水质粪大肠菌群的测定多管发酵法编制说明

水 质 粪 大 肠 菌 群 的 测 定 多 管 发 酵 法（ 征 求 意 见 稿 ） 编 制 说 明 水 质 粪 大 肠 菌 群 的 测 定 多 管 发 酵 法 标 准 编 制 组二 一 七 年 九 月附 件 3项 目 名 称 ： 水 质 粪 大 肠 菌 群 的 测 定 多 管 发 酵 法项 目 统 一 编 号 ： 986承 担 单 位 ： 辽 宁 省 环 境 监 测 实 验 中 心编 制 组 主 要 成 员 ： 卢 雁 、 丁 振 军 、 王 朝 霞 、 张 峥 、 吕 晓 洁 、 付 友 生 、李 杨 、 张 爽 、 问 青 春 、 赵 丽 娟 、 付 毓 、 杨 冬 雷标 准 所 技 术 管 理 负 责 人 ： 周 羽 化 、 张 虞环 境 监 测 司 项 目 负 责 人 ： 张 宗 祥I目 录1 项 目 背 景 .11.1 任 务 来 源 .11.2 工 作 过 程 .12 标 准 修 订 的 必 要 性 分 析 .32.1 粪 大 肠 菌 群 的 环 境 危 害 .32.2 相 关 环 保 标 准 和 环 保 工 作 的 需 要 .32.3 现 行 环 境 监 测 分 析 方 法 标 准 的 实 施 情 况 和 存 在 的 问 题 .43 国 内 外 相 关 分 析 方 法 研 究 .43.1 主 要 国 家 、 地 区 及 国 际 组 织 相 关 分 析 方 法 研 究 .43.2 国 内 相 关 分 析 方 法 研 究 .64 标 准 制 修 订 的 基 本 原 则 和 技 术 路 线 .74.1 标 准 制 修 订 的 基 本 原 则 .74.2 标 准 制 修 订 的 技 术 路 线 .75 方 法 研 究 报 告 .85.1 方 法 研 究 的 目 标 .95.2 方 法 原 理 .95.3 试 剂 和 材 料 .95.4 仪 器 和 设 备 .105.5 样 品 .105.6 分 析 步 骤 .125.7 结 果 计 算 .155.8 质 量 保 证 和 质 量 控 制 .196 方 法 验 证 .206.1 方 法 验 证 方 案 .206.2 方 法 验 证 过 程 .217 与 开 题 报 告 的 差 异 说 明 .218 参 考 文 献 .21附 一 方 法 验 证 报 告 .231 水 质 粪 大 肠 菌 群 的 测 定 多 管 发 酵 法 编 制 说 明1 项 目 背 景1.1 任 务 来 源根 据 国 家 环 境 保 护 部 （ 原 国 家 环 保 总 局 ） 关 于 下 达 2007 年 度 国 家 环 境 保 护 标 准 制 修订 项 目 计 划 的 通 知 （ 环 办 函 2007 544 号 ） ， 辽 宁 省 环 境 监 测 实 验 中 心 （ 原 辽 宁 省 环 境监 测 中 心 站 ） 承 担 水 质 粪 大 肠 菌 群 的 测 定 多 管 发 酵 法 与 滤 膜 法 的 标 准 制 修 订 任 务 ，项 目 编 号 986。工 作 过 程1.2.1 成 立 标 准 编 制 组辽 宁 省 环 境 监 测 实 验 中 心 （ 原 辽 宁 省 环 境 监 测 中 心 站 ） 接 到 修 订 水 质 粪 大 肠 菌 群 的测 定 多 管 发 酵 法 与 滤 膜 法 标 准 的 任 务 后 ， 成 立 了 标 准 编 制 组 。1.2.2 查 阅 国 内 外 标 准 及 文 献 ， 编 写 开 题 报 告 和 标 准 草 案标 准 编 制 组 成 立 后 ， 迅 速 开 展 相 关 的 调 查 工 作 ， 收 集 国 内 外 关 于 多 管 发 酵 法 和 滤 膜 法测 定 水 中 粪 性 大 肠 杆 菌 的 分 析 方 法 ， 及 相 关 的 标 准 方 法 ， 在 广 泛 阅 读 、 认 真 研 究 相 关 资 料的 基 础 上 ， 结 合 微 生 物 分 析 相 关 的 实 验 室 质 量 保 证 、 实 验 室 的 器 具 、 洗 涤 和 灭 菌 、 培 养 基的 制 备 、 微 生 物 样 品 采 集 、 保 存 和 储 藏 、 ISO 相 关 方 法 及 实 际 工 作 中 遇 到 的 问 题 和 总 结 的经 验 ， 制 定 了 实 施 方 案 。 同 时 ， 编 写 了 标 准 的 开 题 论 证 报 告 和 标 准 草 案 。1.2.3 开 题 论 证2009 年 12 月 8 日 ， 在 北 京 召 开 了 标 准 开 题 论 证 会 ， 与 会 专 家 听 取 了 标 准 编 制 单 位 的标 准 开 题 论 证 报 告 和 标 准 初 稿 内 容 介 绍 ， 经 质 询 、 讨 论 ， 认 为 该 标 准 材 料 齐 全 、 内 容 较 完整 ； 对 国 内 外 相 关 标 准 及 文 献 进 行 了 较 为 充 分 的 调 研 ； 本 标 准 技 术 路 线 合 理 可 行 。 最 后 提出 了 如 下 修 改 意 见 和 建 议 ：（ 1） 按 照 环 境 监 测 分 析 方 法 标 准 制 订 技 术 导 则 （ HJ/T168） 和 国 家 环 境 污 染 物监 测 方 法 标 准 制 修 订 工 作 暂 行 要 求 （ 环 科 函 2009 10 号 ） 的 要 求 开 展 实 验 、验 证 和 标 准 草 案 的 编 制 工 作 ；（ 2） 多 管 发 酵 法 和 滤 膜 法 分 成 两 个 标 准 ；（ 3） 增 加 原 始 数 据 及 报 告 的 具 体 内 容 及 要 求 ；（ 4） 进 一 步 细 化 操 作 过 程 及 过 程 中 的 质 量 控 制 要 求 。1.2.4 落 实 专 家 意 见 ， 深 入 开 展 方 法 验 证 工 作（ 1） 2015年 4月 ， 结 合 专 家 开 题 论 证 意 见 ， 分 别 选 取 地 表 水 、 地 下 水 、 工 业 废 水 和 生活 污 水 四 种 类 型 水 进 行 进 一 步 的 实 验 室 内 方 法 研 究 ， 并 对 结 果 数 据 进 行 汇 总 和 分 析整 理 ， 编 写 完 成 了 水 质 粪 大 肠 菌 群 的 测 定 多 管 发 酵 法 的 标 准 草 案 及 验 证 方2案 。（ 2） 2015年 7月 13日 -17日 ， 组 织 6家 有 资 质 的 实 验 室 进 行 实 验 室 间 方 法 验 证 ， 并 于 验证 结 束 后 收 回 全 部 的 验 证 报 告 。（ 3） 在 此 基 础 上 进 行 了 数 据 的 汇 总 和 分 析 整 理 工 作 ， 同 时 完 善 了 水 质 粪 大 肠 菌 群的 测 定 多 管 发 酵 法 标 准 征 求 意 见 稿 及 编 制 说 明 。1.2.5 召 开 专 家 研 讨 会 ， 征 求 专 家 意 见2015年 11月 23日 在 北 京 召 开 国 家 环 境 保 护 标 准 研 讨 会 ， 专 家 意 见 如 下 ：（ 1） 在 文 本 中 ， 适 用 范 围 中 的 “ 生 活 污 水 、 工 业 废 水 ” 统 一 写 成 “ 废 水 ”， 补 充 12管法 及 15管 法 的 检 出 限 和 适 用 范 围 ； 分 析 步 骤 中 分 别 表 述 12管 法 及 15管 法 的 操 作 步骤 ； 修 改 完 善 术 语 和 定 义 ； 将 附 录 中 内 容 移 至 文 本 中 ； 在 精 密 度 部 分 删 去 重 复 性 限和 再 现 性 限 ， 改 用 置 信 区 间 表 达 。（ 2） 在 编 制 说 明 中 ， 补 充 说 明 现 行 方 法 HJ/T347-2007（ 试 行 ） 使 用 情 况 及 存 在 问 题 ；补 充 条 件 实 验 及 验 证 实 验 中 样 品 、 仪 器 等 详 细 信 息 ； 补 充 精 密 度 和 准 确 度 的 验 证 结论 ； 经 充 分 调 研 ， 补 充 质 量 保 证 与 质 量 控 制 的 要 求 和 说 明 。（ 3） 按 照 环 境 监 测 分 析 方 法 标 准 制 修 订 技 术 导 则 （ HJ168-2010） 和 环 境 保 护 标准 编 制 出 版 技 术 指 南 （ HJ565-2010） 对 标 准 文 本 进 行 编 辑 性 修 改 。1.2.6 落 实 专 家 意 见 ， 完 善 标 准 征 求 意 见 稿 及 编 制 说 明结 合 专 家 论 证 意 见 ， 补 充 条 件 实 验 ， 并 进 一 步 修 改 完 善 水 质 粪 大 肠 菌 群 的 测 定 多管 发 酵 法 的 标 准 征 求 意 见 稿 及 编 制 说 明 。1.2.7 召 开 技 术 审 查 会 ， 征 求 专 家 意 见2017年 1月 12日 在 北 京 召 开 国 家 环 境 保 护 标 准 征 求 意 见 稿 技 术 审 查 会 ， 审 查 委 员 会 听 取了 标 准 主 编 单 位 关 于 征 求 意 见 稿 的 主 要 技 术 内 容 、 编 制 工 作 过 程 的 汇 报 ， 经 质 询 、 讨 论 ， 形成 如 下 审 查 意 见 ：（ 1） 标 准 主 编 单 位 提 供 的 材 料 齐 全 、 内 容 完 整 、 格 式 规 范 ；（ 2） 制 订 的 标 准 具 有 科 学 性 、 适 用 性 和 可 操 作 性 ， 能 满 足 地 表 水 、 地 下 水 、 废 水 等 水体 中 粪 大 肠 菌 群 多 管 发 酵 法 测 定 的 需 要 。审 查 委 员 会 通 过 标 准 文 本 和 编 制 说 明 的 征 求 意 见 稿 的 技 术 审 查 ， 提 出 如 下 修 改 意 见 和 建议 ， 经 修 改 后 可 公 开 征 求 意 见 ：（ 1） 在 文 本 中 ， 修 改 粪 大 肠 菌 群 定 义 及 方 法 原 理 ； 完 善 9.2.2接 种 用 水 量 参 考 ； “ 11.1精 密 度 ” 中 置 信 区 间 部 分 增 加 几 何 均 值 ； 增 加 阳 性 和 阴 性 标 准 菌 株 定 性 质 控 内 容 。（ 2） 在 编 制 说 明 中 ， 增 加 实 验 室 内 95%置 信 区 间 的 内 容 。（ 3） 根 据 专 家 意 见 将 标 准 中 部 分 文 本 进 行 修 改 。1.2.8 落 实 审 查 委 员 会 审 查 意 见 ， 进 一 步 完 善 标 准 征 求 意 见 稿 及 编 制 说 明结 合 审 查 委 员 会 审 查 意 见 ， 对 文 本 和 编 制 说 明 的 相 关 部 分 进 一 步 修 改 ， 修 改 后 可 公 开 征求 意 见 。32 标 准 修 订 的 必 要 性 分 析2.1 粪 大 肠 菌 群 的 环 境 危 害粪 大 肠 菌 群 又 称 耐 热 大 肠 菌 群 ， 并 非 细 菌 学 分 类 名 称 ， 而 是 卫 生 用 语 ， 它 们 指 的 不 是某 一 种 或 某 一 属 细 菌 ， 而 是 一 类 细 菌 ， 是 指 44.5 培 养 24h， 能 发 酵 乳 糖 产 酸 产 气 的 需 氧及 兼 性 厌 氧 的 革 兰 氏 阴 性 无 芽 孢 杆 菌 ， 是 总 大 肠 菌 群 的 一 部 分 ， 主 要 包 括 埃 希 氏 菌 属 和 耐热 的 克 雷 伯 菌 属 细 菌 ， 是 生 长 于 人 和 温 血 动 物 肠 道 中 的 一 组 肠 道 细 菌 ， 除 一 般 正 常 细 菌 外 ，同 时 也 会 有 一 些 肠 道 致 病 菌 存 在 （ 如 沙 门 氏 菌 、 志 贺 氏 菌 等 ） ， 随 粪 便 排 出 体 外 ， 约 占 粪 便干 重 的 1/3 以 上 ， 故 称 为 粪 大 肠 菌 群 。 它 主 要 来 自 粪 便 ， 在 自 然 界 中 易 死 亡 ， 若 检 出 可 说明 检 测 对 象 近 期 受 到 了 粪 便 污 染 ， 水 体 中 存 在 着 肠 道 致 病 菌 污 染 的 可 能 性 ， 潜 伏 着 中 毒 和流 行 病 的 威 胁 ， 对 人 体 健 康 具 有 潜 在 的 危 险 性 。水 质 中 粪 大 肠 菌 群 超 标 危 害 主 要 引 起 腹 泻 、 肠 胃 感 染 等 。 水 质 粪 大 肠 菌 群 结 果 的 高 低 ，既 表 明 水 体 受 到 粪 便 污 染 的 程 度 ， 也 反 映 了 水 质 对 人 体 健 康 危 害 性 的 大 小 。2.2 相 关 环 保 标 准 和 环 保 工 作 的 需 要我 国 9 个 标 准 中 规 定 了 浓 度 限 值 和 排 放 限 值 。 地 表 水 环 境 质 量 标 准 （ GB3838-2002）明 确 规 定 了 粪 大 肠 菌 群 的 类 标 准 限 值 ， 其 限 值 浓 度 分 别 为 200 个 /L、 2000 个 /L、 10000个 /L、 20000 个 /L 和 40000 个 /L。 此 外 ， 生 活 饮 用 水 卫 生 标 准 （ GB5749-2006） 、 海 水水 质 标 准 （ GB3097-1997） 和 农 田 灌 溉 水 质 标 准 （ GB5084-2005） 等 都 对 粪 大 肠 菌 群限 值 做 了 明 确 规 定 。 医 疗 机 构 水 污 染 物 排 放 标 准 （ GB18466-2005） 、 畜 禽 养 殖 业 污 染 物排 放 标 准 （ GB18596-2001） 、 城 镇 污 水 处 理 厂 污 染 物 排 放 标 准 （ GB18918-2002） 和 污水 综 合 排 放 标 准 （ GB8978-1996） 等 排 放 标 准 都 规 定 了 粪 大 肠 菌 群 的 排 放 限 值 。 相 关 标 准对 粪 大 肠 菌 群 的 限 值 及 分 类 见 表 1。表 1 相 关 标 准 对 粪 大 肠 菌 群 的 限 值 及 分 类序号 标 准 号 标 准 名 称 水 质 分 类 标 准 值 单 位1 GB3838-2002 地 表 水 环 境 质 量标 准 类 200 个 /L 类 2000 类 10000 类 20000 类 400002 GB5749-2006 生 活 饮 用 水 卫 生标 准 / 不 得 检 出 /3 CJ/T206-2005 城 市 供 水 水 质 标准 / 不 得 检 出 个 /100ml4 GB3097-1997 海 水 水 质 标 准 / 2000 个 /L供 人 生 食 的 贝 类 增 养 殖 水 质 1405 GB5084-2005 农 田 灌 溉 水 质 标准 水 作 4000 个 /100ml旱 作 4000蔬 菜 ： 加 工 、 烹 调 及 去 皮 蔬 菜 20004序号 标 准 号 标 准 名 称 水 质 分 类 标 准 值 单 位生 食 类 蔬 菜 、 瓜 类 和 草 本 水 果 10006 GB18466-2005 医 疗 机 构 水 污 染物 排 放 标 准 传 染 病 、 结 核 病 医 疗 机 构 水 污 染 物排 放 限 值 （ 日 均 值 ） 100 MPN/L综 合 医 疗 机 构 和 其 他 医 疗 机 构 水 污染 物 排 放 均 值 （ 日 均 值 ） 5007 GB18596-2001 畜 禽 养 殖 业 污 染物 排 放 标 准 集 约 化 畜 禽 养 殖 业 水 污 染 物 最 高 允许 日 均 排 放 10000 个 /L8 GB18918-2002 城 镇 污 水 处 理 厂污 染 物 排 放 标 准 一 级 A标 准 103 个 /L一 级 B 标 准 104二 级 标 准 104三 级 标 准 9 GB8978-1996 污 水 综 合 排 放 标准 医 院 、 兽 医 院 及 医 疗 机 构 含 病 原 体污 水 一 级 标 准 500 个 /L医 院 、 兽 医 院 及 医 疗 机 构 含 病 原 体污 水 二 级 标 准 1000医 院 、 兽 医 院 及 医 疗 机 构 含 病 原 体污 水 三 级 标 准 50002.3 现 行 环 境 监 测 分 析 方 法 标 准 的 实 施 情 况 和 存 在 的 问 题现 行 的 标 准 水 质 粪 大 肠 菌 群 的 测 定 多 管 发 酵 法 和 滤 膜 法 （ 试 行 ） （ HJ/T347-2007） 中 的 多 管 发 酵 法 是 一 个 经 典 的 方 法 ， 国 内 外 广 泛 使 用 且 沿 用 多 年 ， 但 该 标 准 是试 行 标 准 ， 没 有 进 行 验 证 实 验 ， 不 满 足 HJ168-2010 的 要 求 ， 且 该 标 准 不 够 细 化 ， 迫 切 需要 对 现 有 方 法 标 准 进 行 样 品 采 集 、 样 品 保 存 和 储 藏 、 实 验 室 质 量 控 制 、 废 物 处 理 、 实 验 步骤 细 化 等 方 面 进 行 增 加 和 修 订 ， 以 满 足 现 有 环 境 保 护 工 作 的 需 求 。鉴 于 本 标 准 是 对 现 行 标 准 水 质 粪 大 肠 菌 群 的 测 定 多 管 发 酵 法 和 滤 膜 法 （ 试 行 ） （ HJ/T347-2007） 的 修 订 ， 所 以 标 准 编 制 组 广 泛 征 求 了 各 省 、 自 治 区 、 直 辖 市 环 境 监 测 中心 （ 站 ） 的 意 见 ， 主 要 存 在 如 下 问 题 ：（ 1） 试 行 标 准 中 缺 少 对 应 的 采 样 方 法 和 样 品 保 存 措 施 ；（ 2） 缺 少 质 量 保 证 和 质 量 控 制 措 施 ；（ 3） 缺 少 废 物 处 置 内 容 。标 准 编 制 组 对 以 上 意 见 予 以 了 采 纳 ， 在 修 订 标 准 中 增 加 了 采 样 方 法 、 样 品 保 存 方 法 、质 量 保 证 和 质 量 控 制 措 施 、 废 物 处 理 等 内 容 ， 并 对 实 验 步 骤 进 行 了 细 化 。2.4 修 订 的 主 要 内 容按 照 HJ168-2010 的 要 求 增 加 了 规 范 性 引 用 文 件 、 术 语 和 定 义 、 精 密 度 和 准 确 度 等 相关 内 容 。 为 了 增 加 可 操 作 性 ， 在 操 作 中 增 加 了 干 扰 和 消 除 、 样 品 的 采 集 和 保 存 的 、 质 量 控制 与 质 量 保 证 和 废 物 处 理 等 相 关 内 容 。3 国 内 外 相 关 分 析 方 法 研 究3.1 主 要 国 家 、 地 区 及 国 际 组 织 相 关 分 析 方 法 研 究目 前 国 内 外 对 粪 大 肠 菌 群 名 称 定 义 不 同 ， 称 其 为 耐 热 大 肠 菌 群 是 指 其 不 全 是 粪 性 来 源 ，5而 是 强 调 其 对 温 度 的 耐 受 性 方 面 特 点 ； 称 其 为 粪 大 肠 菌 群 是 指 其 主 要 来 自 于 温 血 动 物 的 粪便 ， 长 期 在 温 暖 的 肠 道 中 生 活 ， 能 够 适 应 较 高 的 培 养 温 度 。 目 前 ， 国 外 几 个 主 要 的 标 准 中对 耐 热 大 肠 菌 群 与 粪 大 肠 菌 群 的 比 较 见 表 2。表 2 耐 热 大 肠 菌 群 与 粪 大 肠 菌 群 的 比 较项 目 依 据 定 义耐 热 大 肠 菌 群 NMKL、 ISO 在 44.5 培 养 ， 24h 内 能 产 酸 产 气 的 细 菌 。粪 大 肠 菌 群 NMKL 在 胰 蛋 白 胨 肉 汤 中 于 44.5 ， 24h 内 产 生 吲 哚的 耐 热 大 肠 菌 群 。AOAC 于 LST 中 36 培 养 48h 内 产 气 ， 并 于 EC 内培 养 44 24h 产 气 的 一 群 细 菌 。在 检 测 方 法 上 ， 根 据 侧 重 点 的 不 同 有 称 为 MPN 检 测 程 序 和 多 管 发 酵 法 等 ， MPN 检 定程 序 主 要 强 调 检 测 结 果 的 统 计 是 利 用 数 理 统 计 中 最 大 可 能 数 （ MostProbableNumber） 的 方式 进 行 计 算 ； 多 管 发 酵 法 是 强 调 培 养 是 通 过 多 个 培 养 管 进 行 的 ， 培 养 管 的 数 量 也 有 每 个 浓度 3 管 和 每 个 浓 度 5 管 的 不 同 。 培 养 温 度 、 培 养 基 和 培 养 时 间 也 有 不 同 ， 培 养 温 度 的 不 同主 要 体 现 在 耐 受 温 度 选 用 的 高 低 略 有 不 同 ， 有 42.0 、 44.0 、 44.5 、 45.0 等 ； 培 养 基的 不 同 主 要 是 根 据 培 养 方 式 的 不 同 选 用 相 应 的 培 养 基 。多 管 发 酵 法 是 根 据 粪 大 肠 菌 群 能 发 酵 乳 糖 、 产 酸 产 气 等 有 关 特 性 ， 通 过 多 管 发 酵 以MPN 来 表 示 试 验 结 果 。 对 多 管 发 酵 法 除 了 上 述 检 测 方 法 名 称 、 粪 大 肠 菌 群 的 名 称 、 培 养 温度 、 培 养 基 和 培 养 时 间 的 不 同 外 ， 基 本 操 作 相 似 ， 都 是 利 用 试 管 发 酵 法 及 MPN 统 计 结 果 ，测 定 水 中 的 粪 大 肠 菌 群 。 国 外 主 要 检 测 方 法 对 比 情 况 见 表 3。表 3 国 外 主 要 检 测 方 法 对 比 情 况ISO EPA APHA标 准 名 称 ISO9308-1:2014Waterquality-EnumerationofEscherichiacoliandcoliformbacteria-Part1:Membranefiltrationmethodforwaterswithlowbacterialbackgroundflora ColiformsTotal,FecalandE.Coli（ method8001、 8001A） STANDARDMETHODS9221E.FECALCOLIFORMPROCEDURE（ 20thEdition）适 用 范 围 饮 用 水 、 消 毒 池 出 水 和 水 处 理厂 出 水 等 低 细 菌 含 量 的 水 样 中的 大 肠 杆 菌 和 大 肠 菌 群 饮 用 水 、 废 水 饮 用 水 、 河 流 污 染 、 原 水 、 废水 处 理 系 统 、 洗 浴 用 水 、 海 水和 一 般 的 水 质 监 测样 品 保 存温 度 5 3 0-10 样 品 保 存时 间 特 殊 情 况 下 最 长 24h， 但 应 在结 果 报 告 中 写 明 饮 用 水 不 多 于 30h； 废 水 不 多于 6h 培 养 基 大 肠 菌 群 显 色 培 养 基 （ CCA） 月 桂 基 胰 蛋 白 胨 肉 汤 培 养 管 月 桂 基 胰 蛋 白 胨 肉 汤 、 EC 培 养6（ 哈 希 ） 、 EC 培 养 基 基使 用 管 数 10 管 法 饮 用 水 5 管 、 10 管 法 ， 非 饮 用水 15 管 法培 养 温 度 36 2 350.5 ； 44.50.2 350.5 ； 44.50.2培 养 时 间 213h 242h242h 242h242h结 果 判 读 1.-D-半 乳 糖 苷 酶 反 应 阳 性 （ 粉红 色 ） 判 定 为 疑 似 大 肠 菌 群 阳性 ， 再 用 氧 化 酶 阴 性 反 应 （ 不出 现 深 蓝 色 ） 验 证 为 大 肠 菌 群2.-D-半 乳 糖 苷 酶 和 -D-葡 萄糖 醛 酸 酶 反 应 阳 性 （ 粉 红 色 和深 蓝 色 ） ， 证 实 为 大 肠 杆 菌 初 发 酵 产 酸 产 气 ， 复 发 酵 产 气为 粪 大 肠 菌 群 阳 性 初 发 酵 产 酸 产 气 ， 复 发 酵 产 气为 粪 大 肠 菌 群 阳 性3.2 国 内 相 关 分 析 方 法 研 究目 前 国 内 的 粪 大 肠 菌 群 检 测 方 法 有 多 管 发 酵 法 、 滤 膜 法 、 酶 法 、 LTSE 法 和 纸 片 法 。多 管 发 酵 法 是 根 据 粪 大 肠 菌 群 能 发 酵 乳 糖 产 酸 产 气 的 特 征 ， 检 测 样 品 中 粪 大 肠 菌 群 的 方 法 ；滤 膜 法 是 利 用 微 孔 滤 膜 过 滤 一 定 量 样 品 ， 将 样 品 中 含 有 的 细 菌 截 留 在 滤 膜 上 ， 然 后 将 滤 膜贴 在 选 择 性 培 养 基 上 ， 经 培 养 后 直 接 计 数 滤 膜 上 生 长 的 典 型 粪 大 肠 菌 群 菌 落 ； 酶 法 采 用 大肠 菌 群 细 菌 能 产 生 -半 乳 糖 苷 酶 分 解 ONPG 使 培 养 液 呈 黄 色 ， 以 及 大 肠 埃 希 氏 菌 产 生 -葡萄 糖 醛 酸 酶 分 解 MUG 使 培 养 液 在 波 长 366nm 紫 外 光 下 产 生 荧 光 的 原 理 ， 来 判 断 样 品 中 是否 含 有 大 肠 菌 群 及 大 肠 埃 希 氏 菌 ； LTSE 法 是 用 专 门 的 LTSE 肉 汤 快 速 检 验 粪 大 肠 菌 群 的 方法 ； 纸 片 法 是 将 一 定 量 的 乳 糖 、 指 示 剂 及 营 养 成 分 等 吸 附 于 一 定 面 积 的 无 菌 滤 纸 上 来 代 替多 管 发 酵 的 发 酵 管 从 而 简 化 实 验 操 作 的 方 法 。 国 内 主 要 多 管 发 酵 法 对 比 情 况 见 表 4。表 4 国 内 主 要 多 管 发 酵 法 对 比 情 况标 准来 源 GB（ 国 标 ） SL（ 水 利 ） HJ（ 环 境 ） 水 和 废 水 监 测 分 析 方 法第 四 版标 准名 称 GB/T5750.12-2006 生 活 饮 用 水 标 准 检 验方 法 微 生 物 指 标 SL355-2006 水 质 粪 大 肠 菌 群 的测 定 多 管 发 酵 法 HJ/T347-2007 水 质 粪 大 肠 菌 群 的测 定 多 管 发 酵 法 和 滤膜 法 （ 试 行 ） 适 用范 围 生 活 饮 用 水 及 其 水 源水 地 表 水 、 地 下 水 、 生活 饮 用 水 等 ， 特 别 是浑 浊 度 高 的 样 品 地 表 水 、 地 下 水 及 废水 地 表 水 、 地 下 水 及 废 水样 品 保 存温 度 4 10 以 下样 品 保 存时 间 4h 6h培 养 基 乳 糖 蛋 白 胨 培 养 基 、EC 培 养 基 、 伊 红 美 蓝 乳 糖 蛋 白 胨 培 养 基 、EC培 养 基 、 伊 红 美 蓝 乳 糖 蛋 白 胨 培 养 基 、EC 培 养 基 乳 糖 蛋 白 胨 培 养 基 、 EC培 养 基7琼 脂 琼 脂使 用管 数 5 管 法 ， 15 管 法 12 管 法 ， 15 管 法 12 管 法 ， 15 管 法 12 管 法 ， 15管 法培 养温 度 361 ,44.5 37 ， 44.5 370.5 ， 44.50.5 370.5 ， 44.50.5培 养时 间 242h， 1824h 242h， 242h 242h， 242h 242h， 242h结 果判 读 初 发 酵 产 酸 产 气 ， 复发 酵 产 气 为 耐 热 大 肠菌 群 阳 性 初 发 酵 产 酸 产 气 ， 复发 酵 产 气 为 粪 大 肠 菌群 阳 性 初 发 酵 产 酸 产 气 ， 复发 酵 产 气 为 粪 大 肠 菌群 阳 性 初 发 酵 产 酸 产 气 ， 复 发酵 产 气 为 粪 大 肠 菌 群 阳性3.3 与 本 方 法 标 准 的 关 系本 方 法 标 准 与 水 质 粪 大 肠 菌 群 的 测 定 多 管 发 酵 法 和 滤 膜 法 （ 试 行 ） （ HJ/T347-2007） 和 水 和 废 水 监 测 分 析 方 法 第 四 版 (增 补 版 )中 内 容 一 致 ， 使 用 12 管 法 和 15管 法 ， 分 别 在 乳 糖 蛋 白 胨 培 养 基 和 EC 培 养 基 培 养 上 以 37 0.5 和 44.50.5 的 培 养 温 度培 养 242h 进 行 初 发 酵 和 复 发 酵 进 而 计 数 。4 标 准 制 修 订 的 基 本 原 则 和 技 术 路 线4.1 标 准 制 修 订 的 基 本 原 则多 管 发 酵 法 方 法 检 出 限 ： 12 管 法 为 3MPN/L； 15 管 法 为 20MPN/L。 适 用 于 地 表 水 、地 下 水 和 废 水 中 粪 大 肠 菌 群 的 测 定 ， 满 足 相 关 环 保 标 准 的 要 求 ， 且 该 方 法 技 术 要 求 相 对 较低 ， 分 析 成 本 亦 较 低 ， 便 于 进 行 普 及 和 推 广 。本 标 准 依 据 国 家 环 境 保 护 标 准 制 修 订 工 作 管 理 办 法 和 环 境 监 测 分 析 方 法 标 准 制修 订 技 术 导 则 （ HJ168-2010） 等 文 件 的 要 求 ， 对 现 行 的 标 准 水 质 粪 大 肠 菌 群 的 测 定 多管 发 酵 法 和 滤 膜 法 （ 试 行 ） （ HJ/T347-2007） 进 行 修 订 ， 确 保 方 法 标 准 的 科 学 性 、 先 进 性 、可 行 性 和 可 操 作 性 。 同 时 具 有 普 遍 适 用 性 ， 易 于 推 广 使 用 。 满 足 大 多 数 基 层 实 验 室 的 需 要 ，满 足 水 质 中 粪 大 肠 菌 群 的 检 测 要 求 。根 据 现 行 标 准 的 局 限 性 ， 做 了 如 下 修 订 ： 增 加 样 品 采 集 、 样 品 保 存 和 储 藏 、 实 验 室 质量 控 制 、 废 物 处 置 等 方 面 的 内 容 ， 对 实 验 步 骤 进 行 细 化 修 订 。4.2 标 准 制 修 订 的 技 术 路 线粪 大 肠 菌 群 是 我 国 环 境 质 量 标 准 和 污 染 物 排 放 标 准 的 重 要 监 测 指 标 ， 目 前 ， 各 级 环 境监 测 部 门 都 配 置 了 相 应 的 仪 器 设 备 ， 具 备 粪 大 肠 菌 群 检 测 能 力 。多 管 发 酵 法 是 检 测 粪 大 肠 菌 群 的 经 典 方 法 ， 国 内 外 一 直 沿 用 多 年 ， 该 方 法 技 术 要 求 相对 较 低 ， 分 析 成 本 亦 较 低 ， 便 于 普 及 和 推 广 。 本 标 准 制 修 订 的 技 术 路 线 见 图 1。8图 1 标 准 制 修 订 的 技 术 路 线5 方 法 研 究 报 告该 方 法 是 对 水 质 粪 大 肠 菌 群 的 测 定 多 管 发 酵 法 和 滤 膜 法 （ 试 行 ） （ HJ/T347-2007）中 的 多 管 发 酵 法 的 修 订 ， 与 原 方 法 相 比 增 删 条 款 及 增 删 原 因 见 表 5。表 5 本 标 准 与 原 标 准 内 容 区 别章 节 号 增 删 条 款 增 删 内 容 原 因1 增 加 了 方 法 的 检 出 限 说 明 ， 明 确 了 12 管 法 和 15 管 法 的 检 出 限 HJ168-2010要 求2 增 加 了 规 范 性 引 用 文 件 ， 明 确 了 引 用 的 准 确 来 源 HJ168-2010要 求3 增 加 了 粪 大 肠 菌 群 和 最 大 可 能 数 的 定 义 HJ168-2010要 求5 增 加 了 干 扰 和 消 除 ， 对 消 除 样 品 中 的 检 测 干 扰 因 素 进 行 了 具 体 规 定 增 加 可 操 作 性6 增 加 了 实 验 用 水 、 无 菌 水 、 硫 代 硫 酸 钠 和 乙 二 胺 四 乙 酸 二 钠 的 相 关 要 求 增 加 可 操 作 性7 增 加 了 对 检 测 所 需 的 仪 器 和 设 备 的 规 范 要 求 。 增 加 可 操 作 性8 增 加 了 对 样 品 采 集 方 法 和 样 品 保 存 条 件 的 规 范 要 求 增 加 可 操 作 性9 增 加 了 样 品 的 取 用 及 稀 释 方 法 、 样 品 接 种 量 相 关 内 容 、 培 养 介 质 的 改 变 增 加 可 操 作 性10 增 加 了 结 果 表 示 的 内 容 ， 对 结 果 表 示 的 方 法 和 形 式 进 行 了 规 范 增 加 可 操 作 性编 写 验 证 方 案编 制 标 准 方 法 文 本 和 编 制 说 明 （ 征 求 意 见 稿 ）样 品 保 存 时 间 条 件 实 验 样 品 培 养 温 度 条 件 实 验 实 验 室 质 量 控 制文 献 查 阅 调 研 现 行 标 准 使 用 情 况 查 阅 国 内 相 关 标 准对 现 有 方 法 和 监 测 工 作 需 求 开 展 调 研 查 阅 国 外 相 关 标 准确 定 实 验 方 案 并 开 展 实 验开 展 方 法 验 证标 准 审 定标 准 报 批9章 节 号 增 删 条 款 增 删 内 容 原 因11 增 加 了 增 加 了 精 密 度 和 准 确 度 的 相 关 内 容 HJ168-2010要 求12 增 加 了 质 量 保 证 和 质 量 控 制 的 相 关 内 容 增 加 可 操 作 性13 增 加 了 废 物 处 理 的 内 容 的 相 关 内 容 增 加 可 操 作 性5.1 方 法 研 究 的 目 标本 标 准 适 用 于 地 表 水 、 地 下 水 和 废 水 中 粪 大 肠 菌 群 的 测 定 。 本 研 究 旨 在 建 立 一 个 通 用性 的 粪 大 肠 菌 群 测 定 的 国 家 标 准 方 法 。 本 方 法 的 检 出 限 ： 12 管 法 为 3MPN/L； 15 管 法 为20MPN/L。5.2 方 法 原 理将 一 定 量 的 水 样 ， 以 无 菌 操 作 方 式 接 种 到 含 有 乳 糖 培 养 基 的 试 管 中 ， 在 特 定 的 温 度（ 44.5 ） 培 养 24h， 当 细 菌 生 长 繁 殖 时 ， 产 酸 使 培 养 液 pH 值 降 低 ， 溴 甲 酚 紫 由 紫 色 变 为黄 色 ， 指 示 产 酸 ； 脱 氢 酶 分 解 底 物 产 生 气 体 ， 利 用 倒 管 指 示 产 气 。 通 过 指 示 剂 的 颜 色 变 化和 倒 管 中 有 无 气 体 判 断 是 否 产 酸 产 气 ， 从 而 确 定 是 否 存 在 粪 大 肠 菌 群 ， 并 通 过 查 MPN 表 ，以 MPN 表 示 粪 大 肠 菌 群 浓 度 值 。5.3 试 剂 和 材 料除 非 另 有 说 明 ， 分 析 时 均 使 用 符 合 国 家 标 准 的 分 析 纯 化 学 试 剂 。5.3.1 乳 糖 蛋 白 胨 培 养 液 成 分 ：蛋 白 胨 10g牛 肉 浸 膏 3g乳 糖 5g氯 化 钠 5g1.6%溴 甲 酚 紫 乙 醇 溶 液 1ml制 法 ： 将 蛋 白 胨 、 牛 肉 浸 膏 、 乳 糖 、 氯 化 钠 加 热 溶 解 于 1000ml 蒸 馏 水 或 去 离 子 水 中 ，调 节 pH 值 到 7.2 7.4， 再 加 入 1.6%溴 甲 酚 紫 乙 醇 溶 液 1ml， 充 分 混 匀 ， 分 装 于 含 有 倒 置小 玻 璃 管 的 试 管 中 ， 115 高 压 蒸