液相色谱的柱和系统故障检修

2017/11/3,1,六、色谱柱和色谱系统的故障检修,每个HPLC使用者应该知道什么,2017/11/3,2,HPLC 的组成,泵进样器/自动进样器色谱柱检测器数据系统/积分仪表所有这些部件可能出现故障而需要检修。,2017/11/3,3,HPLC 的组成,2017/11/3,4,色谱柱问题的类型,A. 压力 B. 峰形 C. 保留时间,2017/11/3,5,A压力问题,色谱柱观测 潜在的问题 压力高 堵塞滤头 色谱柱污染 堵塞填料,2017/11/3,6,查出原因 纠正压力,有无柱子时检查压力 去柱后 去柱前 去预柱. 许多压力问题是由于系统或保护柱的阻塞如果柱压高:冲洗柱子:排除柱污染和填料堵塞 包括：高分子量被吸附化合物 样品或缓冲液中的沉淀物反冲柱子清洁阻塞的滤头更换滤头,2017/11/3,7,Column Cleaning 柱子清洗,用比你的流动相更强的溶剂冲洗为了增加强度选择反相溶剂 对于分析柱每种溶剂至少用25 ml 冲洗没有缓冲盐的流动相100% Methanol 甲醇100% Acetonitrile 乙腈75% Acetonitrile :25% Isopropanol 75 %乙腈 ：25异丙醇100% Isopropanol 异丙醇100% Methylene Chloride 二氯甲烷100% Hexane 已烷当用已烷蔌二氯甲烷柱子时,必须先用异丙醇冲洗,然后再用你的反相流动相,2017/11/3,8,柱子清洗,为了增加强度选用正相溶剂或： 每种溶剂至少用50 ml 50% 甲醇 : 50% 氯仿 乙酸乙酯,2017/11/3,9,怎样更换滤头,柱进口滤头戴手套不要让底座干燥不要使柱身受热,否则填料会喷出不要旋得太紧旋好尾端螺母旋好尾端螺头,2017/11/3,10,压力问题的预防,柱保护 保护柱/预柱在线过滤器样品预处理适当的柱冲洗过滤缓冲流动相,2017/11/3,11,压力问题的预防:在线装置,Mobile Phase Pre-Column Injector Filter GuardFrom Pump 预柱 进样器 滤头 Column从泵来的流动相 保护柱 Analytical ColumnFilter and Guard Column Act on Sample 分析柱 滤头和保护柱作用于样品 Pre-Column Acts on Mobile Phase 预柱作用于流动相 To Detector 到检测器,2017/11/3,12,压力问题的预防:样品制备,溶剂/化学环境微粒/凝聚物的除去 Filter samples 过滤样品 Centrifugation 离心分离 固相萃取 薄层板 生物膜,2017/11/3,13,B峰形问题,Split peaks 裂峰 Peak tailing 峰拖尾 Broad peaks 宽峰Poor efficiency 低柱效许多峰形问题是结合在一起的-例如:展宽和拖尾或拖尾和保留时间增加,2017/11/3,14,裂峰,可能的原因: Column contamination 柱污染 Partially plugged frit 部分阻塞滤片 Column void 柱头塌陷 Injection solvent effects 溶剂效应,2017/11/3,15,裂峰柱污染,Column: StableBond SB-C8, 4.6 250mm, 5mMobile Phase:60%25mM Na2HPO4,pH3.0 : 40%MeOHFlow Rate: 1.0 mL/min Temperature: 35CDetection: UV 254 nmSample: 1. Pseudoephedrine 2. APAP 3. Unknown 4. ChlorpheniramineInjection 1 峰3 峰形较好Injection 30 峰3 裂峰Injection 1 After Column Wash with 100% CAN经100%乙腈冲洗后 峰3 峰形极好,2017/11/3,16,裂峰溶剂化效应,Column: StableBond SB-C8, 4.6 250mm, 5mMobile Phase: 82%H2O : 18%ACNInjection Volume: 30 L Sample: 1. Caffeine 咖啡因 2. Salicylamide 水杨酰胺A. Injection Solvent B. Injection Solvent 100% Acetonitrile Mobile Phase 峰形宽拖尾 峰形尖锐对称样品溶剂尽可能与流动相匹配,2017/11/3,17,裂峰原因的确定,复杂样品的基质或分析许多样品 - 柱污染或部分阻塞滤片 流动相 pH=7 - 由于硅胶溶解使柱塌陷(除非使用专门的柱子) -预柱与柱的塌陷样品的量大 -裂峰和宽峰,由样品量来决定,2017/11/3,18,峰拖尾、变宽和柱效降低,可能的原因 柱“次级效应”（硅醇基效应）柱塌陷柱污染柱老化柱负荷超载柱外效应,2017/11/3,19,峰拖尾柱“次级效应”（扫尾剂）,Column: Alkyl-C8, 4.6 150mm, 5mMobile Phase:85%25mM Na2HPO4,pH7.0 : 15%ACNFlow Rate: 1.0 mL/min Temperature: 35CSample: 1. Phenylpropanolamine 苯丙醇胺去甲麻黄碱 2. Ephedrine 麻黄碱 3. Amphetamine 安非他明苯丙胺4. Methamphetamine 脱氧麻黄碱 5. Phenteramine 苯三胺No TEA 无三乙胺 10 mM TEA 10 mM 三乙胺USP TF(5%) 美国药典拖尾因子 USP TF(5%) 美国药典拖尾因子1. 1.29 1. 1.192. 1.91 2. 1.18 3. 1.63 3. 1.204. 2.35 4. 1.265. 1.57 5. 1.14用流动相减尾剂(三乙胺)在pH 7 消除峰拖尾,2017/11/3,20,峰拖尾柱“次级效应”（PH值）,Column: Alkyl-C8, 4.6 150mm, 5mMobile Phase:85%25mM Na2HPO4,pH7.0 : 15%ACNFlow Rate: 1.0 mL/min Temperature: 35CSample: 1. Phenylpropanolamine 苯丙醇胺去甲麻黄碱 2. Ephedrine 麻黄碱 3. Amphetamine 安非他明苯丙胺4. Methamphetamine 脱氧麻黄碱 5. Phenteramine 苯三胺 pH 3.0 pH 7.0 USP TF(5%) 美国药典拖尾因子 USP TF(5%) 美国药典拖尾因子4.脱氧麻黄碱 1.33 4.脱氧麻黄碱 2.35降低流动相的pH ,减小与硅醇基作用引起的峰拖尾,2017/11/3,21,峰拖尾柱污染,Column: StableBond SB-C8, 4.6 250mm, 5mMobile Phase: 20% H2O : 80% MeOH Flow Rate: 1.0 mL/min Temperature: R.T. Detection: UV 254 nmSample: 1. Uracil 尿嘧啶 2. Phenol 苯酚 3. 4-Chloronitrobenzene 4-氯硝基苯 4. Toluene 甲苯Plates TF Plates TF Plates TF理论板数 拖尾因子 理论板数 拖尾因子 理论板数 拖尾因子1. 7629 2.08 1. 7906 1.43 1. 7448 1.062. 12043 1.64 2. 12443 1.21 2. 12237 1.213. 13727 1.69 3. 17999 1.19 3. 15366 1.114. 13355 1.32 4. 17098 1.25 4. 19067 1.17QC test forward direction QC test reverse direction QC test after cleaning 100% IPA, 35C 向前方向 相反方向 100%异丙醇冲洗后,2017/11/3,22,峰拖尾/变宽样品过载效应,Column: 4.6 150mm, 5mMobile Phase:40%25mM Na2HPO4,pH7.0 : 60%ACNFlow Rate: 1.5 mL/min Temperature: 40CSample: 1. Desipramine 去郁敏/脱甲基丙米嗪 2. Nortriptyline 3. Doxepin 4. Imipramine 丙米嗪 5. Amitriptyline 阿米替林 6. Trimipramine,2017/11/3,23,峰拖尾/变宽样品过载效应,USP TF 拖尾因子 Plates 理论板数 High Load / 10 Low Load High Load / 10 Low Load高载负/10倍 低载负 高载负/10倍 低载负1. 1.60 1.70 850 59412. 2.00 1.90 815 78423. 1.56 1.56 2776 6231 4. 2.13 1.70 2539 8359 5. 2.15 1.86 2735 10022 6. 1.25 1.25 5189 10725,2017/11/3,24,峰变宽,裂开 柱塌陷（ pH ）,Mobile Phase:流动相：50%CAN : 50%Water : 0.2%TEA (pH 11)50乙腈 : 50水 : 0。2三乙胺 (pH 11) After 30 injections Initial 开始时 进样30次后多数峰形改变可能是同一柱问题引起的。在这个例子中，高pH溶解硅胶导致塌陷,2017/11/3,25,峰变宽,裂开 柱塌陷（迟到的峰）,Column: Extend-C18, 4.6 150 mm, 5 mMobile Phase: 40% 10 mM TEA, pH 11 : 60% MeOHFlow Rate: 1.0 mL/min Temperature: R.T. Detection: UV 254Sample: 1. Maleat 顺丁烯二酸 2. Pseudeophedrine 伪麻黄碱 3. Chlorphenniramine 氯非尼拉明理论板数极低的理论板数表明这是一个前面进样极迟洗脱出来的峰,2017/11/3,26,峰拖尾 进样器密封性差,Column: Bonus-RP, 4.6 75mm, 3.5mMobile Phase: 30% H2O : 70% MeOH Flow Rate: 1.0 mL/min Temperature: R.T. Detection: UV 254 nmSample: 1. Uracil 尿嘧啶 2. Phenol 苯酚 3. N,N-Dimethylaniline N,N-二甲苯胺Plates TF Plates TF 理论板数 拖尾因子 理论板数 拖尾因子 1. 2235 1.72 1. 3670 1.452. 3491 1.48 2. 10457 1.09 3. 5432 1.15 3. 10085 1.00 之前 转动杆和隔离密封垫检修后仪器保养超期可能引起峰形问题/进样器划痕,2017/11/3,27,峰拖尾原因的确定,流动相评价柱选择 减小进样量消除柱外效应冲洗柱子检查柱子老化/塌陷,2017/11/3,28,C保留时间问题,保留时间改变容量因子改变选择性改变,2017/11/3,29,相同柱子上保留时间改变,超时,可能的原因:柱老化柱污染不够平衡柱/流动相组成差改变流动相改变流速其他仪器问题,2017/11/3,30,流动相改变引起保留时间改变,60%MeOH:40% 0.1% TFA Fresh TFA Added to Mobile PhaseVolatile TFA evaporated/degassed from mobile phase. 易挥发的三氟乙酸从流动相中蒸发/挥发。Replacing it solved problem. 换用新的流动相就解决问题。使用有机挥发性酸时，流动相应新配。柱老化平衡不够引起保留时间选择性改变,2017