150ngCIP（10/l）0.5lCutsmart（10x)1lddH2OTotal 10l去磷酸化反应在37处理30min即可。2.2.5 转化用 E.coli DH5 感受态的制备制备感受态前将实验室中保存的 E.coli DH5 接种到 5 mL LB 培养基中培养 12 小时。主要步骤如下：1） 取 2mL 活化的菌液接种至 200 mL 的 LB 培养基中，恒温摇床，37 210rpm 培养 4 小时左右；2） 将菌液分装至 50 ml 离心管，冰上静置 30 min，再 5000 rpm 离心 5 min 以沉淀菌体；3） 用 5 mlTSS 缓冲液将细胞沉淀重悬浮，冰浴 30 min；4） 分装至预冷的 1.5 ml 的 EP 管中，每管 100 l，放至-80冰箱保存。2.2.6 转化的步骤本实验中，所有的转化均是转化大肠杆菌1） 取感受态DH-5于冰上；2） 待感受态细胞融化后加入已经连接过夜的连接产物，轻轻混合均匀；3） 放置冰上30min以上；4） 立刻于42热激90s；5） 热激完毕立刻置于冰上2min；6） 加入500ml无抗生素的LB培养基，摇菌1h；7） 涂平板（本实验使用的都是Amp抗性）。2.2.7 质粒抽提试剂盒的使用本次实验中使用的质粒抽提试剂盒都是同一规格。1）10000g 离心1min摇菌过夜的菌液，去上清；2） 加入solutionI 250ml重悬菌体；3） 加入solutionII 250ml破碎菌体，上下颠倒数次混匀，不可剧烈震荡以免因剪切力撕裂基因组DNA；4） 静置2min后加入solutionIII 300ml沉淀杂质，上下颠倒混匀数次；5） 15000g离心10min；6） 取上清于提供的柱子中，10000g 离心1min，去滤液；7） 加入500ml Buffer DE-A，10000g 离心1min，去滤液；8） 加入700ml Washing Buffer 10000g 离心1min，去滤液。重复一次；9） 空转，14000g 离心2min；10） 加入适量的ddH2O洗脱，并测定浓度。2.2.8质粒DNA的非柱回收简单纯化步骤1） DNA溶液中中加入1/10体积的3M乙酸钠或2M氯化钠或5M醋酸铵；2） 加入2.5倍体积的乙醇（或的体积的异丙醇），混合均匀，于-20放置半小时；3） 10000g离心10-15分钟，去上清；4） 用预冷的70乙醇漂洗后风干；5） 加入ddH2O溶解。2.3载体构建流程1） 图3中，各步详细步骤如下：设计mCherry的引物，使两端分别带有AgeI和SpeI酶切位点，PCR回收后，同时对载体pMIB和mCherry进行双酶切（SpeI/AgeI）2小时，并通过柱回收方式纯化酶切产物，然后用T4连接酶连接过夜。第二天转化，第三天挑斑，通过PCR鉴定和酶切鉴定后得到阳性克隆。方法同上，使用限制性内切酶为BspHI和SpeI。方法同上，使用的酶切位点为SpeI和AgeI。其中GFP基因为实验室自有，通过NheI酶切位点（事先设计含有NheI位点的GFP引物）放进T载中；而VP-EL222则通过BsiwI位点放进同一个T载中；这两步克隆中，均需使用CIP碱性磷酸酶，均包含插入序列的正反鉴定。因这两个基因为串联表达，故先通过T载体，将两者克隆在一起。克隆方法同上，使用的酶切位点为PvuII和BglII。克隆方法同上