基因编辑CRISPER CAS9.ppt

CRISPR Cas9基因组编辑的研究进展 学科教学 生物 王菲1611290055 要点 基因编辑技术 CRISPR Cas的研究进程 CRISPR Cas的结构 分类及作用机制 CRISPR Cas在基因治疗中的应用 存在问题和展望 基因编辑技术 1 2016年5月2日河北科技大学副教授韩春雨在 自然 生物技术 发表论文 NgAgo DNA单链引导的基因编辑工具 基因编辑技术 1 基因编辑技术是通过人为操作引起特定基因的插入 缺失或替换等 对基因组进行精确修饰和定向编辑的一种技术 Cre LoxP重组酶系统 Cre重组酶是一种具有催化活性的单体蛋白 它与限制酶功能相似 能识别特异的DNA序列 即loxP位点 使loxP位点间的基因序列被删除或重组 基因编辑技术 1 RNA干扰 大片段双链RNA 小分子干扰RNA 二聚体酶Dicer RNA 沉默诱导复合体RISC 配对 影响翻译 基因编辑技术 1 锌指核酸酶 ZFNs 转录激活因子样效应物核酸酶 TALENs 基于特制的DNA 结合特异性的蛋白质系统 通过束缚核酸内切酶的催化区域 调节DNA结合蛋白 引起特定位点的靶向双链DNA断链 人工内切核酸酶技术 ZFNs TALENs 将识别特异DNA序列的TALEN与内切核酸酶FokI偶联 可构建成剪切特异DNA序列的内切酶TALENs 基因编辑技术 1 规律成簇间隔短回文重复序列 CRISPR Cas 通过一小段与靶向DNA碱基互补配对的RNAs及其引导Cas蛋白 引起DNA位点特异性靶向双链DNA断链 产生靶基因修饰 人工内切核酸酶技术 CRISPR Cas的研究进程 2 1987年 2000年 2002年 日本Ishino在大肠杆菌碱性磷酸酶基因附近第一次发现CRISPR串联重复序列 Mojica发现这种串联重复序列在原核细胞中广泛存在 科学家正式命名CRISPR和Cas基因 2005年 发现CRISPR中的间隔序列来源于外源基因 并推测其可能与细菌和古生菌的获得性免疫相关 CRISPR Cas的研究进程 2 2007年 2008年 2009年 Barrangou首次实验证实CRISPR系统的获得性免疫作用 Brouns发现间隔序列可以转录形成crRNAs 具有指导Cas蛋白靶向干扰的作用 Marraffini发现CRISPR Cas系统系统的作用靶点是DNA Hale发现III型B亚型的CRISPR Cas系统还可以靶向性切割RNA 2011年 Deltcheva发现II型CRISPR Cas系统中另一个重要组分tracrRNA 它与crRNA结合形成二元复合体 指导Cas9蛋白的定点剪切 Sapranauskas证实II型CRISPR Cas系统可以异源性地表达在其它物种 CRISPR Cas的研究进程 2 2012年 2013年 2014年 珍妮弗 杜德娜和艾曼纽 夏邦杰首次体外证实Cas9蛋白可以与靶DNA特定位点结合并行使剪切作用 获2015年生命科学突破奖 CRISPR Cas系统首次被成功应用于真核细胞的基因编辑 解析Cas9蛋白的晶体结构 2015年 全新基因编辑系统CRISPR Cpf1 CRISPR Cas的研究进程 2 2016年12月CRISPR Cas重大进展梳理1 Nature 发现两种新的CRISPR系统 CasX和CasY系统2 Cell 首次发现CRISPR Cas9基因编辑的 关闭开关 3 Cell 发现两种新的抗CRISPR蛋白 AcrIIA2和AcrIIA4 能阻断来自酿脓链球菌的Cas9酶活性4 NatGenet 利用CRISPR鉴定出潜在的HIV治疗靶标5 Science 利用CRISPRi鉴定出细胞生长所需的499个lncRNA6 NatMethods 开发出自我编辑的CRISPR条形码7 Cell 将CRISPR和单细胞RNA测序结合在一起分析基因功能 CRISPR Cas的结构 3 CRISPR Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats 被称为规律成簇间隔短回文重复序列 实际上就是一种基因编辑器 是细菌用以保护自身对抗病毒的一个系统 也是一种对付攻击者的基因武器 CRISPR Cas的结构 3 Cas基因主要编码核酸酶和DNA解旋酶等切割修饰核酸的相关的Cas蛋白 前导序列 保守的重复序列区长度为21 48bp含有回文序列 可形成发夹结构 间隔区由俘获的外源DNA组成 类似免疫记忆 富含AT长度为300 500bp CRISPR Cas的分类 3 间隔区俘获外援DNA CRISPR Cas的分类 3 CRISPR Cas9的作用机制 3 PAM protospaceradjacentmotif 间隔相邻基序 该序列由NGG3个碱基组成 位于DNA结合区域上游并且紧邻结合区域处 帮助crRNA识别和获取靶位点片段 在干扰过程中帮助该核糖核蛋白复合物区分自身的DNA和外援入侵的DNA CRISPR Cas9的作用机制 3 PAM protospaceradjacentmotif 间隔相邻基序 该序列由NGG3个碱基组成 位于DNA结合区域上游并且紧邻结合区域处 CRISPR Cas9的作用机制 3 tracrRNA 反式激活CRISPRRNA 与CRISPR重复序列互补的一段25bp的核酸序列 pre crRNA 整合后的间隔序列首先被转录为CRISPR前体RNA crRNA pre crRNA在RNase 作用下进一步加工形成成熟的CRISPR源性小RNA CRISPR Cas9的作用机制 3 将crRNA与部分tracrRNA融合成一条约100bp的单链向导链 singleguideRNA sgRNA 使其同时具有crRNA和tracrRNA的特性 并且在随后的实验中发现 sgRNA同样可以引导Cas9切割目标DNA 由于靶位点与gRNA特异互补的区域最多只有20nt长度因此 在设计gRNA结合区域时也只能在20bp的长度内 sgRNA CRISPR Cas9的作用机制 3 Cas9核酸酶中存在一种晶体结构 识别瓣叶 REC 核酸酶瓣叶 NUC HNHRuvCPAM区域 5 GG N18 NGG 3 RuvC Cas9氨基末端 剪切crRNA非互补链 HNH Cas9蛋白质中部 剪切crRNA的互补DNA链 识别并结合gRNA和目标DNA的复合体 CRISPR Cas的作用机制 3 将CRISPR Cas系统用于其它非细菌细胞需要满足两个条件 Cas酶 用于切断靶标DNA 比如目的基因中的DNA片段 导向RNA gRNA 的RNA分子 这种分子能通过互补结合靶标 CRISPR Cas9的作用机制 3 CRISPR系统介导的免疫机制的3个阶段 新的间隔序列的获取 CRISPR Cas系统的表达 包括转录和转录后的加工 CRISPR Cas系统对外源基因的干扰 3 易错配的非同源性末端连接 高保真性的同源重组修复 先从同源DNA母链上将相应核苷酸序列片段移至子链缺口处 再用新合成的序列补上母链空缺 CRISPR Cas9对DNA损伤的修复 为了避免DNA或染色体断裂的滞留 强行将两个DNA断端彼此连接在一起的一种特殊的DNA双链断裂修复机制 CRISPR Cas在基因治疗中的应用 4 对于功能缺失型突变引起的基因遗传病 可利用CRISPR Cas9将功能基因片段插入 改正引起疾病的突变体 对于显性基因遗传病 可利用CRISPR Cas9引起NHEJ使显性致病基因切除 对于基因重复复制所引起的疾病 CRISPR Cas9用多个sgRNA同时引起多个DSB切除重复区域 CRISPR Cas9也可直接用于体细胞定向基因编辑 将细胞在体外进行定向编辑 再融入患者体内 定向修饰基因 CRISPR Cas9在HIV 1病毒治疗中的应用 4 HIV 1基因的表达由长末端重复序列 LTR 启动子和增强子活性调控 构建敲除LTR的CRISPR Cas9系统破坏HIV 1基因组中长末端重复序列 LTR 启动子 从而大大地降低了HIV 1在感染细胞内的表达 利用CRISPR鉴定出潜在的HIV治疗靶标 4 利用CRISPR对源自HIV敏感性的CD4阳性T细胞的一种细胞系进行筛选 研究人员描述了如何利用CRISPR筛选HIV感染但不是细胞存活所必需的人基因的方法鉴定出5个基因 当让它们失活时 会让细胞免受HIV感染 同时不会影响细胞存活 除了CD4和CCR5之外 这种筛选方法鉴定出编码两种酶的基因 TPST2和SLC35B2 它们对CCR5进行修饰以便HIV结合 另一个被鉴定出的基因是ALCAM 它参与细胞间粘附 当CD4阳性T细胞接触低水平HIV病毒时 ALCAM缺失与显著地抵抗HIV感染相关联 CRISPR Cas9与iPS技术共同用于基因治疗 4 DNA甲基转移酶3B DNA Methyltransferase3B DNMT3B 基因突变引起免疫缺陷 着丝粒不稳定 面部异常综合征 ICF Cas9载体 定向打靶DNMT3B基因的sgRNA载体诱导性多能干细胞 iPS 细胞成功破坏DNMT3B等位基因的iPS细胞 共转染 CRISPR Cas9移除 细胞中的HAT酶增加胰岛素产生 4 组蛋白乙酰转移酶 HAT 在调节基因TXNIP中发挥着至关重要的作用 在高血糖水平情形下 TXNIP导致 细胞死亡 并且降低胰岛素产生 研究人员对来自2型糖尿病患者和来自健康人的产生胰岛素的胰岛进行比较 结果发现糖尿病 细胞中的HAT基因活性比健康 细胞高出2倍 利用CRISPR Cas9 瑞典隆德大学糖尿病中心的研究人员移除遗传密码中控制来自大鼠的产生胰岛素的细胞中的HAT酶功能的序列 这导致TXNIP基因活性下降 因而降低细胞死亡和增加胰岛素产生 CRISPR Cas脱靶效应及改进方法 5 脱靶效应是由于Cas9蛋白可容忍sgRNA和靶向DNA在5 端的错配 Cas9进入细胞后 有可能在非目标位点进行酶切 从而导致脱靶 降低Cas9和sgRNA在细胞内的表达浓度 减少sgRNA5 端的互补序列 与没有减短的sgRNA打靶活性相同 但大大降低了脱靶位点引起的突变效应 同时提高了sgRNA DNA错配的敏感性 从而降低突变效应 改造Cas9蛋白结构 Cas9突变体Cas9n切口酶切割产生的单链缺口会被高保真性的碱基切除修复途径 base excisionrepair BER 修复 不会在基因DNA上造成突变 通过两个Cas9n产生两个单链DNA断裂 single strandbreak SSB 或在不同DNA链上产生缺口以造成双链DNA断裂的策略 可有效避免脱靶突变 CRISPR Cas脱靶效应及改进方法 5 脱氨基反应 形成去嘧啶位点 AP位点 糖苷水解酶能特异性切除受损核苷酸的N 糖苷键 AP核酸内切酶切开受损核苷酸的糖苷 磷酸键 并移去包括AP位点核苷酸在内的小片段DNA CRISPR Cas的安全隐患 5 借助病毒载体把编码Cas9的DNA带入细胞 在Cas9完成切割任务之后细胞仍会继续生产这种蛋白 机体可能会对其产生免疫反应 基因编辑的细胞会死亡 患者需要进行多次治疗 基因导入和编辑途径都会受病毒载体可携带DNA量的限制 目前必须使用两种不同的病毒载体将CRISPR组件导入到细胞中 这比使用单个载体效率更低 CRISPR Cpf1 5 2015年9月 张锋等又找到了一种新型的CRISPR系统 CRISPR Cpf1 与Cas9相比 Cpf1有以下三大优势 Cpf1剪切DNA只需要一个小RNA分子 Cpf1酶比标准的SpCas9要小 更容易进入组织和细胞 Cpf1剪切后形成两个不同长度的链 粘性末端让DNA插入更可控 Cpf1剪切时离识别位点很远 在编辑位置的选择上有了更多的选项 CRISPR Cpf1 5 CRISPR Cpf1系统能够克服Cas9靶向多个基因位点的限制 研究表明 Cpf1加工自身CRISPRRNA crRNA 的能力可用于简化多重基因组编辑 使用单个定制的CRISPR阵列 array 研究人员实现了在哺乳动物细胞中同时编辑多达4个基因 在小鼠大脑中同时编辑3个基因 基因编辑涉及的伦理问题 5 Cas9蛋白识别的PAM序列 5 AGG 3 在人类基因组中平均每8个碱基就会出现一个 2015年3月 我国中山大学的研究小组利用CRISPR Cas9基因编辑技术对人类胚胎中导致 型地中海贫血症的基因进行修饰 他们针对致病基因设计和生成了3个gRNA 并将其与CRISPR Cas9基因一