酒精性肝损伤造模.doc

酒后饮绿茶对小鼠肾功能影响的实验性研究 李佳 陈路军 陈洁 徐立思 齐慧娟 陆妙君指导老师：黄品贤（上海中医药大学03中西（七）上海201203）摘要目的 观察给最佳酒醉状态的小白鼠灌茶对肾功能的影响。方法 检测给小白鼠0.15ml/10g白酒后20min灌入低、中、高浓度茶、解酒阳性对照药枳椇子各0.20ml/10g，连续7天后血肌酐、血尿素蛋及尿蛋白含量。结果 高中浓度茶组、模型组的尿蛋白与正常组相比有显著差异，P0.05。各组生存曲线比较的Log-rank检验结果：2=20.39， P0.01。肾脏病理改变：低浓度茶组小鼠肾小球、肾小管未见明显病变，但间质血管扩张充血明显，有较多量红细胞漏出，可见炎症反应，间质未见纤维化；中浓度茶组肾组织结构完整，肾小球、肾小管未见明显病理变化，间质未见明显充血，少量红细胞漏出，间质未见纤维化；高浓度茶组肾脏组织结构与中浓度茶组接近。阳性对照组肾组织结构基本完整，肾小球、肾小管未见明显病理变化，间质少量充血。结论 根据尿蛋白、实验小鼠的生存曲线分析、肾脏的病理结果的一致性得出：酒后饮茶均可导致小鼠的死亡，但是酒后高浓茶对肾脏的损害作用最小。酒后饮淡茶及阳性解酒药枳椇子能起到一定解酒作用，但对肾脏有明显的损害。但本次实验由于死亡率高致样本含量不够，确切的结论有待继续研究。关键词 酒，茶，小白鼠，肾功能，病理学在中国，茶能解酒是自古以来就流传的说法。日常生活中，人们通常用绿茶来帮助消食解酒，且认为茶越浓解酒效果越好。人们认为，饮茶能够使人大脑兴奋、清醒，酒后饮茶能够让被酒精冲昏了的头脑清醒一些，从而达到“醒酒”的效果。但近年来，有越来越多的报道指出：过量饮酒后饮茶对肾脏有害无益。其理论依据为：绿茶的主要成分茶碱有利尿作用，浓茶中的大量茶碱更能迅速发挥利尿作用，促使尚未分解的酒精代谢产物乙醛过早地进入肾脏，而乙醛对泌尿系统有很大的损害作用。本实验采用56度白酒以最佳致醉量对小鼠灌胃后，用等量不同浓度的绿茶及阳性对照药物枳椇子对醉酒小鼠进行灌胃的方法，通过检测鼠尿中的尿蛋白、血样中血肌酐、尿素氮指标及对肾脏组织病理切片的观察，对以上两种观点的正确性作出验证。现将实验研究结果报告如下。1 材料与方法1.1实验动物：昆明种小鼠120只，体重：20-35g，雌雄各半，由上海中医药大学动物实验中心提供。动物房饲养温度：20-23，相对湿度：50-70，标准饮食，饮自来水。1.2实验仪器和试剂及其制备：1.2.1实验仪器：针筒灌胃针、天平、试剂瓶、代谢笼、离心机、气象色谱仪、生化分析仪等。1.2.2 实验试剂及其制备：1.2.2.1 56度红星二锅头：北京红星酿酒总厂生产。1.2.2.2 绿茶：黄山毛峰（一级，散装）。绿茶制备：低浓度茶：10g 绿茶加入100度蒸馏水1000ml，浸泡30分钟，用两层纱布过滤；中浓度茶：25g绿茶加入100度蒸馏水1000ml，浸泡30分钟，用两层纱布过滤；高浓度茶：40g绿茶加入100度蒸馏水1000ml，浸泡30分钟，用两层纱布过滤。1.2.2.3 枳椇子：由张江孙桥饮片厂提供。枳椇子水煎剂制备：枳椇子25g，加200ml水煎煮1.5小时，纱布过滤，滤渣加200ml水煎煮1小时，过滤，两次滤液合并。提取液含生药62.5mg/ml。1-41.2.2.4 尿蛋白测定试剂盒（考马斯亮蓝法）；尿素氮试剂盒-BUN(OPA法)；肌酐试剂盒-CRE(苦味酸不除蛋白法)。1.3实验方法：1.3.1 预实验：以0.25ml/20g，0.30ml/20g，0.35ml/20g 56度红星二锅头分别对三组小鼠进行灌胃，每组5只。观察令小鼠出现翻正反射消失而无小鼠死亡的所需酒量。找出最佳致醉量为0.30ml/20g。5-61.3.2 动物分组：称重后，按体重将105只小鼠随机分为6组，空白对照组、模型组、枳椇子组，每组17只；低浓度茶、中浓度茶、高浓度茶组，每组各18只。每日11点开始灌胃，连续7天。1.3.3 给药量见下表1。表1 酒后饮绿茶给药量方法组 别第一次灌（0.15ml/10g）20min后再灌空白组0.9生理盐水0.9生理盐水0.2ml/10g造模组白酒0.9生理盐水0.2ml/10g枳 椇 子组白酒枳椇子水煎剂0.2ml/10g高浓度茶组白酒高浓度茶0.2ml/10g中浓度茶组白酒中浓度茶0.2ml/10g低浓度茶组白酒低浓度茶0.2ml/10g 注：每日灌白酒的量相当于成人每天饮用三两酒的量。1.4生化检测及病理检查第8天以小鼠代谢笼法搜集尿样，并断头取血，取肾脏。样品由上海中医药大学附属曙光医院检验科检测生化指标：尿蛋白、血肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）；由曙光医院病理实验室制作病理切片。1.5统计方法：计量资料以均数标准差表示；计数资料用百分率表示。资料经正态性检验和方差齐性检验后，再进行方差分析和LSD检验；以及采用Log-rank检验，用SPSS12.0统计软件处理。2 结果2.1.各组小鼠实验中的死亡情況和各组生存曲线比较的Log-rank检验。见表2。 表2各组小鼠实验中的死亡情況 组别实验前第1天第2天第3天第4天第5天第6天第7天死亡率(%)正常7模型3阳性对照5高浓度茶2中浓度茶2低浓度茶2合 计10523109434656.2 注:各组间有显著差异: P0.05.表3 各组生存曲线比较的Log-rank检验结果组别n平均生存时间（天）95%可信区间生存率(%)正常组176.596.057.1388.24模型组175.474.196.7564.71阳性对照组174.223.015.4333.33高浓度茶组184.393.075.7127.78中浓度茶组183.442.224.6127.78低浓度茶组184.112.965.2727.78合 计10544.34Log-rank检验结果：2=20.39，df=5，P=0.0011。正 常 組模 型 组枳椇子组高浓度茶组中浓度茶组低浓度茶组图2 各组动物生存曲线的比较2.2 各组小鼠尿液中尿蛋白含量比较 见表4。表4各组小鼠尿液中尿蛋白含量比较（mol/l）组别尿蛋白正常组51.320.51#模型组50.730.17*枳 椇 子组51.010.39高浓度茶组50.720.27*中浓度茶组50.640.13*低浓度茶组51.320.65#合计300.950.39注：*表示与正常组比较0.05；#表示与模型组比较0.05 2.3各组小鼠血肌酐（Cr）含量比较 见表5 表5 各组血肌酐的比较(umol/L)组 别nCr 正 常 组434.2527.96模 型 组217.500.71枳 椇 子组00.000.00高浓度茶组427.7512.84中浓度茶组00.000.00低浓度茶组220.500.71合 计1227.0017.37注：n为0，说明该组小鼠血肌酐值不在测定范围，没有测出来。根据专业知识得到血肌酐应该是服从正态分布的资料，但是，本次试验有的组别因未能测到血肌酐，同时，各组样本量比较少，而且个体差异也比较大，经方差分析得出各组间无显著差异。仅作参考。2.4 肾脏病理切片结果： 正常小鼠肾组织（1010）低倍镜下肾组织结构完整，肾小球、肾小管未见异常，间质血管可见正常小鼠肾组织（1040）高倍镜下肾小球、肾小管结构基本正常，间质未见炎性充血 低浓度茶组小鼠肾组织图（1010）低倍镜下肾小球、肾小管未见明显病变、但间质血管扩张充血明显低浓度茶组小鼠肾组织图（1040）高倍镜下见肾小球有较多量红细胞漏出，肾小管上皮未见水肿、间质血管扩张充血较明显，可见有炎症反应，但间质未见纤维化 中浓度茶组小鼠肾组织图（1010）低倍镜下肾组织结构完整，肾小球、肾小管未见明显病理变化，间质未见明显充中浓度茶组小鼠肾组织图（1040）高倍镜下见肾小球有少量红细胞漏出，肾小管未见明显病变、间质血管少量充血，未见纤维化。 高浓度茶组小鼠肾组织图（1010）与中浓度茶组类似，未见明显差异高浓度茶组小鼠肾组织图（1040）与中浓度茶组类似，未见明显差异 枳椇子组小鼠肾组织图（1010）低倍镜下肾组织结构基本完整，肾小球、肾小管未见明显病理变化，间质少量充血枳椇子组小鼠肾组织图（1040）高倍镜下见肾小球有少量红细胞漏出、间质血管未见明显充血，间质未见纤维化 模型组小鼠肾组织图（1010）低倍镜下肾小球、肾小管未见明显病变、但间质血管扩张充血较明显模型组小鼠肾组织图（1040）高倍镜下见肾小球有较多量红细胞漏出，间质血管扩张充血较明显，可见有炎症反应，间质未见纤维化（7）2.5饮酒人群流行病学问卷调查结果： 调查总人数138人，喝酒人135人。喝酒人群中用茶来解酒的有52人，占38.52%。知道茶能解酒的有46人，占喝酒人群的34.07%，其他解酒方式有催吐、吃水果、解酒药、吃饭、睡觉、喝饮料、休息，其中，催吐13.04%；吃水果解酒18.12%；解酒药5.80%；其他28.99%。真正了解饮酒后用茶解酒是否对肾脏有损伤的人为0%。3 讨论3.1 从各组小鼠实验中的死亡情况来分析：实验的前4天，小白鼠死亡率较高，可能与其体质有关，个体差异较大，实验动物选择小鼠，生命力较脆弱，对高度酒精的耐受能力较差。空白组的死亡率又明显低于其他各组，也与所给药物对小鼠的作用有关。通过各组生存曲线比较的Log-rank检验结果可说明各组的生存曲线有显著的差异，饮酒后无论饮高、中、低浓度的茶，都可导致小鼠的死亡，尤其是中浓度组的平均生存时间低于其他任何组别，其次是低浓度组。这说明酒后饮中、低浓度的茶对小鼠的健康很不利，而高浓度茶组的生存时间相对于中、低浓度组较长一些，这一结果与病理切片所得结果的判断是一致的。 在造模方面，我们查到的文献中，小鼠多用于做酒精中毒的急性实验，其实验周期多为1-3天，大鼠多用于做慢性酒精毒理实验，实验周期多为1-4个月。我们的实验周期为八天，介于两者之间，由于实验时间及经费的限制条件，我们选择小鼠造模，而小鼠耐受酒精的能力较差是本实验中死亡率高的重要原因。3.2由尿蛋白按检测结果得出：正常组与阳性组、低浓度组无差别；中、高浓度组，造模组低于正常组。根据这一结果，可推测：适量饮酒有助于降低蛋白在肾脏的滤过率 ，酒后饮用浓茶，此效应更显著；低浓度茶与枳椇子一样，具解酒的功效，中、高浓度茶无；饮酒及酒后饮中、高浓度茶有利尿作用，但小便清长，排出的杂质减少（由尿蛋白及尿量推测，尚需实验进一步证明）。3.3按病理切片结果得出：饮低浓度茶和解酒的枳椇子水煎剂对肾脏有害无益，我们推测其损伤机制如下：酒精首先在肝脏内进行代谢，在氧化酶的作用下先是被氧化为乙醛，进而被氧化为乙酸，乙酸又可进一步被氧化为二氧化碳和水，再分别经肾和肺排出。茶的主要成分茶碱有利尿作用，大量茶碱更能迅速发挥利尿作用，促使尚未分解的乙醛过早地进入肾脏，而乙醛对泌尿系统有很大的损害作用。有关报道指出，茶中的有效成分茶多酚确实可以用于治疗慢性肾脏的疾病。8-9 我们推测：中高浓度茶中的茶多酚含量较多，能有效的保护肾脏使其受到损伤的程度降低，但没有很好地解酒功效。但由于实验周期短，各组小鼠肾脏均未出现纤维化。3.4结论根据尿蛋白、实验小鼠的生存曲线分析、肾脏的病理结果的一致性得出：酒后饮茶均可导致小鼠的死亡，但是酒后高浓茶可降低蛋白在肾小球的滤过率，对肾脏的损害作用最小。酒后饮淡茶及阳性解酒药枳椇子能起到一定解酒作用，但对肾脏有明显的损害。但本次实验由于死亡率高致样本含量不够，确切的结论有待继续研究。建议过量饮酒后,不宜使用茶及能加速酒精不完全代谢产物排出的解酒药，会对肾脏造成损伤。但本次试验由于死亡率高致样本含量不够，确切的结论有待继续研究。3.5存在问题和改进措施3.5.1实验动物选择小鼠，生命力较脆弱，对高度酒精的耐受能力较差。在实验中的死亡率较高。建议以后用大鼠进行此项实验。实验中一些可能影响结果、引起死亡的因素，如：学生灌胃技术不熟练引起死亡、群养的老鼠生活环境温暖，而代谢笼中的老鼠可能由于孤单、环境寒冷、酒精的作用，导致代谢笼中有老鼠死亡。实验第一天灌胃后，见死亡率高，我们考虑到可能是酒量太大，后面几天的酒量按0.10ml/10g灌胃。3.5.2预实验时间过短，只测出酒精的最佳致醉量，未考虑到造模是否稳定，小鼠是否能长时间（实验周期为八天）耐受酒精，以至于出现较高的死亡率。 3.5.3阳性对照组的死亡率也很高，这与药物的来源、药物的制备是否科学有关。3.5.4各个浓度的茶的浓度界定不是很精确，每天制备的环境、条件有差异，也可能造成实验结果的偏差。应该选用倍比稀释的方法更为科学。3.5.5实验中代谢笼的数量有限，只有三十个，导致最终的实验检验的指标的样本含量相对较少，使结果的可信度降低。3.5.6代谢笼的网眼过大，使第一天和第二天搜集到的尿样中混有食物残渣，导致搜集的尿液无法用于检测。在最后一天搜集尿样时，我们采取了给小鼠禁食的方法，收集到了较纯净的尿液，符合检验样本的标准。此外，有老鼠从代谢笼中逃跑的现象。建议实验前对代谢笼的结构进行调整。3.5.7小鼠的血量小，加上经过8天的酒精试验，小鼠本身的状态不稳定，取血时遇到一定的困难，腹主动脉较细小，取血量少，之后采用断头处死取颈动脉血，采集到的血量也少，在1ml左右。送检时离心血浆量只有几百微升，以至于血肌酐和血尿素氮这两项指标的检测数据很不理想。此外，曙光医院检验设备的测定范围是以人的指标范围为标准的，小鼠的血肌酐和尿素氮的测定，部分不在此范围，对我们最终结果的统计分析有影响。3.5.8标记小鼠不够清楚，用苦味酸做的黄色标记最后模糊掉了，具体代表号码全然不知，之后我们改用胶布贴在老鼠身上作标记，但老鼠在代谢笼中活动时，会将胶布蹭掉。3.5.9我们选取的酒精灌胃剂量可能正好是健康饮酒的范围，不仅对肾脏没有损伤，反而还起到一定的保护作用。参考文献：1 孙法光，王宏枳椇饮水提取物对小鼠急性酒精中毒的保护作用承德医学院学报，2006，23（1）：81-822 梁赅，詹莉，汪晖，等人参和枳椇子对小鼠乙醇急性中毒保护作用及其机制研究医学新知杂志2006，16（2 ）3 于斌如，汤银红枳椇子的研究进展时珍国医国药2004，15（9） 4 时涛，王晓玲，陈振德，等枳椇子化学成分及其药理活性研究进展中药材2006，29 （5 ）55 张健，张惟广，谢非饮