微生物耐药机制

临床微生物学概论(二) 细菌的耐药机制及其临床意义,胡付品复旦大学附属华山医院抗生素研究所,抗菌药物对细菌的作用机制细菌对抗菌药物的耐药机制细菌耐药性的遗传学基础主要细菌的耐药性变迁及其防治,本课内容,（一）抗菌药物的作用机制,阻碍细菌细胞壁合成：导致细菌在低渗透压环境下膨胀破裂死亡，使细菌不能生长繁殖。内酰胺类、糖肽类与细菌细胞膜相互作用：增强细菌细胞膜的通透性、打开膜上的离子通道，破坏其屏障作用，让细菌内部的有用物质漏出菌体或电解质平衡失调而死。多黏菌素与细菌核糖体或其反应底物（如tRNA、mRNA）相互所用：抑制蛋白质的合成，使细菌无法合成存活所必需的结构蛋白和酶。大环内酯类、氨基糖苷类阻碍细菌DNA的复制和转录：阻碍DNA复制将导致细菌细胞分裂繁殖受阻，阻碍DNA转录成mRNA则导致后续的mRNA翻译合成蛋白的过程受阻。喹诺酮类抑制细菌叶酸代谢等。磺胺类,DNA引导的RNA多聚酶,链霉素庆大霉素、妥布霉素（氨基糖苷类）阿米卡星蛋白合成（tRNA）莫匹罗星,DNA,RNA,核糖体,THFA,DHFA,PABA,DNA旋转酶（解旋、螺旋）,喹诺酮类,利福平,蛋白合成（50S抑制剂）,红霉素氯霉素克林霉素,蛋白合成（30S抑制剂）,细胞膜多粘菌素,氯霉素乙酰转移酶,细胞壁合成环丝氨酸万古霉素、替考拉宁杆菌肽青霉素类头孢菌素类拉氧头孢碳青霉烯类,叶酸代谢,甲氧苄啶,磺胺类药,周质空间,-内酰胺酶氨基糖苷类钝化酶,四环素大观霉素,细菌模式图-抗菌药物作用机制,（二）细菌主要的耐药机制,灭活酶与钝化酶的产生抗生素渗透屏障作用靶位结构改变,细菌代谢状态或营养缺陷细菌菌膜形成,X,外排,灭活,渗透障碍,靶位改变,细菌耐药的主要机制,灭活酶产生,抗生素靶位点改变,孔蛋白改变，细胞壁/膜通透性改变,喹诺酮类药物耐药基因,-内酰胺类药物耐药基因,多种抗菌药物耐药,主动外排,抗菌药物,D2孔蛋白缺失,MexA-MexB-OprM,碳青霉烯酶,Abs失活,胞内,周间隙,铜绿假单胞菌对碳青霉烯类的耐药机制,抗生素渗透屏障作用与外排泵,靶位结构改变,药物,细菌靶位,万古霉素敏感肠球菌,万古霉素耐药肠球菌,细菌利用酶系统，把对氨基苯甲酸合成叶酸，维持自身生长需要。磺胺类药物与氨基苯甲酸化学结构相似，当磺胺类药物浓度较高时，可深入细菌体内竞争二氢叶酸合成酶，生成异常的核酸拟似物，使细菌不能生成菌体所必需核酸而死亡。对磺胺类药物产生耐药性的细菌，可通过调整代谢环节，产生大量的对氨基苯甲酸(20-100倍)，抵消磺胺药对酶的竞争，从而使药物失去抑菌作用。,细菌代谢状态改变营养缺陷等,竞争力极强,内酰胺环,Penicillinase,灭活酶与钝化酶的产生,细菌菌膜形成,耐药机制,1.灭活酶和钝化酶的产生-内酰胺酶氨基糖苷类钝化酶氯霉素酰基转移酶MLS类抗生素钝化酶（Macrolide-Licosamide Streptogramin）,-内酰胺酶的分类,ESBL,-内酰胺酶,(质粒),(染色体),(质粒),(染色体或质粒),Amp C,ML,OXA,丝氨酸酶,金属酶,A类酶,C类酶,D类酶,B类酶,Extended-spectrum -lactamase,metallo -lactamase,底物谱青霉素酶：青霉素类头孢菌素酶广谱酶：包括上述抗菌药，第一和第二头孢菌素超广谱酶：包括上述抗菌药、第三和第四代头孢菌素AmpC酶：包括上述抗菌药、头霉素类碳青霉烯酶：包括上述抗菌药、碳青霉烯类丝氨酸碳青霉烯酶金属碳青霉烯酶遗传学基础质粒酶、染色体酶可诱导性体质酶（固有的）、诱导酶,重要-内酰胺酶及其底物谱,ESBLs的分类目前已超过200种,Data from Lahey Clinic/Studies/,我国已报道的TEM 型和SHV型ESBLs,CTX-M型ESBL全球流行图,质粒介导的头孢菌素酶,ACT-1,DHA-1,CMY (北京),DHA-1,CIT,ACT-1 (上海),DHA-1(浙江),DHA-1,ACT-1 (广州),我国已报道的KPC型碳青酶烯酶,已经发现的KPC型碳青霉烯酶（20种）Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC),VIM-2,VIM-3,VIM-6,VIM-7,VIM-1,VIM-4,VIM-5,VIM-9,VIM-10,VIM-8,P. aeruginosaUSA,P. aeruginosaAcinetobacter spp.EnterobacteriaceaeEUROPEFAR EASTSOUTH AMERICA,P. aeruginosaTAIWAN,P. aeruginosaEnterobacteriaceaeGREECE, ITALYSWEDEN, POLAND,EnterobacteriaceaeP. aeruginosaTURKEY,P. putidaSINGAPORE,P. aeruginosaSOUTH AMERICA,P. aeruginosaUK,Acquired Metallo-b-Lactamases: VIM-Type Enzymes,VIM-11b,P. aeruginosa Argentina,VIM-13,VIM-12,EnterobacteriaceaeGreece,P. aeruginosa Spain,目前为止发现41种VIM型金属酶,OXA型碳青霉烯酶,Paterson 2008; Higgins 2009 and 2013; Kim 2010,苏格兰 (1985),西班牙(1997),法国 (2003),阿根廷 (1994),OXA-235美国,墨西哥(2005),56%,55%,目前为止发现418种OXA型碳青霉烯酶,氨基糖苷钝化酶,氨基糖苷钝化酶可对氨基糖苷分子的活性基团进行修饰而使之失去抗菌活性不同的氨基糖苷钝化酶可钝化同一种氨基糖苷类；而同一种氨基糖苷钝化酶又可钝化不同的氨基糖苷类,氨基糖苷类钝化酶,乙酰转移酶(Aminoglycoside acetyltransferases, AAC ) AAC（2） AAC（6） AAC（3）核苷转移酶(Aminoglycoside nucleotidyltransferases, ANT 或ADD ANT（4） ANT（3） ANT（2） ANT（6）磷酸转移酶(Aminoglycoside photransferases, AHP ) APH（3 ） APH（3”） APH（5”）革兰阳性菌 （双重功能酶） AAC（6）+APH（2）,耐药机制,抗生素渗透障碍：细胞壁障碍或细胞膜通透性的改变，抗生素无法进入细胞内达到作用靶位而发挥作用。细胞壁：类脂双层，脂多糖（LPS），阻碍疏水性抗菌药物进入菌体。细胞外膜孔蛋白(Outer membrane porin channels)：OmpF，OmpA，OmpC孔蛋白丢失或减少，阻碍亲水性抗菌药物进入菌体。细胞内膜多药外排泵(Active efflux)：产生新的能量依赖性转运系统。MexA-MexB-OprM。,碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌的外膜孔蛋白,泳道1和6为敏感菌株,耐药机制,靶位结构改变(Alteration of target)靶位酶：二氢叶酸合成酶靶位生理功能：细菌形态和活力靶位结构：氟喹酮类 DNA旋转酶 举例： MRSA: 含mecA基因，编码PBP2a PBP：Penicillin Binding Protein,耐药机制,4.其他细菌代谢状态的改变：对氨基苯甲酸产量（PABA）营养缺陷、L型细菌（无细胞壁）、芽胞细菌菌膜的形成抗菌药物不能透过整个菌膜菌膜对抗菌药物的敏感性降低菌膜内的细菌具有独特的生物学特征,细菌的特殊状态,芽胞（Spore）某些细菌在一定环境条件下，在菌体内形成一个圆形或卵圆形小体。是细菌的休眠方式。多数芽胞形成是在营养缺乏时抵抗力强，对热、干燥、消毒剂等有强大的抵抗力。一般方法不易将其杀死，可耐100沸水煮沸数小时。最可靠的方法是高压蒸汽灭菌。以芽胞是否被杀死作为判断灭菌效果的指标。 如炭疽芽胞杆菌破伤风梭菌,（三）细菌耐药性的遗传学基础,染色体介导耐药质粒介导的耐药,耐药菌的出现及流行选择性压力,抗菌药物均具有选择耐药细菌的能力，其广泛使用可导致选择性压力增加。,耐药菌株的出现,新的耐药细菌,突变,XX,敏感细菌,耐药细菌,耐药基因转移,1.染色体介导的耐药性,耐药基因位于染色体，随细菌分裂传至后代发生频率低：10-510-9通常只对1、2种类似药物耐药产生或消失和药物存在无关耐药菌生长分裂变慢，竞争力变弱居次要地位,2.质粒介导的耐药性,染色体外的DNA耐药质粒：接合型和非接合型质粒转移方式： 接合型： 接合转移非接合型：转化，转导等方式 发生频率：10-210-8临床意义：可造成耐药菌的爆发流行。居主要地位,接合（Conjugation）,方式：通过耐药菌性菌毛和敏感菌菌体直接沟通，由耐药菌将耐药质粒边复制边转移给敏感菌。细菌：革兰阴性菌，特别是肠道细菌。种间，属间，牲畜与人。,接合（Conjugation）,F+ Conjugation,Hfr Conjugation,R- Plasmid Conjugation,耐药基因的传播,三.主要细菌的耐药性变迁及其防治,细菌耐药性的现状和变迁耐药性的防治,细菌与抗菌药物的斗争历程,抗菌药物,细菌,病原菌的变迁,医院中革兰阳性菌增多一些少见病原菌增多不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、洋葱伯克霍尔德菌等真菌增多念珠菌、曲霉、组织胞浆菌等出现新的病原菌和耐药菌CA-MRSA、肺孢菌、艰难梭菌(毒力增强)CA-ESBL、CA-KPC,革兰阳性菌的变迁主要表现为,金葡菌(尤其是MRSA)耐药株感染的发生率增多凝固酶阴性葡萄球菌(CNS)感染增多青霉素不敏感肺炎链球菌（PISP、PRSP）的出现和增多万古霉素耐药肠球菌（VRE）的出现和增多耐青霉素和耐头孢菌素类草绿色链球菌的出现和增多,57,细菌耐药性变迁革兰阳性菌,金葡菌 MRSAVISA、hVISA VRSA CA-MRSA青霉素不敏感肺炎链球菌 PISP PRSP耐万古肠球菌 VRE,临床重要的耐药细菌,甲氧西林耐药葡萄球菌,MRSA：甲氧西林耐药金葡菌Methicillin resistant Staphylococcus aureus含mecA 基因，编码PBP2aMSSA:甲氧西林敏感金葡菌Methicillin susceptible Staphylococcus aureus不含mecA 基因，没有PBP2aMRCNS:甲氧西林耐药凝固酶阴性葡萄球菌Methicillin - resistant coagulase negative StaphylococcusMSCNS:甲氧西林敏感凝固酶阴性葡萄球菌Methicillin - susceptible coagulase negative Staphylococcus,甲氧西林耐药葡萄球菌,HA-MRSA:healthcare associated MRSA 医院感染获得性MRSA耐药性强、毒力弱CA-MRSA：社区感染获得性MRSAcommunity-Associated MRSA耐药性弱、毒力强,60,超级细菌（ Superbugs ） PDR,MRSA、VRE、 VISA 、VRSA碳青霉烯耐药铜绿假单胞菌碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌碳青霉烯耐药其它肠杆菌科细菌,（是指对其有效治疗药物几乎均耐药的细菌）,主要超级细菌菌种：,上海地区甲氧西林耐药葡萄球菌的检出率,万古霉素不敏感金黄色葡萄球菌,VISA：万古霉素低度耐药MRSAvancomycin-intermediate Staphylococcus aureus hVISA：异质性万古霉素低度耐药MRSA heterogeneous Vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus VISAVRSA：万古霉素耐药MRSA Vancomycin-resistant Staphylococcus aureus,历年美国报道的12例VRSA,除3号病案外，所有11株VRSA均为伤口标本分离物，且11例VRSA感染患者均被诊断为外科疾患*具有复杂的基础疾病，提示自身免疫能力低下,肺炎链球菌的耐药性,青霉素敏感肺炎链球菌：PSSPPenicillin-susceptible S.pneumoniae青霉素MIC 0.06ug/ml 青霉素中介肺炎链球菌：PISPPenicillin-intermediate S. pneumoniae青霉素MIC 0.125-1ug/ml 青霉素耐药肺炎链球菌：PRSPPenicillin-resistant S. pneumoniae 青霉素MIC 2ug/ml 青霉素不敏感肺炎链球菌：PNSPPenicillin-nonsusceptible S.pneumoniae包括PISP和PRSP,肠球菌的耐药性,HLARE：高水平氨基糖苷类耐药肠球菌high-level aminoglycoside resistane氨苄西林和氨基糖苷类的联合治疗无效VRE：万古霉素耐药的肠球菌vancomycin-resistant enterococci基因型：vanA、vanB、vanC、vanD、vanE 对万古霉素具有不同的耐药程度,革兰阴性菌的主要变迁,肠杆菌科细菌产ESBLs，AmpC，碳青霉烯酶(KPC)等大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和奇异变形杆菌检出率增加大肠埃希菌对氟喹诺酮类的耐药率上升快：50%不动杆菌属、铜绿假单胞菌中的MDR、XDR和PDR菌株增多流感嗜血杆菌：产生-内酰胺酶嗜麦芽窄食单胞菌、黄杆菌固有耐药株对碳青霉烯类的耐药性检出率增加,几个重要的名字解释,MDR：Multi-drug resistant 多重耐药 对3种或以上化学结构不同的抗菌药物均耐药XDR：Extensively-drug resistant 广泛耐药对仅除黏菌素或替加环素外的其他药物全部耐药PDR：Pan-drug resistant 全耐药对所有抗菌药物均耐药,主要肠杆菌科细菌对碳青霉烯类的耐药性,670株碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌对抗菌药物的耐药率（CHINET 2010）,肺炎克雷伯菌占64.2%；病房依次为：ICU(36.3%)、神经外科(10%),CRE被列为“紧急威胁”,临床重要耐药细菌的检测,74,耐甲氧西林葡萄球菌的检测,苯唑西林：1g/片金葡菌 11-12mm凝固酶阴性葡萄球菌 17mm4%NaCl- 6g/ml苯唑西林盐平板培养条件：35，24-48小时结果：1个菌落生长，判定为甲氧西林耐药（MR）菌株头孢西丁：30g/片金葡菌 22mm凝固酶阴性葡萄球菌 24mm分子生物学方法：PCR扩增mecA基因,75,耐甲氧西林葡萄球菌的检测,苯唑西林和头孢西丁检测,苯唑西林盐平板检测,76,临床意义,77,MSSA(1495株)与MRSA(1916株)的耐药率（%）(CHINET 2008),克林霉素诱导耐药性的检测（D-试验）,79,HLARE肠球菌的检测,HLARE120 g/片庆大霉素 K-B法药敏抑菌圈直径 S10mm I=7-9mm(用稀释法确证) R=6mm临床意义 HLARE菌株采用氨苄西林和氨基糖苷类抗生素的联合治疗无效,80,耐万古霉素肠球菌检测,万古霉素纸片扩散法含量：30 g/片结果：透射光，抑菌圈内出现薄雾状或任何其他生长或抑菌圈14mm均表示耐药抑菌圈15-16mm为中度敏感，MIC抑菌圈17mm判定为敏感万古霉素耐药确证试验含6 g/ml万古霉素的MH平板1-10 l 0.5MacFarland Standard菌悬液35 ，24小时，1个菌落生长即判定为耐药 分子生物学方法：VanA、VanB、VanC 等基因,81,临床意义,82,万古霉素依赖粪肠球菌（Vancomycindependent Enterococcus faecalis，VDE)。长期、大量使用包括万古霉素、替考拉宁、氨基糖肽类等抗生素，由于抗生素的压力，肠球菌必须依赖万古霉素才能生长。,83,汪复：中国抗感染化疗杂志2005：5（1）：13,耐药肠球菌感染,耐万古霉素肠球菌属感染：新开发品种如利奈唑胺、奎奴普丁/达福普汀等，但后者对粪肠球菌无作用。根据药敏结果联合用药（磷霉素、利福平、氟喹诺酮类、米诺环素等）。磷霉素联合呋喃妥因可能对尿路感染有效,84,耐青霉素肺炎链球菌的检测,苯唑西林：1g/片抑菌圈直径20mm为青霉素敏感株（ MIC2g/ml ）抑菌圈直径19mm可能为青霉素耐药、中敏或敏感株，必须进行青霉素MIC测定。,青霉素敏感、中敏和耐药肺炎链球菌在儿童中的检出率(上海地区 1996-2008),85,临床意义,86,产超广谱内酰胺酶菌株的检测,ESBL：Extended-spectrum -lactamases筛选试验：ESBL头孢泊肟：10g/片 22mm头孢他啶：30g/片 22mm头孢噻肟：30g/片 27mm头孢曲松：30g/片 25mm氨曲南： 30g/片 27mm任一以上药物进行筛选，出现上述结果疑为ESBL产生株。,87,超广谱-内酰胺酶阳性确证试验,头孢他定/克拉维酸,头孢噻肟,头孢他定,头孢噻肟/克拉维酸,10 mm,26 mm,阳性的表型确证试验的最小抑菌浓度=5mm或者头孢噻肟（或头孢他定）/克拉维酸比单独的头孢噻肟（或头孢他定）的抑菌圈直径要更大些（仅一对需要被证明是阳性的）,88,临床意义,ESBLs菌株主要为大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌，其他的肠杆菌科细菌和非法酵菌中亦可存在可水解各种广谱-内酰胺类抗生素包括第三代的头孢他啶、头孢噻肟、头孢曲松以及头孢吡肟和氨曲南等含氧亚氨基侧链的头孢菌素多数可被酶抑制剂如克拉维酸、舒巴坦、三唑巴坦所抑制对亚胺培南、美罗培南等碳青霉烯类高度敏感，对头霉素类、头孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/三唑巴坦等酶抑制剂复方制剂多数仍呈敏感对具非-内酰胺结构的抗菌药物如氨基糖苷类、氟喹酮类等的耐药率亦较非产酶株高,产与非产ESBLs大肠埃希菌对抗菌药的耐药率（%）,90,AmpC酶和ESBL酶的特点,AmpC酶的检测,91,92,临床意义,产AmpC酶菌株主要发生在肠杆菌属、普罗威登菌属、摩根菌属、沙雷菌属和假单胞菌属细菌中对头霉素类、第三代头孢菌素和酶抑制剂复方制剂耐药，并可同时对氟喹酮类和氨基糖苷类耐药对第四代头孢菌素头孢吡肟和碳青霉烯类敏感如为ESBLs+AmpC酶菌株第四代头孢菌素头孢吡肟亦耐药,93,碳青霉烯酶,94,产KPC型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌的药物敏感性,16794株大肠埃希菌对抗菌药的耐药率（%）,12121株克雷伯菌属对抗菌药的耐药率（%）,8257株铜绿假单胞菌对抗菌药的耐药率（%）,10120株不动杆菌属(鲍曼不动89.2%)细菌对抗菌药的耐药率（%）,2013年各医院临床分离的广泛耐药株数,2013年各医院临床分离的广泛耐药株数,101,109株碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌的敏感性Shudan Chen et al. AAC, 2011, p. 2493,102,103,3-氨基苯硼酸抑制试验（300g/片）检测KPC型碳青霉烯酶,EDTA协同试验（ 292g/片）检测金属酶,Fupin HU,et al Journal of Medical Microbiology 2012,61:132,产KPC酶菌株的流行传播,美、英、法、以色列和巴西等相继报道产KPC-2或KPC-3酶肠杆菌科细菌引起的医院感染暴发流行。2004年美国全国性的耐药监测结果表明，24%的肺炎克雷伯菌携带KPC-2或KPC-3型碳青霉烯酶基因。其中88%的产KPC酶菌株具有相同的基因谱型。1999-2005年MYSTIC监测结果显示，产KPC-2酶菌株已从最初的单一种属细菌扩展至6种不同种属的肠杆菌科细菌。,产KPC酶菌株的流行传播,Neil Woodford报道2008年自一女性患者分离出一株产KPC-3酶的肺炎克雷伯菌结果证实该菌与以色列医院分离的一株产碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌具有相同的PFGE指纹图谱。病史调查结果发现，该患者之前曾在这家以色列医院进行治疗，病人在不同国家之间的流动促进了该类菌株流行传播区域的多样化。英国学者Daniel发现一株铜绿假单胞菌所产的KPC-5酶，是从KPC-2型和KPC-4型碳青霉烯酶进化而来，提示产KPC酶菌株的种类正积极地扩散至其他种属的细菌。,JAC, 2008, 62: 1261-1264.AAC. 2009, 53: 557-562,利奈唑胺耐药菌株染色体DNA经SmaI酶切后的PFGE电泳图,所有临床株的PFGE谱型完全一致，且与分离自杭州地区的cfr基因阳性对照株也相同,以色列及美国产KPC酶肺炎克雷伯菌的PFGE结果,希腊产KPC-2酶肺炎克雷伯菌引起的暴发流行,ICU病房分离的50株产酶菌株中，82%的菌株为同一克隆菌株。,同一克隆菌株,CID 2010; 50:36473,25株产KPC-2型酶的弗劳地柠檬酸杆菌其中15株为同一谱型,华山医院产KPC-2型碳青霉烯酶的肠杆菌科细菌,12株产KPC-2型酶的产气肠杆菌其中7株为同一谱型,含KPC酶质粒在不同细菌间的播散,AAC, 2009; 53(8): 3365,含KPC质粒的结构,AAC,2014, Epub,加强院感监测刻不容缓,CRE菌株筛选：美国CDC推荐的方法,115,肛拭子和湿化瓶分离的菌株为同一克隆菌株,PFGE同源性分析结果1、肛拭子标本分离株2、湿化瓶水分离株,对神经外科病房的环境标本及工作人员采样84.2%（16/19）的标本分离出碳青霉烯类药物耐药的革兰阴性杆菌或甲氧西林耐药葡萄球菌。,结果：CRE菌株筛选,CRE菌株感染或定植的危险因素：,严重的基础疾病；氟喹诺酮类药物的应用；广谱头孢菌素的应用；接受碳青霉烯类药物的治疗；留驻重症监护病房时间长；分离CRE前患者至少接受1种以上广谱抗菌药的治疗产KPC型酶肺炎克雷伯菌感染亦为导致住院患者死亡的独立危险因素,Hussein K.,et al,Infect Control Hosp Epidemiol. 2009; 30:666671Leanne B.,et al ,Infect Control Hosp Epidemiol. 2009; 30:11801185.,床位更换更换1次：31 (43.1%) 更换2次：21 (29.2%) 更换3次：12 (16.7%) 更换4次：5 (6.9%)更换5次：2 (2.8%)更换7次：1 (1.4%),危险因素：床位更换和插管留置具统计学意义,床位更换无更换：14 (70.0%) 更换1次：6 (30.0%),CR