课题1微生物的实验室培养

课题1 微生物的实验室培养,专题2 :微生物的培养与应用,微生物：指形体微小(小于0.1mm)，结构简单，在适宜环境中能迅速生长繁殖，易变异，通常要借助显微镜才能看清楚的生物。大约有10万种。,微生物,原核生物界,原生生物界,真菌界,病毒,(细菌、放线菌、蓝藻),(酵母菌、霉菌、大型真菌),(草履虫、变形虫、衣藻),(噬菌体、艾滋病毒),一、细菌,1、细菌的形态：球形、杆形、螺旋形。,2、细菌的结构,所有的细菌所共有的基本结构有哪些？某些细菌所具有的特殊结构有哪些？,思考：,（拟核）,基本结构,特殊结构,*细胞壁,结构特点：坚韧且有弹性细胞壁有哪些功能？ 固定细胞外形；,保护细胞免受外力的损伤；,阻拦大分子物质进人细胞；,使细胞具有致病性及对噬菌体的敏感性。,伤寒杆菌细胞壁中含毒素,主要是肽聚糖,保护和维持细胞形状等,同真核生物,同真核生物,多种成分,新陈代谢的主要场所,小型DNA分子,同真核生物,同真核生物,控制细菌的抗药性、固氮、抗生素生成,多种成分,贮藏营养物质或代谢废物，如淀粉粒、硫粒,大型环型DNA,控制细菌主要遗传性状,特殊的结构,荚膜 主要成分为多糖，与其致病性有关。芽孢 细菌生长到一定阶段产生的一种抗逆 性很强的休眠体,以度过不良的环境。,荚膜、鞭毛、芽孢,一般说，芽孢不起繁殖作用，只起度过不良环境的作用，芽孢对热、紫外线和许多有毒化学物质有很强的抗性。,3、细菌的代谢,腐生依靠分解动植物的遗体（尸体、粪便和枯枝落叶），从中吸取有机物来生活。例如枯草杆菌，它可以引起食物的腐败。,寄生从活的动植物体内吸取有机物来生活。例如寄生在肠道内的痢疾杆菌，它能够引起细菌性痢疾。,需氧型：好氧性细菌。如：枯草杆菌、硝化细菌、铁细菌、根 瘤菌等。,厌氧型：厌氧性细菌。如：破伤风杆菌，大肠杆菌，乳酸菌等。,异养需氧型异养厌氧型自养需氧型自养厌氧型,问 ： 细菌的代谢类型属于什么方式? 在生态系统中处于什么地位?,分解者或消费者,生产者,3、细菌的繁殖 二分裂,20分钟30分钟，分裂一次,无鞭毛的球菌：菌落较小较厚、边缘整齐. 有鞭毛的细菌：菌落大而扁平、边缘波状或锯齿状.,问：菌落在生态学上属于什么单位？,菌 落,问：什么叫菌落？,菌落可以作为菌种鉴定的重要依据。,单个或者少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，会形成一个肉眼可见的、具有一定形态结构的子细胞群体。,几种菌落,三册书中所有细菌的种类,例如：乳酸菌的有关知识,细胞类型：原核细胞代谢类型：异养厌养代谢产物：乳酸生产用途：酸奶、泡菜可产生乳酸的生物：,人无氧呼吸马铃薯块茎玉米的胚、甜菜块根,二、放线菌,菌体由分枝状的菌丝构成基内菌丝(营养菌丝)吸收现成的有机物(大多营腐生生活)气生菌丝到一定阶段分化成孢子丝，上有成串的孢子。,单细胞的原核生物，分布广泛。,放线菌的生殖,孢子生殖,70%以上的天然抗生素均由土壤放线菌产生。 如头孢拉定、链霉素、金霉素、土霉素、庆大霉素、春雷霉素、四环素、红霉素和卡那霉素等。,三、病毒,HIV病毒,整合酶的功能是将病毒DNA整合到宿主细胞染色体中,1、病毒的结构,病毒结构,核酸(DNA或RNA)衣壳(蛋白质)；由衣壳粒构成,核衣壳,囊 膜(有的病毒具有),由蛋白质、多糖和脂类构成,上常有刺突；如流感病毒.,衣壳,化学组成形态单位功能排列方式,由蛋白质构成,衣壳粒,通常由1-6个多肽分子组成,保护核酸决定抗原特异性,使病毒呈现不同的形态,2、病毒的增殖,吸附,只能在宿主的活细胞中进行,无细胞结构(核酸衣壳囊膜),原核(细胞壁、膜、质),真核(细胞壁、膜、质、核),真核(细胞膜、质、核),噬菌体烟草花叶病毒流感病毒,细菌(形状菌)放线菌,霉菌、蘑菇、酵母菌,衣藻、草履虫、变形虫,DNA或RNA,DNA,DNA,DNA,增殖：吸附注入合成装配释放,分裂生殖(二分裂),孢子生殖出芽生殖,分裂生殖有性生殖,了解有关培养基的基础知识，进行无菌技术的操作，进行微生物的培养。,一、课题目标：,掌握培养基的制备、高压蒸气灭菌和平板划线法等基本操作技术，熟练、规范地进行无菌操作，成功地培养微生物。,无菌技术的操作。,二、课题重点和难点：,三、技能目标：,一、基础知识：,（一）培养基,培养基（培养液）是由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的混合营养液。,（1）按物理状态来分：培养基可分为固体培养基和液体培养基。其中固体培养基用于菌种分离、鉴定菌落等。（2）按功能来分，可分为选择培养基和鉴别培养基。（3）按成分来分，可分为天然培养基和合成培养基。,1.培养基的类型和用途,2.不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方 (参考教材附录内容),3.不管哪种培养基，一般都含有水、碳源、和氮源、 无机盐、等营养物质，另外还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质,例如:生长因子(即细菌生长必需，而自身不能合成的化合物,如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)以及氧气、二氧化碳、渗透压等的要求。,选择培养基,加入青霉素的培养基: 分离酵母菌、霉菌等真菌加入高浓度食盐的培养基: 分离金黄色葡萄球菌不加氮源的无氮培养基: 分离固氮菌不加含碳有机物的无碳培养基: 分离自养型微生物加入青霉素等抗生素的培养基: 分离导入了目的基因的受体细胞加入氨基喋呤、次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷的培养基: 分离杂交瘤细胞,根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。 合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。 优点：标准化生产，组分和含量相对固定;成本低 缺点： 缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。,合成培养基:,天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。优点：营养成分丰富，培养效果好缺点：来源受限;成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析;易发生支原体污染;,天然培养基：,固体培养基：菌落,4.培养基的用途,液体培养基：增菌固体培养基：纯化，增菌半固体培养基：动力检测，保种,（二）无菌技术,1.无菌技术的概念,无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。无论是随后将要学到的倒平板、平板划线操作，还是平板稀释涂布法，其操作中的每一步都需要做到“无菌”，即防止杂菌污染。只有熟练、规范地进行无菌操作，才可能成功地培养微生物。,（）消毒定义：利用化学或物理方法，杀死大部份致病微生物的过程。区分为高程度消毒、中程度消毒、低程度消毒三种方式。,2.消毒与灭菌的概念及两者的区别,（2）灭菌的定义：,以化学剂或物理方法消灭所有微生物，包括所有细菌的繁殖体、芽孢、霉菌及病毒，而达到完全无菌之过程。 灭菌与消毒技术是微生物有关工作中最普通也是最重要的技术。,1、煮沸消毒法:100煮沸5-6min2、巴氏消毒法：70-75 下煮30min或 80 下煮15min3、化学药剂消毒法:用75%酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒;氯气消毒水源4、紫外线消毒,(1)消毒的方法：,3.常用的消毒与灭菌的方法,1、灼烧灭菌2、干热灭菌：160-170 下加热1-2h。3、高压蒸气灭菌：100kPa、121 下维持15-30min.,(2)灭菌的方法：,最常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌，它可以杀灭所有的生物，包括最耐热的某些微生物的休眠体，同时可以基本保持培养基的营养成分不被破坏。 有些玻璃器皿也可采用高温干热灭菌。为了防止杂菌，特别是空气中的杂菌污染，试管及玻璃烧瓶都需采用适宜的塞子塞口，通常采用棉花塞，也可采用各种金属、塑料及硅胶帽，它们只可让空气通过，而空气中的其他微生物不能通过。 而平皿是由正反两平面板互扣而成，这种器具是专为防止空气中微生物的污染而设计的。,硅胶主要成分是二氧化硅，化学性质稳定，不燃烧硅胶有很强的吸附能力，对人的皮肤能产生干燥作用主要用于仪器、仪表、设备等在密闭条件下的吸潮防锈,无菌技术,3.微生物实验室培养的基本操作程序,1、器具的灭菌2、培养基的配制3、培养基的灭菌4、倒平板5、微生物接种6、恒温箱中培养7、菌种的保存,1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？,2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。（1） 培养细菌用的培养基与培养皿（2） 玻棒、试管、烧瓶和吸管（3） 实验操作者的双手,答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。,答：（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒。,旁栏思考,三、实验操作,1.制备牛肉膏蛋白胨培养基（用于培养细菌）,1计算、称量2溶化3调pH：pH764过滤：这一步可以省去。5分装：分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。6加塞7包扎,操作步骤,8灭菌: 将50ml培养基用玻棒转移至三角锥瓶中，塞上棉花塞，包上牛皮纸，再放入高压蒸气灭菌锅，在压力为100kPa、温度为121，灭菌1530min。将培养皿用旧报纸包裹，放入干热灭菌箱内，在160170 下灭菌2h。 9倒平板: 待培养基冷却到50 左右时，在酒精灯附近倒平板。（倒平板操作见课本）2d后观察平板，无杂菌污染才可用来接种. 10无菌检查： 将灭菌的培养基放入37的温室中培养2448小时，以检查灭菌是否彻底。,倒平板技术,1.培养基灭菌后，需要冷却到50 左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？,问题讨论,答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。,2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？,答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。,3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？,4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？,答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。,答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。,2、纯化大肠杆菌,接种方法有：平板划线法和稀释涂布平板法,平板划线法:通过接种环在琼脂固体培养基表面连续画线的操作,将聚集的菌钟逐步稀释分散到培养基的表面. 在数次画线后,可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体,这就是菌落.,微生物的接种技术,问题讨论,1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？,答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。,2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？,答：以免接种环温度太高，杀死菌种。,3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？,答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。,问题讨论,涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何进行无菌操作？,应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围等等。,微生物的恒温培养,微生物的恒温培养,微生物的恒温培养,菌种的保存,1、临时保藏：接种到固体斜面培养基，菌落长成后置于4冰箱保存。 2、长期保存：甘油冷冻管藏法,四、课题成果评价,（一）培养基的制作是否合格 如果未接种的培养基在恒温箱中保温12 d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。（二）接种操作是否符合无菌要求 如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。（三）是否进行了及时细致的观察与记录 培养12 h与24 h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同，及时观察记录的同学会发现这一点，并能观察到其他一些细微的变化。这一步的要求主要是培养学生良好的科学态度与习惯。,本课题知识小结:,【典例解析】,例1关微生物营养物质的叙述中，正确的是A.是碳源的物质不可能同时是氮源 B.凡碳源都提供能量C.除水以外的无机物只提供无机盐 D.无机氮源也能提供能量,解析：不同的微生物，所需营养物质有较大差别，要针对微生物的具体情况分析。对于A、B选项，它的表达是不完整的。有的碳源只能是碳源，如二氧化碳；有的碳源可同时是氮源，如NH4HCO3；有的碳源同时是能源，如葡萄糖；有的碳源同时是氮源，也是能源，如蛋白胨。对于C选项，除水以外的无机物种类繁多，功能也多样。如二氧化碳，可作为自养型微生物的碳源；NaHCO3，可作为自养型微生物的碳源和无机盐；而NaCl则只能提供无机盐。对于D选项，无机氮源提供能量的情况还是存在的，如NH3可为硝化细菌提供能量和氮源。,答案：D,例2下面对发酵工程中灭菌的理解不正确的是A.防止杂菌污染 B.消灭杂菌C.培养基和发酵设备都必须灭菌 D.灭菌必须在接种前,B,解析：灭菌是微生物发酵过程的一个重要环节。A说的是灭菌的目的，因为发酵所用的菌种大多是单一的纯种，整个发酵过程不能混入其他微生物（杂菌），所以是正确的；B是错误的，因为灭菌的目的是防止杂菌污染，但实际操作中不可能只消灭杂菌，而是消灭全部微生物。C是正确的，因为与发酵有关的所有设备和物质都要灭菌；发酵所用的微生物是灭菌后专门接种的，灭菌必须在接种前，如果接种后再灭菌就会把所接菌种也杀死。,例3右表是某微生物培养基成分，请据此回答：（1）右表培养基可培养的微生物类型是 。（2）若不慎将过量NaCl加入培养基中。如不想浪费此培养基，可再加入 .,自养型微生物,含碳有机物,（3）若除去成分，加入（CH2O），该培养基可用于培养 。（4）表中营养成分共有 类。（5）不论何种培养基，在各种成分都溶化后分装前，要进行的是 。（6）右表中各成分重量确定的原则是 。（7）若右表培养基用于菌种鉴定，应该增加的成分是 。,固氮微生物,3,调整pH,依微生物的生长需要确定,琼脂（或凝固剂）,2、微生物生理学时期 建立了一套独特的研究方法,寻找各种传染病病原菌,巴斯德在观察受狂犬病感染的兔脊髓,巴斯德在工作中,著名的巴斯德研究院,巴斯德在微生物学上的贡献,有机物发酵和腐败由微生物引起解决葡萄酒和啤酒变酸问题创立巴氏消毒法解决蚕茧的“微粒子病”的疾病，挽救了法国蚕丝业主张传染病是由微生物引起的，并可通过接触、唾液及粪便传播19世纪70年代，研究炭疽病，拯救了畜牧业1881年研制成功减毒活疫苗开创人类战胜传染病的新世纪1885年，巴斯德第一次治好了被疯狗咬伤的9岁男孩梅斯特奠定了免疫学基础,微生物方法学和医学微生物学奠基人 科赫,科赫,1882年发现引起结核病的病原分离出结核杆菌创立了微生物学检查方法：固体培养技术、染色技术、实验动物感染发现炭疽杆菌、霍乱弧菌总结了著名的“科赫法则” -确立病原微生物1905年获得了诺贝尔医学和生理学奖,5、下面是有关细菌A的四项实验：实验1：将A 接种于一般培养基上，结果出现菌落。实验2：用一定剂量的紫外线处理A，产生突变种a1。将a1接种于一般培养基后，不出现菌落；但在培养基内添加营养