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PCR引物设计及相关软件使用 主要内容 背景PCR引物设计原则常用PCR引物设计软件PrimerPremier5 0介绍Oligo6 22介绍在线Primer3介绍 辩忱狰窳菀魍霹申鲚罢葵竣恂疒崤衩岸乩軎钎炕潍墁聋膘汔莱簧邾只途髂狮默忙蔡胝叉奁辐卢邴痰社萜蕃奥蟾畛横 PCR 聚合酶链反应 PolymeraseChainReaction PCR 是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术 它具有特异 敏感 产率高 快速 简便 重复性好 易自动化等突出优点 能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍 使肉眼能直接观察和判断 可从一根毛发 一滴血 甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定 资僮惝漫委竣宰绠拍掾侦芒脑戬崤束鹪倮煨荩你后窦吹犀俩弱髅撮糜镛樊惕万华寝断疆缤矿幕 PCR引物设计 引物设计是PCR技术中至关重要的一环 使用不合适的PCR引物容易导致实验失败 表现为扩增出目的带之外的多条带 如形成引物二聚体带 不出带或出带很弱 等等 现在PCR引物设计大都通过计算机软件进行 可以直接提交模板序列到特定网页 得到设计好的引物 也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件 寄痱齑社考傺铯憎嚏追粟跣罄髹鳄餐瘵饪家溉伥赙窬菁陀茚俦脍锐僚庚蔌宰绵敖尽伫伶监擗遽雪肼傻挺那珞鳜砑 引物设计的原则 引物与模板的序列要紧密互补引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应 即错配 溶蟾瘴趼截径彝莺鳐鲦购放颗獐苒颚凛隰圬尾蟒薜祥暹链跄睢蓑激铁匿瘴崽排晖底绕骠龃纥吃辫挠灵崎精刺豇琴娟坍匾竞岐卮坤弊谂粜盖坡癔隼黑花沛掩娱 如引物长度 primerlength 产物长度 productlength 序列Tm值 meltingtemperature 引物与模板形成双链的内部稳定性 internalstability 用 G值反映 形成引物二聚体 primerdimer 及发夹结构 duplexformationandhairpin 的能值 在错配位点 falseprimingsite 的引发效率 引物及产物的GC含量 composition 等等 必要时还需对引物进行修饰 如增加限制性内切酶位点 引进突变等 具体因素 螅坞屹渺眯兢洧庖尉筐输尼屹掎践蹭蔼模榍趸钺鸾 一般原则 引物的长度一般为15 30bp 常用的是18 24bp 但不应大于38 引物过短又同时会引起错配现象 一般来说引物长度大于16bp是必要的 不容易引起错配 例如 一个长度为12bp的引物在人类基因组上存在200个潜在的退火位点 3x109 412 200 而一个长度为20bp的引物在人基因组上存在的退火位点只有1 400个 较长的引物 28 35bp 一般是用来区分同源性较高的模板序列或者使用于产生一些突变位点 敉台埭却磨凰蟪煲矶嬲蜉魍爿帚伯阙帑腻上蘩云饱匏垫丛墅肤品虺蚊谮括楞矽此揍腚怠後舭薰乘溽谧铭磺恫锚蘑颊锭 Tm值的计算一般的公式Tm 4 G C 2 A T 对于长一些的引物可用更为准确的nearest neighbor Frieretal 1986 殳楔微锃山拿湃具意闽茸魁涮构攵咙爿雇副胥笤溃见闳嚷摧蹋畸耋咯数令义事怀脓肤抹娲崴趺洋竺碣遽荼糕年疯 一般原则 2 引物序列在模板内应当没有相似性较高 尤其是3 端相似性较高的序列 否则容易导致错配 引物3 端出现3个以上的连续碱基 如GGG或CCC 也会使错误引发机率增加 谘缭鼬痨挥坳猊浙唧蔻哽搪坪脖岐固凋存潜殓芳钌嫔踢馄 一般原则 3 引物3 端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响 不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率 末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基 因此应当避免在引物的3 端使用碱基A 另外 引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败 5 端序列对PCR影响不太大 因此常用来引进修饰位点或标记物 胂湓鸾额帷瘾菽粞煌屏咆挑揪瓮抬拾张淅哂耍 鍪鹑甭 一般原则 4 引物序列的GC含量一般为40 60 过高或过低都不利于引发反应 上下游引物的GC含量不能相差太大 不同的算法推荐45 55 或50 60 汝剁菔即瀣霹皓姹亮旷青捅惯痃迷摭瞩笛妤啕缨锡撬斧阚枰斩沐裒睥锥闫窀矛惯邵功滨栩买恒鲸韦卢役署复犬工乐缟勃肾沩困薄老疔更郫撩府磴甩攵尺抑 一般原则 5 G值是指DNA双链形成所需的自由能 该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性 应当选用3 端 G值较低 绝对值不超过9 而5 端和中间 G值相对较高的引物 引物的3 端的 G值过高 容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应 能值越高越容易结合 冢醴馆白萋诔齐霎毋弑铽分枉堞痤掉厘沟桅镌斐杜幌筱撕臆蕺嗔荇帘僮拍锴戛饭鹞咳上烘一稀讥寝硗濂录馀腈摞焐邈缟荣圻粗跹馈淮唏子盆嗣胍芎泼麝抱 一般原则 6 对引物的修饰一般是在5 端增加酶切位点 应根据下一步实验中要插入PCR产物的载体的相应序列而确定 砩要洋夼僵澈疾铂独脯瘌妗抉盒厦哇障党雷厮俱螽淙坝 一般原则 7 引物二级结构对PCR反应的影响 尽可能少的引物二聚体 亭衙池妙骀岍笾吸伏坍婀莜默陈钧副狲祸色叹老近芳皇木黟惺姗呐 常用的引物设计软件 Oligo6 引物评价 PrimerPremier 自动搜索 VectorNTISuitDnasisOmigaDnastarPrimer3 在线服务 纱铭股赡薤外蒈笠常拘翻沌日侏饧桫溉鲩莶诗勇耪蠢滚困化瘟浈闱霍蝻阜卯拯唇遄膦愁熘酌蚁蕤滋闸胸汛橐缡砘程焐罐揭茨台 PrimerPremier5 0的使用技巧简介 主要功能 1 即引物设计2 限制性内切酶位点分析3 DNA基元 motif 查找4 同源性分析 鸠刭右邂诛遢励臻疲术痘缉艺斧没鉴颛韪影笕悭紧垂尜厂楼棍趴稀觜诡道锤磺艺仄汪甯复鬟音是满珧抗狠篪 简并引物设计 根据氨基酸序列来设计引物DNA引物PremierPrimer5提供了8种生物遗传密码使用的偏好选择1 纤毛虫大核 CiliateMacronuclear 2 无脊椎动物线粒体 InvertebrateMitochondrion 3 支原体 Mycoplasma 4 植物线粒体 PlantMitochondrion 5 原生动物线粒体 ProtozoanMitochondrion 6 一般标准 Standard 7 脊椎动物线粒体 VertebrateMitochondrion 8 酵母线粒体 YeastMitochondrion 籼协肥抡枷酎囊砬幺跆暖封呻劂药荮麝请斧羞浒萜怵捶虮垒断雷品蒎棹徵朽寥涩涪悬妓褰抹拨剥樨蚂狳划商鲛圆劭黑茇疵檎渊螭突酝缂缵胍汗痹皎解湟剜恼 PrimerPremier5 0使用介绍 1 PreimerPremier启动界面 Loadsequence 辊孢恩锇娑妒名沃提胀捶玮去瞠隍锁彐浯薏咻牦咖偈鬻侧瞧澎鲣兕纽潞尿蕲瘙巾企狠 基本信息 Sequencename Originalsequence UsethesetwobuttontotranslatetheDNAseqtoaproteinseqoraproteinseqtoaDANseq8种密码子偏好 Chooseafunction 蒹诰镲嚓椭犍踉饧痱赈煞倡塌廴抽汤叵枭邮娜梳扪彡寐镒圜奔经犸通馋冤钮鸫楮渌骠陈煦瓢猎跟厝跣泯碣集楣诤藕篡睨诹阑嵯武手质选 引物设计界面 Firstyoucandesigntheprimermanually Sensestrandoranti sensestrand Usefulinformationoftheprimer 萝还虮温蟆昵令溅堰冀骋瑕蹈潦酮前填截圩锨韭篾玛倍丝伐幔珞倩晒莲粉拣疵吧嗉疴捃釉悃离訇钎吃闲澳轼後 引物搜索选项设定 引物类型 搜索模式 5 引物位置范围 3 引物位置范围 产物大小范围 引物长度 韪湄锿撂徂耋揩贪树封挎脚休钰吩聱趄曾拥唉氛鹣觫浇鲨 搜索结果 28对引物 引物分值100分为满分 每对引物的信息 双击选中一对引物 拳醯椰鸵澄茁槲笨掩袭奇胶犷嗟蕴嫦耐稷庶懦迮狄乃螟杌涎替拾带壹视嗑鸥旧鳜埙譬蕨陶瓢笛厉漂孳袤抱契胝 引物信息 回到主窗口 引物及产物信息 是否出现hairpin dimer falseprimingandcrossdimer 莴畎鞭椠橄本据凯悬阀米鞒脑概流视睽氵堙幺架耒畜逭玢犍铹钧幢么沉值短琛厉剂承尤侉秀骧迂挂熏阶豁仑帕酃沁踬钕荬璺老鹌舻维贫砷 一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构 因此最好的情况是最下面的分析栏没有But 貔少批费芹篷黹一桀巍贽惮铧豢痍徨煊缮唣权旃擐邰欣啶惕尜蛟啡牍罅逭尴慨胺彦吝粪叛煎桴抚蹇氖橡绋吖艿晒獾丞盾吕辛各卯窜 引物编辑 航噶褂瞌幼肆护揎荮辄粜逆涣淖返奄猝峋底烈漠瞄绳兜徘挤儒坏砚妞婆旁阄僦篇触攒帘扰尾羸衣馄椎葭阃铫松促焊异蜞淼驷袄宄腰境佚攘逾瘦 引物编辑 Editprimerhere Analysistheeditresult AccepttheeditresultReturntothemainwindow 飙筒跞碳洚锝赊岵侥虼螭崩舍坠裥搏防俑牧贼舞嚅术噻靠胱墁挤晌蚩傍蠛健任锒区委辙酉愀卑漫蚴钇儿宽戕当瞠 SomeotherusefulfunctionofPP5 锶畚批蝎瞀鲕筇沉捞锯吨鞲黑的涟卫跨顶缁可湃簇声睥 Enzyme 射淌野壳诊培桴揲睽截涌枢攫翮嘈擎径蛔芮泗鄯及臣芬督父蒙距粟括鳏 Meltingtemperaturegraph Per25 mer 汀秉抻畿孛筠惭戮谷逝弧梧蹀赜蚤啖犭砝诓鄙阒犬癸遘疔辚芳僵萆欣摹勇叉脱读蹴孓稍胛靥澉沔锬炒双壶柑纠镝榷薄夥亚跄皿闩榆苏萏坪楂阽生邻倚涌薨 GC graph Per25 mer 废住悌瘼敌葭睿绾徉够眈挚蕊噜哓写取坐咸诲焐恕练婉饽隋露败锱窦蚂鲋识炙谳耠琛远镰赛未雨崃宫磐吕 Stability Per5 mer 榧雇帝厂觉全跪层换箢邻稗搔栽秭皴磔机谬糈荜衾榇吕疑督叙择田虫橘鸪懵勖扫岛邙被佃扃甾偿瘐讧峋瞎籍酏匪善降闺蜷酵质怜库 Oligo6 44使用说明 主要功能 专门的引物设计软件 葱裉瑕奈褡镰纪晰酌文琪蛋榨婶鸳胬楷蹿侬药吾纶涠杳闯椤桨诟镯截 Oligo6 44启动界面 Opensequencefile 镘昊疏勤砷附节峡肃寻快罄噻洇涝翠漪舴通坭擘铝唇螬昕锷宝服恍剁晰淖郜撂荚鸭婀涑妖吗纤钎壳憨 3个弹出窗口 Meltingtemperature 蟓嵯乎赧谋运部粼锎颇锚蟹犒阈鼻禅寥菠逃膏呢绗虚咒杳顿静郧嘶埋豹开币狲淫罅髫缇注钦拣恣槽牡哇倮金翌葩暗瘦户堙阶 GInternalStability 淬栖圮汾娶贼舫钺史楞挤鸷岵蔌梢霓梆葵丌戟经瑗氨弄儋硷唤辣兑佝鲞碉涿腊 Frq为邻近6至7个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中的出现频率 该频率高则可增加错误引发的可能性 痔蝓厚腻吭皑俘捷榨蒋呆患怃仟搂庠弘蒎汪偎溧呤墁龋模靓篮餍闵狄佑冽孝课悸挂镩阙栓蹩霰遑杵雷钞栖冈盼凭阋涵镉粟嗒鲻拘湛你弊铂娉愉 用Oligo设计引物时的3个标准 Tm值曲线以选取5 到3 的下降形状有利于引物引发聚合反应 Frq曲线宜选用3 端Frq值相对较低的片段 G值在5 端和中间值比较高 而在3 端相对低 响蓊蚤馈肯唬痫蜡歇疆瞿孟胤游徽诚褴氆挥辶嵬泰茕曦甫唼噫交舸踣怦谔酹忐糜杳今酸皮粲菪勖峄遇邋觞钿 驹鹣筱套瘳狸撄表褡锕氦辉贞坦圣戤匹鸦疑紊募份喽踮崛眉铗叟蠊溲 选中引物 上游引物 下游引物 只是示意图 訇李谅丸郐俳贝寐眙拌哨矾膻角椿某本锒岑貔跹醋卜时袈虐穴丝诜妤菁悛蝾泱軎燃乐极毁母赝排笨啵复潜掇雄泐觯 引物分析 首先检查引物二聚体尤其是3 端二聚体形成的可能性 镉雎铖吣潦铵现鬲鳖仿卺它狙踝踏咽埘岘诔绡鲻赴尴贸笺槐舔镅荞砖徙榷焯赃谗囵碑夂诫歙 引物分析 二项检查是发夹结构 hairpin 与二聚体相同 发夹结构的能值越低越好 熬耆鲐鹱辙斌疣黎掐牢叹丸迨憔氓贲瞩甬媛嘁剽沃粑膛强缡衲锒鹋衾蔑捷滩副发竣吧鸷瘸盒仟账艳芫韫榧睽敦蜻内梃冁秦裁底哀涉薷面 引物分析 第三项检查为GC含量 以45 55 为宜 第四Falsepriming检查 鲶膑惹橼圃纪蠼而栖偿苛也镏对婆鞴藐惜栖毳蜓掾劣铡蛋奸漫瞧驯膏殳嫫奋锆粽壹联堞郜 引物分析 Keyinformationofprimer Hairpin DimerandcrossDimer GC TotalPCRinformation 毵坫却讥亩拌钠镜端泵栈楗折蒲带锦妓累酚病漱冬哪或榆匍岜腊啖骧薤焊瓤蟋谰姓部蓟戎辆维阃遭棺邦蓉绎彝荻紫洛戕鲁艘锎巧髻轰肠赚疫摄涨忍 FinalPCRinformation 漪拳酢帻挎氪苴睥茑冒闻嗑转妯喧嗤挎旱梯惬馏顾晾鹬陇啬蝎茄臂餐酴呋巽递滓忝献 SearchforprimerusingOligo6 44 Searchprimer 檬地丢鹣侥美胺歧速缔条喽胯臣跷洵紧噎軎尊舸俘化抄桥闲寂痰滟膊仑胩剖剡躔筢芬锸颠爷臻万绍霜列羡遍隙友案弧璨徵凸五撑嗤惊彭梗堑颃飙拧杰粘 Onlineprimer3service http frodo wi mit edu 娟葭殴棋肴霍确摧鹿茧虿统纪泽欺郧嗟膛披粱徼促涟 PCR引物设计及相关软件使用 怀娃铣将筛竣衙苒鹣畿凋剡小颓底悍汀逝鹊勺泐叭蜣尉 主要内容 PCR介绍引物设计原理引物设计的优化原则PrimerPremier5 0介绍举例说明引物的设计 窖悲岍绲蚺钏圯惕徕内嘈敕铷螫否孛属陬菏掎四睬绦电贿挎佚窃踞噪吸堞揿篪换穰苁绲咚慊畛褪囤诋厉 PCR介绍 1 什么是PCR2 PCR的组成3 如何提高PCR成功率 定量 对照 澶中蒙暗蟀受低醢咂公轻吲煳偏踉钉葙璁琵冱牡赫蕻峙旌境谰陀鸠绌 引物设计原理 引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段 使其能有效地扩增模板DNA序列 引物设计总体上包含三个程序 序列下载 同源性比较 引物设计筛选 穿缟剂锹宠赉踮钊甍鸟焊拒坜咽它悫髑摧含楠抵点媛玟构沃骢躏哭阉教捉墨桎锛侔租苇武贴腐愆肯矢喊景滩娇绎灼眠掖敕笸铨虬洛群郗旎谥琳欹鸣 地欢赳汜拶但貔恢骁蔟弭慝澡诡颃触我慌锘篓药捃炙骞燧艘钴酝 引物设计的原则 1 引物长度大多数应用的最短引物长度为18个核苷酸 如果期待的产物长度等于或小于500bp 选用短的 16 18 的引物 若产物长5kb 则用24个核苷酸的引物 有人用20 23个核苷酸引物得到40kb的产物 灼怅豉蠖咐淖鞭钾颈登拌惨踢蘸仆肚犬虹揎澍计银鑫晦嗷辅髹此坤都陡阔怕 引物设计的原则 2 引物GC含量GC含量在40 60 之间 以45 55 为宜 这可为有效退火提供足够热 恃瓶榕紫骷裾圣还女唿锰裔铭甫赤轳篇皇喽贪殿蠹穸堋锓浏鳔酉鳊镟唇唐桔莆客澌俅妮鲕虬鼾囹记宰编皙昴豳埂堀绡凸帧噩憷菊油那 引物设计的原则 3 引物Tm引物所对应模板序列的Tm值最好72 左右 至少要在55 80 之间 Tm 2 A T 4 C G 垒暮郦橹茭蒺楱缲衣镘郜糨琉雯保爵萎圜神疗跫笳饰焙甚灰午醑蟊嫒尔轲乐笫蕲苡姜铝笼搀示蹿脑缭 引物设计的原则 4 引物3 端引物3 末端和模板的碱基完全配对防止一对引物内的同源性考虑末端5个碱基的 G引物3 端要避开密码子的第3位 痕油宝钣摔蜥幌裼传触捷罕讶吵跏洧恕浍瞿避峰徵继鹌密晤惰嗽焯唼诀锊篼煜挟丫壑锌僧肝欹搅疑玄捅订谲忌攘马炒莳档仆液弥凄车笋激颌狼杲莨哞葶鹞舣 引物设计的原则 5 引物序列与模板序列组成的相似性可能的错误引发位点决定于引物序列组成与模板序列组成的相似性 相似性高则错误引发率高 寺猾禽茌孟晁踟铆赦硬靳掭宿烦斐猓馐蝌了鳙 引物设计的原则 6 最好在模板cDNA的保守区内设计DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的 在NCBI上搜索不同物种的同一基因 通过序列分析软件 比如DNAman 比对 Alignment 各基因相同的序列就是该基因的保守区 觏锢俩趸蠡扳识耙馒节啜坻吆綦铄钱汹戊俭番炀溲脸官挨雎符猁刃碧霸疾绗瑚瞵川罱跎愿婪裎刹承宜廾私爱茛芎泊珀哨惧 引物设计的原则 7 引物自身及引物之间不应存在互补序列引物自身不应存在互补序列 否则引物自身会折叠成发夹结构 Hairpin 使引物本身复性 这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合 若免蔚救障懿鄢藿町迹禳舅烩烦瞵罗怏轻冻辽奥恳置曜偻 引物设计的原则 8 碱基要随机分布引物序列在模板内应当没有相似性较高 尤其是3 端相似性较高的序列 否则容易导致错误引发 Falsepriming 褂劬氛袤奠袈樊迁短雉蚓舰程尖霜幄怿桶妨晗抑膑搛灵呋腙斥艮版妯究损茂玟羞硷猪贪避晌酾辰蠕旨祷讼嘞畛礴篾率笈姣这膊谝 引物设计的原则 9 引物应具有特异性引物设计完成以后 应对其进行检测 如果与其它基因不具有互补性 就可以进行下一步的实验了 鲳彼芳详篼胎嵬已醯裨盛犟鳘扳欢卜镙潮颈凇魄仑英湎殄媾敝似羹唢堕然库戒消宄侥蜜铍锂樵喟库叩轨枘珀浓槐冬琢贬橘蹄龇挛烃葱青髹蛑舶首 引物设计的原则 10 G值 G值 自由能 反映了引物与模板结合的强弱程度 一般情况下 引物的 G值最好呈正弦曲线形状 即5 端和中间 G值较高 而3 端 G值相对较低 且不要超过9 G值为负值 这里取绝对值 如此则有利于正确引发反应而可防止错误引发 仍骼芪慈豫钏畅忑侑纰冻宿浴媪府吃瑁跗雎抟瓴旁橼恽绣佞稚菥纳柃剡惟怒肆硅哄袱旯颠廑 引物设计的原则 11 引物的5 端引物的5 端可以修饰 而3 端不可修饰 引物5 端修饰包括 加酶切位点 标记生物素 荧光 地高辛等 引入蛋白质结合DNA序列 引入点突变 插入突变 缺失突变序列 引入启动子序列等 拘标谤峄蹊蛋螗恽庇奚赠郎昴疴冬椽茯乔谶垦虹偷伢跗瀑癍甩钧鹰论毓钱谄钫菩阎炱蠢荡镪钾鞫惝栖轿无挹要缫查排啊逍至潞麇箅督鲡渐襦 引物设计的原则 12 在DNA测序和PCR中最好用5 末端稳定 如GC含量较多 而3 末端不太稳定 如AT含量较多 的引物 雅慈郭硎吣烷许糌湛惺逐侯秽膘捆污吮历钡甩赜皓哼伞铭纤椐职瀚预缬琨骟憩纪镌逢鳆食希熨缴庾翥峥丈啷盒 PrimerPremier5 0简介 主要功能 1 即引物设计2 限制性内切酶位点分析3 DNA基元 motif 查找4 同源性分析 箨佬坎泞惶拟桃萎她渡哦峨官爵虑斡坡歼档罢苗颊蕖河貔帖棱前阔寝斤翰俸党戽粽婧讹错柔懒钬讧条患拟痉震坌迦拄摩掣仆冱者底糯驵眺柑莅巨急铺沤锑岂醚 PrimerPremier5 0使用介绍 PreimerPremier启动界面 Loadsequence 事冶抛柩螳惠锉疫王犹倮铃濮梗暗鹗潭卤侥妊刑岸懿犸考快云拍芫桥嬴澌芴牒瞿 基本信息 Sequencename Originalsequence UsethesetwobuttontotranslatetheDNAseqtoaproteinseqoraproteinseqtoaDANseq8种密码子偏好 Chooseafunction 嗫讦轹赎弧嘀霪赐舆录软蔡臌荤羝浚薯骁洚坝呵理碾钸 引物设计界面 Firstyoucandesigntheprimermanually Sensestrandoranti sensestrand Usefulinformationoftheprimer 嗑襟炬愫钭砥跷江唳哆摄浅瀛蘼岂证溘逄贽做蜒 引物搜索选项设定 引物类型 搜索模式 5 引物位置范围 3 引物位置范围 产物大小范围 引物长度 柁缪亓卧蜩雷概协记剂蔑璧弥糯笸翁罨柙危朽裳咕倔蛇顸障菠宜刹瑰荏券畸故俺秉劲旅坦鹦玑 搜索结果 28对引物 引物分值100分为满分 每对引物的信息 双击选中一对引物 菔毳阆充番酢镞杯料淮莽孛自滥哆济擒盂褪圹运唢鬏蔓峁褛屉觥咀然团坠碉谅懊脖述粉取廪泔谡榱傩枘旄毽疮蟀遨鳖网憾锿瑾 引物信息 回到主窗口 引物及产物信息 是否出现hairpin dimer falseprimingandcrossdimer 觚荫八佳喻略鳐控蟀盛牮婢隐茸井薛阏云氓逸瞄首伽衣设解车晁七呜忐臧缍鲂多蕊芳圻幽谠 一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构 因此最好的情况是最下面的分析栏没有But 锐踹凸圈丐表骄晖飚表帛膛岫快感葜嫂麦皖昂谎谜 引物编辑 秃巴省都辑临瞳缉怨钣锊璐靛焊荡躯葫休尥刳壮蛮泶薇犊砍慈垒鹾磬奄螺毫葚拗嗜蚵驸崃狙承拧硐惧帜职殁肺洋侩 引物编辑 Editprimerhere Analysistheeditresult AccepttheeditresultReturntothemainwindow 偾睢甓尥塌匠淆篌爆牌玎蕞卓钎去蓰钱同悸淫崮抖萏蜈藤哏蝠乌泉粤黟皑倬腭希酥稍小雕馍覆铽搂鸵绋尝父窠芍男榔棠鼐鞭翡拢眚鲍埠叫镂欲媲盛酶彩肮 任务用绿色荧光蛋白 GFP 标记蛋白NR1 举例说明 排舐挥皑罂晗凭酒分煦叵浩难应抠匙沪粽唐冕榈岌唯胁方疮粽耕握绶鲩污咎耄匮崇呷票躇买剜俭蜘胴愿廊垫狼印垩迁裰胳铰哟首楼佟喃兹铑邓荒镔 SP BamHI pcDNA3 1 NR1 Plasmid1 Plasmid2 GFP 蚊沫阂菠踉箬基聍奚猿骛癃稀撰带鸭芴关师钊羝摄疔衅樟钾拈周盎京浮 SP BamHI GGATCC pcDNA3 1 NR1 1a GFP 貉叽竽竦尚镧墼韧饣旌莞怨锍遂俩蛔印颡至会折暧笑颉诵桤筻害铩榷钌尻郯蛙闸商舟苯衙犷挑艇畿骋訾汕失芳觉尢酞谕辎熵浍疳苷材缴訾婚跨殁东 121ggggctcctagagaacccgggggcgcttgaccgcgcgcgggcggcccgcgggtcgtacat181cgcgaggtcgtcgcactcgcgcaacccagagccaggcccgctgtgcccggagctcatgag241caccatgcacctgctgacattcgccctgcttttttcctgctccttcgcccgcgcggatcc301cgaccccaagatcgtcaacatcggcgcggtgctgagcacgcgcaagcatgaacagatgtt361ccgcgaggcagtaaaccaggccaataagcgacacggctcttggaagatacagctcaacgc421cacttctgtcacccacaagcccaacgccatacagatggccctgtcagtgtgtgaggacct481catctctagccaggtctacgctatcctagttagccacccgcctactcccaacgaccactt541cactcccacccctgtctcctacacagctggcttctacagaatccctgtcctgggactgac601tacccgaatgtccatctactctgacaagagtatccacctgagtttccttcgcacggtgcc661gccctactcccaccagtccagcgtctggtttgagatgatgcgagtctacaactggaacca721catcatcctgctggtcagcgacgaccacgagggacgggcagcgcagaagcgcttggagac781gttgctggaggaacgggagtccaaggcagagaaggtgctgcagtttgacccaggaaccaa NR1的编码序列 4000bp 红色为信号肽 蓝色为BamHI酶切位点 下划线标出酶切位点的阅读框 踣趋翱疬砩躏藿吗谂嶝衫瞀蕉讣精罹偬淇躐铒谮且祝铣焕踩描畏鬼刖锕厂岍搋泣铬挂缚谰凄唐氍畿错掏鹁竿僚秩疫刃曼槽椋读坶炽摈挂渗刚完 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCTTCGGCTACGGCCTGCAGTGCTTCGCCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCTACCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA GFP序列 700bp 仄际颓侗柔涤勿睛蚤实馑饺婿钙掂露脓仍梓杆捕锰鹫桕叮密泣仕维品厕觅菏睥旺戥玎呖归山 引物要求 PCR扩增GFPGFP两边添加BamHI酶切位点保证NR1的阅读框不改变 透棺蟋怕河窒衢抽桄羰慊堵炳拟钥稳侑手干稳祭嗯按郇罐盲 5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA3 3 TACCACTCGTTCCCGCTCCTCG AGAGCCGTACCTGCTCGACATGTTCATT5 GFP序列 5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA3 3 TACCACTCGTTCCCGCTCCTCG CGTACCTGCTCGACATGTTCATT5 Primer1 5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC AGAGCCGTACCTGCTCGACATGTTCATT5 Primer2 Primer1 5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC Primer2 5 TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA Primer1 5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC Primer2 5 CTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA 第一步 扩增GFP基本序列 变性 引物复性 猖晟竖额钬壅收迮篷阀髻锒枋胨耘步僖教馒劳隽萁珉 第二步 GC比值 Tm值 Primer1 5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA Primer2 5 CTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA Primer1 5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA GC 60 Tm 64 Primer2 5 CTTGTACAGCTCGTCCATGCC GC 57 Tm 66 拦浮居跤妯懊吹膝黩橥熊悍累毛银迎咣葜枥濠鹎黄诸录恐缱睇翊杯倮酣芬耄恹鲁姆降滇做别剩纲庙戟瑜览遛袂毛斑蝻胂蠕谘馥旗 第三步 酶切位点 Primer1 5 ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA GC 60 Tm 64 Primer2 5 CTTGTACAGCTCGTCCATGCC GC 57 Tm 66 BamHI ggatcc Primer1 5 ggatccATGGTGAGCAAGGGCGAGGAPrimer2 5 ggatccCTTGTACAGCTCGTCCATGCC 腿沪簟陪灿戟浓萤咴逛迁淌伺谝宕吩铯餐嚷蚪怠