免疫分析法

第三章 免疫分析法,一、概述二、抗原三、抗体与免疫反应四、免疫分析方法及应用五、免疫扩散法,主要内容,一、概述二、抗原三、抗体与免疫反应四、免疫分析方法及应用五、免疫扩散法,主要内容,什么叫免疫分析？基于抗原和抗体的特异性反应进行检测的一种技术手段。抗原抗体反应是指抗原与相应的抗体之间发生的特异性结合反应。它既可以发生在体内，也可以发生在体外。高选择性和低检出限。在体内发生的抗原抗体反应为体液免疫应答的效应作用。体外的抗原抗体结合反应主要用于抗原或抗体的检测，用于免疫学诊断。,一、概述,(1) 在实验药物动力学和临床药物学中，测定生物利用度和药物代谢动力学参数等生物药剂学中的重要数据，以便了解药物在体内的吸收、分解、代谢和排泄情况；(2) 在药物的临床检测中，对治疗指数小、超过安全剂量易发生严重不良反应或最佳治疗浓度和毒性反应浓度有交叉的药物血液浓度进行监测；(3) 在药物生产中，从发酵液或细胞培养液中快速测定有效组分的含量，以实现对生产过程的在线监测；(4) 对药品中是否存在特定的微量有害杂质进行评价。,在药物分析中，免疫分析法的应用主要集中在以下几方面：,免疫分析： 利用抗原与抗体的特异性结合作用，来选择性识别和测定，可以作为抗体或抗原的待测物.免疫分析方法,免疫分析检测的发展,放射免疫检测（兴起于20世纪70年代),酶联免疫检测（兴起于20世纪80年代，各临床机构普遍使用）；,以化学发光为代表的光生物学标记及免疫检测技术（20世纪90年代开始推广使用，产品步入成长期）三个阶段。,可逆性,比例性反应阶段性,特异性,免疫分析法的特点,特异性,特异性：抗原与抗体结合反应的专一性分子基础:抗原表位与抗体分子高变区之间空间构型的互补性,可逆性：抗原与相应抗体结合成复合物后，在一定条件下又可解离为游离抗原与抗体，解离后的抗原或抗体均能保持原有的结构和活性。影响因素： 抗体对相应抗原的亲合力亲合力越高，结合越牢固，越不易解离 环境因素对复合物的影响pH、离子强度,比例性：抗原与抗体发生可见反应需遵循一定的量比关系前带(prezone)：抗体过量后带(postzone)：抗原过量等价带(equivalence zone)：抗原抗体比例合适,一、概述二、抗原三、抗体与免疫反应四、免疫分析方法及应用五、免疫扩散法,主要内容,抗原（antigen,Ag)：是一类能刺激机体免疫系统发生免疫应答，并能与相应免疫应答产物（抗体和致敏淋巴细胞)在体内外发生特异性结合的物质抗原的两种特性：免疫原性和抗原特异性免疫原性（immunogenicity)，能刺激机体发生免疫应答，产生抗体和致敏淋巴细胞的能力。抗原特异性能与相应抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合的能力。 凡具有免疫原性和抗原性的物质称为完全抗原 只有抗原特异性而不具有免疫原性的物质称为半抗原 半抗原+蛋白质完全抗原 赋予半抗原以免疫原性的蛋白质称为载体。,定义,1.抗原的免疫原性,抗原物质必须具备的条件： 一、异物性 二、一定的理化性状 三、完整性 四、宿主的遗传性,一、异物性,异物是指化学结构与宿主的自身成分相异或机体的免疫细胞从未与它接触过的物质。异物性的物质包括以下几类： 1、异种物质 如：马血清蛋白、各种微生物及其代谢产物对人体而言都是异种物质，具有强的免疫原性。 2、同种异体物质 如：ABO血型抗原、人类主要组织相容性抗原。 3、自身抗原物质 如：自身组织成分结构改变、隐蔽性自身成分暴露构成自身抗原。,二、一定的理化性状,大分子胶体物质 凡具有免疫原性的物质，分子量都较大，一般在10kDa以上,在一定范围内,分子量越大免疫原性越强。一定的化学组成和结构 从化学组成来看，凡含有芳香族氨基酸（尤其是酪氨酸）的蛋白质，其免疫原性较强。从结构来看，结构越复杂其免疫原性越强。分子构象与易接近性 分子构象是指抗原分子中一些特殊化学基团的三维结构，它决定抗原分子是否能与淋巴细胞表面的抗原受体相互吻合。易接近性是指抗原分子的特殊化学基团与淋巴细胞表面相应的抗原受体相互接触的难易程度。,三、完整性,具有一定理化性状的物质须经非消化道途径进入机体（包括注射、吸入、混入伤口等），并接触淋巴细胞，才能成为良好抗原。如果是口服后可被消化酶水解成胨、氨基酸，破坏了其结构，就丧失了免疫原性。自然界中天然的抗原物质有：蛋白质、多糖、核蛋白,四、宿主遗传性,抗原的免疫原性也与机体的应答能力有关，同种动物不同个体对同一种抗原的免疫应答存在明显的差异，这种差异受遗传因素控制，控制免疫应答的基因称为免疫应答基因（immune response, Ir)。,2.抗原特异性,抗原决定簇（基）载体决定簇和半抗原决定簇共同抗原和交叉反应,一、抗原决定簇,1、概念 抗原决定簇（antigenic determinant, AD)是指抗原中决定抗原特异性的特殊化学基团，又称为表位（epitope)。表位的性质、数目和空间构象决定着抗原的特异性。抗原通过AD与相应淋巴细胞表面的抗原受体结合，激活淋巴细胞，引起免疫应答。2、种类和数量 一个抗原分子可以有一种或多种不同的AD ，一种AD决定着一种特异性，多种AD决定着多种特异性3、部位 位于抗原表面的AD能直接被相应淋巴细胞所识别，称功能性决定簇，存在抗原分子内部的AD无激发免疫应答的功能，称隐蔽决定簇。只有经理化因素处理后，使之暴露可能成为新的功能决定簇。,4、大小 抗原决定簇的大小与相应抗体的抗原结合部位相当。一个蛋白质抗原决定簇含5-7个氨基酸残基一个多糖抗原决定簇含5-7个单糖一个核酸半抗原决定簇含6-8个核苷酸5、抗原结合价（antigenic valence)是指能和抗体分子结合的抗原决定簇的总数。半抗原为一价天然抗原的分子结构复杂，分子表面有多个决定簇为多价,构象决定簇：序列上不相连而依赖于蛋白质或多糖的空间构象形成的决定簇，多暴露于分子表面。顺序决定簇：一段相连的氨基酸序列所形成的决定簇，多位于抗原分子内部。功能性AD：分子表面，易被识别。隐蔽性AD：分子内部。B细胞决定簇：分子表面。T细胞决定簇：分子内部。,二、AD的分类,三、共同抗原和交叉反应,两种来源不同的抗原，除各有其主要的特异性抗原决定簇外，相互之间也存在部分相同的抗原决定簇，这种共有的抗原决定簇称为共同抗原。亲缘关系很近的生物之间存在的共同抗原称为类属抗原。无种属关系的生物之间存在的共同抗原称为异嗜性抗原。一种共同抗原刺激机体产生的抗体，可与其他含有共同抗原的物质发生结合反应，称为交叉反应。,2.2 药物分子的抗原性,1、药物分子的免疫原性 大多数的药物分子通常都是半抗原； 一些蛋白类药物、多肽类药物、激素类药物大部分属于完全抗原。2、药物分子的抗原特异性 药物分子和蛋白质载体结合后，抗原特异性可能会发生改变。,3、药物分析中，为了得到高效价的抗血清，通常会与蛋白质载体合成人工抗原进行试验。常用载体：牛血清白蛋白（BSA）、卵清白蛋白（OA）、破伤风类毒素（TT）、钥孔蛋白（KLH）等。,（1）半抗原和载体结合的化学反应,多肽类激素：活化蛋白质或多肽的游离羧基形成肽键；与蛋白质或多肽的游离氨基缩合形成肽键甾体：甾体激素的羟基和酮基不能直接和载体蛋白形成有效的共价键，需要制备甾体的衍生物，通过含游离羧基的甾体衍生物与载体蛋白相连抗生素：-内酰胺环在偏碱性条件下可以与蛋白质的自由氨基以酰胺键的形式共价结合；氨基糖苷类抗生素用碳化二亚胺为连接剂实现药物和载体蛋白的连接,在选择结合半抗原的化学反应时，应考虑不同的连接方式可能对抗体的专一性产生不同的影响。半抗原没有可以结合的官能团时需要合成适当的衍生物。为得到特定抗原决定簇相对单纯的合成抗原，需要根据半抗原的化学特性及连接产物的化学特性选择连接的半抗原。,（2）半抗原和载体的选择原则,半抗原选择原则：最好含有芳香结构；应考虑抗原抗体反应的微环境；合理利用分子类似物之间的交叉反应。,载体选择原则：应考虑载体对检测系统的影响：选择的载体应和检测体系不发生交叉反应；用于包被合成抗原的载体和用于免疫动物产生抗体的合成抗原的载体蛋白不同。免疫过程中考虑载体效应的影响：抗体的特异性依赖于半抗原分子结构中的免疫决定区，但整个载体蛋白大分子对于抗体反应的性质和量也有影响；应使用相同载体的合成抗原制备半抗原抗体。,（3）合成抗原的测定,定性测定方法： 光谱分析：半抗原和载体蛋白的结合导致蛋白构象的改变，改变程度和半抗原的结合量有关，半抗原结合量越大，构象改变程度越大。 热力学分析：半抗原和载体蛋白结合后热力学特征会有变化，差异可通过差示扫描量热法（DCS）等方法测定。,定量测定方法 相对含量测定法：通过ELISA法比较半抗原与载体蛋白的相对结合量。绝对含量测定法：半抗原具有与载体蛋白完全不同的广谱吸收特征，且半抗原在此特定波长下具有较强的吸收；或能利用特定的化学反应定量测定半抗原的量，且不与载体蛋白发生反应。,一、概述二、抗原三、抗体与免疫反应四、免疫分析方法及应用五、免疫扩散法,主要内容,免疫分析实际上是一种特殊的试剂分析，特点是抗体/抗原成为分析试剂。,1、抗体的结构与功能,抗体泛指机体经抗原刺激由免疫活性细胞产生的一组免疫球蛋白，通常由两条相同的重链和两条相同的轻链组成常用的是IgG分子，其在血清免疫球蛋白中的含量约70%,1. 抗体（antibody, Ab）功能性概念 是由抗原刺激而产生并能与刺激其产生的抗原发生特异性结合的、具有免疫功能的球蛋白。抗体主要存在血清中，也存在于呼吸道粘膜液、小肠粘膜液、唾液以及乳汁等其它体液中。 2. 免疫球蛋白（immunoglobulin, Ig）结构性概念 具有抗体活性或化学结构与抗体分子相似的球蛋白。所有抗体都是免疫球蛋白，但是并非所有免疫球蛋白都是抗体。,免疫球蛋白的基本结构,IgG分子基本结构是由四个肽链组成的，二条较小的轻链和二条较大的重链，轻链与重链是由二硫键连接形成，分为氨基端（N端），羧基端（C端）。,一、多克隆抗体（polyclonal antibody） 1. 定义：抗原分子通常具有多个抗原决定簇，动物免疫后可刺激多种具有相应抗原受体的B细胞发生免疫应答，因而可产生多种针对不同抗原决定簇的抗体。这些由不同B细胞克隆产生的抗体称为多克隆抗体（polycolonal antibody, PcAb）。 2. 实际意义 （1）预防、治疗感染性疾病（特异性差，可发生超 敏反应） （2）临床诊断,二、单克隆抗体（monoclonal antibody, McAb） 1. 定义：由单一克隆B细胞杂交瘤产生的、只识别 抗原分子某一特定抗原决定簇的、具有高度特异性的 抗体。每种单克隆抗体其类、亚类、型及亲和力完全 相同，具有高度均一性。 2. 特点 具有高度均一性。 3. 杂交瘤细胞 骨髓瘤细胞无限增殖； 免疫B细胞合成、分泌特异性抗体。 4. 杂交瘤技术 HAT培养基：次黄嘌(H)、氨基蝶呤(A)和胸腺 嘧啶核苷(T)。,三、基因工程抗体 基因工程抗体是通过PCR技术获得抗体基因或抗体基因片段，与适当载体重组后引入不同表达系统所产生的抗体，被广泛应用于疾病的临床诊断、预防和治疗及基础理论研究等领域。 人-鼠嵌合抗体（chimeric antibody）； 人改型抗体（reshaped humanized antibody）； 小分子抗体； 双特异性抗体（bispecific antibody）等。,、,2抗体作为分析试剂的评价,抗体的特异性是无与伦比的，不需或只需要简单的预处理。有较高的稳定性。这两点奠定了分析免疫高度灵敏和高度专一的基础。此外，抗体还有一个独特的性质：每个抗体分子有两个抗原的结合点，即多价性。然而抗体缺乏高灵敏试剂应具备的分析信号反差。,3、抗体的制备,（1）常规抗血清（多克隆抗体）：指人工被动免疫后制成的多克隆抗体，是免疫分析中的重要工具。免疫原的制备、动物免疫、放血、抗血清分离及抗血清的分析鉴定。,免疫原的制备,免疫原由质量好的抗原与佐剂制成。通常有免疫原水剂、福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂。水剂由无菌生理盐水将抗原制成一定浓度的免疫原。弗氏佐剂是由一定量的羊毛脂和石蜡油，以及一定浓度的分支杆菌混合而成，经研磨达到油包水的程度。不完全福氏佐剂即不含有分支杆菌。,动物免疫,通常的免疫动物为家兔和羊。免疫的部位多采用脚掌、腹股沟淋巴结、大腿肌肉、皮下多点、静脉。免疫抗原量通常为110mg或50100mg。,试血及效价测定,家兔的试血通常可由耳缘静脉取血，取血量0.5ml。不同稀释度的抗血清和1%的血细胞悬液按1:1混合，37保温2h后观测血细胞的凝聚情况，即可测得免疫血清的效价。,（2）单克隆抗体,单克隆抗体是建立在经细胞融合而获得的杂交瘤细胞基础上的。所获得的抗体具有均一的特异性。高度均质性的特异性抗体，由一个识别单一抗原表位的B细胞克隆所分泌。一般来自杂交瘤细胞细胞培养法 & 接种动物体内生产法,2、抗体的纯化,利用化学方法提纯或浓缩某一类的免疫球蛋白。利用免疫吸附剂和亲和色谱得到免疫学上专一性的抗体。,2017/11/2,49,沉淀分离,通过改变溶液的条件或添加某种物质，降低溶液中某一成分的溶解度，使其从溶液中沉淀析出，与其它成分分离的技术。是纯化生物大分子物质常用的经典方法包括盐析沉淀法、有机溶剂沉淀法和非离子聚合物沉淀法等。,2017/11/2,50,（一）盐析法,在物质的水溶液中添加一定浓度的中性盐，使物质的溶解度减小而沉淀析出，这一过程称为“盐析”。优点：成本低，不需要昂贵的设备；操作简便，安全；对许多生物活性物质具有稳定作用；对pH、温度要求不严格。缺点：分离效果有限,2017/11/2,51,盐析的基本原理,蛋白质在水溶液中的溶解度是由蛋白质亲水基团、与水形成水化膜的程度、以及所带有电荷的情况决定的。当中性盐加入蛋白质溶液中，盐离子对水分子的亲和力大于蛋白质，于是减弱甚至消除蛋白质分子周围的水化膜。同时，盐离子所带的电荷中和部分蛋白质分子表面电荷，更加导致其溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。,2017/11/2,52,盐类和浓度的选择,常用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸钠等硫酸铵最为常用，其优点是：溶解度大；温度系数小；密度小，有利于析出蛋白的离心分离；蛋白沉淀物在2 mol/L3 mol/L硫酸铵溶液中稳定，低温下可保存一年；价廉易得；分离效果比其它盐好。但硫酸铵缓冲能力比较弱，pH难控制；铵离子干扰蛋白质的测定，所以有时也用其它中性盐进行盐析。高浓度盐析法是粗纯样品的常用方法。,2017/11/2,53,脱盐,蛋白质用盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中的盐除去，常用的方法有：透析法超滤法葡聚糖凝胶G50层析法。,2017/11/2,54,（二）有机溶剂沉淀法,利用待分离物质与杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量的某种有机溶剂，使某一溶质沉淀析出，从而与其它成分分离的方法。,有机溶剂破坏溶质分子周围的水化层；有机溶剂降低溶液的介电常数，使蛋白质的溶解度降低。,2017/11/2,55,优点：分辨率比盐析法高，即一种溶质发生沉淀的有机溶剂浓度范围比较窄；溶剂容易除去，并可以回收；沉淀无需脱盐，易于离心或过滤分离。缺点：有机溶剂可使某些生物大分子变性失活，操作常需在低温下进行；有机溶剂具有一定毒性。,2017/11/2,56,有机溶剂的选择,选择有机溶剂的原则：有机溶剂的水溶性好；沉淀效率高；毒性小，避免损害工作人员的健康和污染环境；不与溶质分子发生化学反应，价格便宜。使用较多的是乙醇、丙酮、甲醇等。,2017/11/2,57,残留的有机溶剂去除的方法： 自然蒸发或负压蒸发，可在室温进行； 凝胶过滤除去。,（三）离子交换层析法,离子交换层系（ion exchange chromatography， IEC）是利用离子交换剂上可交换离子与组分中的离子发生可逆交换时结合力的差别，而进行分离的一种技术。广泛应用于很多生命物质的分析、制备和纯化等。,优点： 重现性好，简单易行； 分辨力强，回收率高； 具有多孔性，表面积大、交换容量大； 具有亲水性，对大分子的吸附不牢固，层析条件温和，不致引起物质变性或失活。,2017/11/2,59,离子交换法的固定相是离子交换剂；若担体带有正电荷，可吸附着负电荷分子，则为阴离子交换法；不带净电荷的分子，以及阳离子则直接流出，不会被吸附上去。这些被固相单体所吸附的离子，统称为 counter ion，因为其电荷与担体上的电荷相反 (counter 是 相反 的意思),离子交换剂为人工合成的惰性高分子聚合物，其上带有许多可电离基团，根据这些基团所带电荷的不同，可分为阴离子交换剂和阳离子交换剂。它可分三部分：高分子聚合物基质、电荷基团和平衡离子。,基本原理,2017/11/2,60,阳离子交换反应：R-A- H+ + Y+ R-A- X+ + H+ 阴离子交换反应：R-B+ OH- + X- R-B+ X- + OH- R代表离子交换剂的高分子聚合物基质，A- 和B+分别代表阳离子交换剂和阴离子交换剂中与高分子聚合物共价结合的电荷基团，H+ 和OH-分别代表阳离子交换剂和阴离子交换剂的平衡离子，Y+ 和X-分别代表溶液中的离子基团。,2017/11/2,61,2017/11/2,62,两性离子如蛋白质、酶类和核苷酸等物质与离子交换剂的结合力，主要取决于它们的理化性质和在特定pH条件下呈现的离子状态。大多数蛋白在生理pH（pH68）下带负电荷，需用阴离子交换柱纯化，极端的pH下蛋白会变性失活，应尽量避免。 洗脱可采用改变溶液的pH或离子强度，也可同时改变pH与离子强度的方法。改变pH可能对蛋白的稳定性有较大的影响，一般采用改变离子强度的梯度洗脱。用盐浓度梯度去洗脱离子交换柱，利用泵的辅助可以使流入柱的缓冲液中盐浓度平稳地上升，当离子强度能够中和蛋白的电荷时，蛋白就被从柱上洗脱下来。,2017/11/2,63,在阴离子交换柱上血浆蛋白组分的分段洗脱,2017/11/2,64,三、技术要点,（一）离子交换剂的选择和处理两性离子如蛋白质、酶类和核苷酸等物质与离子交换剂的结合力，主要取决于它们的理化性质和在特定pH条件下呈现的离子状态。大多数蛋白在生理pH（pH68）下带负电荷，需用阴离子交换柱纯化，极端的pH下蛋白会变性失活，应尽量避免。处理的目的：使交换剂充分溶胀，使其颗粒的孔隙增大，让具有交换活性的电荷基团充分暴露出来，再用酸碱浸泡，除去杂质并使其带上需要的反离子。 （二）装柱和加样选择平衡缓冲液的离子强度和pH时，首先要保证待分离物质的稳定；其次是使离子交换剂与待分离物质有适当的结合，而不与样品中杂质结合，以达到分离的目的。溶液的离子强度常用不影响蛋白质吸附到交换剂上的最高离子强度液，常用的离子强度为20 mmol/L 50 mmol/L NaCl。（三）洗脱和收集洗脱可采用改变溶液的pH或离子强度，也可同时改变pH与离子强度的方法。改变pH可能对蛋白的稳定性有较大的影响，一般采用改变离子强度的梯度洗脱。用一定盐浓度梯度去洗脱离子交换柱，利用泵的辅助可以使流入柱的缓冲液中盐浓度平稳地上升，当离子强度能够中和蛋白的电荷时，蛋白就被从柱上洗脱下来。（四）离子交换剂的再生与保存使其带上所需的平衡离子。,2017/11/2,65,（四）亲和层析法,亲和层析是利用某些生物分子之间专一可逆结合特性的一种高度专一的吸附层析类型。配体是发生亲和反应的功能部位，也是载体和被亲和分子之间的桥梁。配体本身必须有两个基团： 一个能与载体共价结合，连接后的配体对互补分子的亲和力不会改变 一个能与被亲和分子结合。,2017/11/2,66,亲和层析法有点像在钓鱼，鱼是我们所要的分子 (B) 杂夹在一堆蛋白质当中，鱼饵是与 B 具有专一性的分子 (A, 上图 1)；A 与 B 的专一性很高，只会在样本中与 B 结合，而排除其它杂质 (上图 2)；若把结合在吸着剂上的 B 溶离下来，就可以得到均质的 B (上图 3)。,2017/11/2,67,亲和层析中部分蛋白配体,3、特异性抗体的筛选与效价测定,抗体的效价又称滴度，指某一物质与一定容量的另一物质产生反应所需要的量。免疫分析中，免疫血清中抗体的效价指将血清稀释，测定与一定的抗原能发生反应的最大稀释度，此最大稀释度即为血清的效价。常用的效价测定方法有免疫扩散法、间接血凝法和ELISA法等。特异性抗体的筛选，制备出含不同的抗原决定簇的特异性抗原，然后根据抗体和这些抗原相互作用的强弱进行分析。,一、概述二、抗原三、抗体与免疫反应四、免疫分析方法及应用,主要内容,四、免疫分析方法及其应用,放射免疫分析法（RIA）荧光免疫分析法（FIA）克隆酶给予体免疫分析法（CEDIA）酶联免疫吸附分析法（ELISA）,核医学,治疗：肿瘤、甲亢等诊断 体内PET、SPECT、 放射免疫成像等 体外放射免疫分析（RIA）,标记免疫分析技术,用标记示踪技术观察抗原抗体一级反应的分析方法,是体外放射分析技术中建立最早、应用最广的一类竞争性体外放射分析技术.特点：敏感性高，反应时间短，可用仪器检测结果三大标记免疫分析技术：放射免疫、荧光免疫、酶免疫 检测方法 检测范围生化、常规免疫 mgg（10-3 10-6 g）荧光免疫、酶免疫 gng（10-6 10-9 g）放射免疫、发光免疫 ngpg（10-9 10-12 g）PCR pgfg（10-12 10-15 g）,一、放射免疫分析技术（Radioimmunoassay，RIA）,女科学家 R.Yalow（美,1921）1950末发明（胰岛素），1977年获诺贝尔医学奖1. 基本原理（1）竞争结合分析：Ag + Ab AgAb *Ag + Ab *AgAb（2）IRMA（免疫放射分析）：2. 常用标记核素：（1）125I： 射线，半衰期 60 天（2）3H： 射线，半衰期 12.3 年3. 测量仪器（1） 计数仪（2） 液闪仪,基本原理,Ab限量，Ag*定量,Ag*和Ag的量大于Ab结合位点，二者通过竞争方式与Ab结合；随着Ag增加，Ag*与Ab结合形成Ag*Ab复合物的放射量降低,二者变化成函数关系。,具体步骤,抗原抗体反应,结合的和游离的放射性物质的分离,放射性活度的测定,柱色谱法吸附法沉淀法抗抗体发微孔滤膜法固相法,求出结合率，绘制标准曲线（剂量反应曲线）,以未结合的Ag*为F，Ag*Ab复合物为B，则B/F或B/(BF)与Ag的量变存在着函数关系剂量反应曲线,注：T即是B与F的总和,基本原理 它采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。 测定的对象可以是抗体也可以是抗原。在这种测定方法中有3种必要的试剂： 固相的抗原或抗体（免疫吸附剂） 酶标记的抗原或抗体（标记物） 酶作用的底物（显色剂）,二、酶联免疫吸附分析法（ELISA）,测量时，抗原（抗体）先结合在固相载体上，但仍保留其免疫活性，然后加一种抗体（抗原）与酶结合成的偶联物（标记物），此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性，当偶联物与固相载体上的抗原（抗体）反应结合后，,再加上酶的相应底物，即起催化水解或氧化还原反应而呈颜色。,ELISA原理,酶及其底物 酶结合物（过碘酸盐氧化法、戊二醛交联法）是酶与抗体或抗原在交联剂作用下联结的产物。是ELISA成败的关键试剂，它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应，还具有酶促反应，显示出生物放大作用，但不同的酶选用不同的底物 ，将得到不同的颜色反应。,ELISA原理,ELISA的种类和变化,（一）双抗体夹心法（二）间接法（三）竞争法 （四）双位点一步法（五）捕获法测IgM抗体（六）应用亲和素和生物素的ELISA,（一）双抗体夹心法,此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原,获得待分析物的未标定抗体,将特异性抗体与固相载体连接形成固相抗体,洗涤除去未结合的抗体及杂质,加入封闭蛋白溶液以封闭载体表面残留的蛋白结合位点,洗涤并除去未结合的封闭蛋白,加受检标本（抗原）形成固相抗体抗原复合物,洗涤除去其他未结合的物质,加酶标抗体生成抗体待测抗原酶标记抗体的复合物,彻底洗涤未结合的 酶标抗体,加底物进行酶催化反应,根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量测定,间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法。,（二）间接法,包被固相载体: 用已知抗原包被固相载体,加待检标本: 使相应抗体与固相抗原结合洗涤，除去无关的物质,加酶标抗抗体:与固相载体上抗原抗体复合物结合；洗涤，除去未结合的酶标抗抗体,加底物显色,根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量测定,ELISA法间接法测定抗体1.原理,（三）竞争法,对照管由于只加酶标抗原，与固相抗体充分结合，故分解底物显色深；测定管的显色程度则随待测抗原和酶标抗原与固相抗体竞争结合的结果而异。如待测抗原量多，竞争性地抑制酶标抗原与固相抗体结合，使固相上结合的酶标抗原量减少。因此，加入底物后显色反应较弱。,用已知特异性抗体包被固相载体,测定管加待测抗原和一定量的酶标抗原使二者与固相抗体竞争结合,对照管只加一定量酶标抗原与固相抗体直接结合,分别洗涤除去未结合的成分,加底物显色,分别测定两管的吸光度值，根据对照管与测定管吸光度值之比， 计算标本中待测抗原含量,ELISA特点一：灵敏性 该测定法的灵敏度来自作为报告基团的酶。酶是一种有机催化剂，很少量的酶即可诱导大量的催化反应 ，产生可供观察的显色反应现象。因此该体系常被称为酶放大体系。ELISA实现了在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体的所在部位，或在微克、甚至纳克水平上对其进行定量。 例如，在测定血清中某一物质的含量时，化学比色法的敏感度为mg/ml水平，酶反应测定法的敏感度约为5-10g/ml 。,特点二：特异性 其特异性来自抗体或抗原的选择性。抗原抗体的结合实质上只发生在抗原的抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间。由于两者在化学结构和空间构型上呈互补关系，所以抗原抗体反应具有高度的特异性。,ELISA要有三个必要的试剂，即免疫吸附剂、结合物和酶的底物。完整的ELISA试剂盒应包含以下各组分：（1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂，俗称酶标板）；（2）酶标记的抗原或抗体（酶标记物）；（3）酶的底物；（4）系列参考标准品（定量测定）；（5）酶标记物及样本的稀释液；（6）洗涤液；（7）反应终止液。,二、ELISA试剂,ELISA试剂盒,ELISA试剂的作用,2.1 免疫吸附剂： 已包被抗原或抗体的固相载体，是ELISA方法中的核心试剂。固相载体： 固相载体在ELISA测定过程中作为吸附剂和容器，不参与化学反应。可作ELISA中载体的材料很多，最常用的是聚苯乙烯。专用于EILSA的产品称为ELISA板，国际上标准的微量滴定板为812的96孔式。 良好的ELISA板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间、同一板各孔之间性能相近。,包被,将抗原或抗体固定化的过程称为包被(coating)。换言之，包被即是抗原或抗体结合到固相载体表面的过程。抗体或蛋白质等抗原是通过物理吸附与聚苯乙烯等固相载体结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的相互作用。这种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响。载体对不同蛋白质的吸附能力是不相同的，大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团，故更易吸附到固相载体表面。,封闭,封闭(blocking)是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被固相载体表面剩余吸附位点的过程。蛋白质抗原或抗体包被时所用的一般浓度较低，吸收后固相载体表面尚有未被占据的吸附位点，封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些吸附位点，从而排斥在ELISA其后的步骤中干扰物质的再吸附，增加ELISA反应得专一性和灵敏度。封闭的程序与包被过程相类似。最常用的封闭剂是0.05%-0.5%的牛血清白蛋白。研究表明，脱脂奶粉也是一种良好的封闭剂，其最大的特点是价廉，可以高浓度使用（5%）。高质量的速溶食用低脂奶粉即可直接当作封闭剂使用，但由于奶粉的成份复杂，而且封闭后的载体不易长期保存，因此在试剂盒的制备中较少应用。,2.2 酶标记物即酶标记的抗原或抗体，是ELISA中最关键的试剂。良好的酶标记物应该是既保有酶的催化活性，也保持了抗体（或抗原）的免疫活性。酶标记物中酶与抗体（或抗原）之间有恰当的分子比例，在酶标记物中应尽量不含有或少含有游离的（未结合的）酶或游离的抗体（或抗原）。此外酶标记物还要有良好的稳定性。在ELISA中，常用的酶为辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)和碱性磷酸酶(alkaline phosohatase, AP)。,2.3 酶的底物2.3.1、HRP的底物HRP催化过氧化物的氧化反应，最具代表性的过氧化物为H2O2，其反应式如下：DH2+ H2O2 D+ H2O 上式中，DH2为供氢体，H2O2为受氢体。在ELISA中，DH2一般为无色化合物，经酶作用后成为有色的产物，以便作比色测定。常用的供氢体有邻苯二胺(O-phenylenediamine, OPD)、四甲基联苯胺(3,3,5,5-tetramethylbenzidine,TMB),2.3.1 HRP的底物,OPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，在492nm处有最高吸收峰，灵敏度高，比色方便，是HRP结合物最常用的底物。OPD见光易变质，与过氧化氢混合成底物应用液后更不稳定，须现配置现用。TMB经HRP作用后产物显蓝色，酶反应用HCl或H2SO4终止后，TMB产物由蓝色呈黄色，可在比色计中定量，最适吸收波长为405nm。TMB性质较稳定，可配成溶液试剂，只需与H2O2溶液混和即成应用液，可直接作底物使用。另外，TMB又有无致癌性等优点，因此在ELISA中应用日趋广泛。,2.4.2 AP的底物AP为磷酸酯酶，一般采用对硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate,p-NPP)作为底物，可制成片剂，使用方便。产物为黄色的对硝基酚，在405nm波长处有吸收峰。用NaOH终止酶反应后，黄色可稳定一时间。,2.5 洗涤液涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓冲液。聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是疏水性的，非离子型洗涤剂既含疏水基团，也含亲水基团，其疏水基团与蛋白质的疏水基团借疏水键结合，从而削弱蛋白质与固相载体的结合，并借助于亲水基团和水分子的结合作用，使蛋白质回复到水溶液状态，从而脱离固相载体。洗涤液中的非离子型洗涤剂一般是吐温20，其浓度可在0.05%-0.2%之间，高于0.2%时，可使包被在固相上的抗原或抗体解吸附而减低试验的灵敏度。,2.6 对照品阴性对照品须先行检测，确定其中不含待测物质。例如HBsAg检测的阴性对照品中不可含HBsAg。阳性对照品多以含蛋白保护剂的缓冲液为基质，其中加入一定量的待检物质，此量最好在试剂说明书中标明。加入的量应与试剂的敏感度相称。国外检测HBsAg的ELISA试剂盒检测敏感度约为0.5 ng/ml，阳性对照品中含量约为10 ng/ml。在对照品中一般加入抗生素和防腐剂，以利保存。2.7 标准品定量测定的ELISA试剂盒应含有制作标准曲线用的标准品，应包括覆盖可检测范围的4-5个浓度，一般均配入含蛋白保护剂及防腐剂的缓冲液中。,1、样品的采集与保存2、试剂的准备3、包被4、加样在ELISA实验中一般有5次加样步聚，即加标准品、加样本、加酶标记物、加底物、加反应终止液。,三、ELISA实验过程,4、保温在ELISA中一般加标本和加酶标记物后会有一次抗原抗体反应。抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和时间，这一保温过程称为温育(incubation)。 ELISA属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固