第一章-植物组织培养实验室的构建与操作技术.ppt

第二章植物组织培养实验室的构建与操作技术 主要内容组织培养实验仪器设备及使用方法培养基的制备方法和步骤外植体的灭菌方法无菌操作技术褐变和玻璃化原因及应对措施 实验室设计原则 保证无菌操作 达到工作方便 防止污染 实验室的大小应取决于工作的目的和规模按组织培养流程来设计 避免某些环节倒排 引起日后工作混乱利用一定的设备 器材和特殊的实验室结构设计 达到严格无菌的条件 第一节植物组织培养实验室及主要设备 一 实验室设计与设备 组培的常见技术路线 外植体 愈伤组织 不定芽 生根 再生植株基本的工艺流程 容器具洗涤 物质准备 配置培养基并灭菌 外植体消毒与无菌操作接种 观察 记录 处理 脱分化 再分化 继代 再生植株 标准的组培实验室洗涤室 准备室 无菌室 培养室 观察室等基本组培实验室准备室 含配药室 缓冲间 无菌操作室 培养室 功能 进行一切与实验有关的准备工作器皿洗涤 药品的配制培养基配制与分装培养基和培养器皿的灭菌培养材料的预处理等要求 明亮 通风便于多人同时工作地面应便于清洁 并应进行防滑处理 1 准备室 化学实验室 准备室主要仪器设备 工作台药品柜冰箱普通冰箱 低温冰箱等 主要用于贮存母液 各种易变质 易分解的化学药品以及植物材料等 天平感量0 001g的分析天平 感量0 0001g的电子天平 用于称量微量元素和一些较高精确度的实验用品 感量为0 1g的托盘天平 用于称取用量较大的糖和琼脂等 放置在水平 干燥 不受震动的操作台上 5 恒温水浴锅 6 蒸馏水发生器蒸馏水用于配制母液或培养基 普通实验可以用自来水代替蒸馏水 7 电炉 8 高压灭菌锅进行培养基 水和器械用具的灭菌 不锈钢蒸馏水器 单蒸水 9 酸度计测定培养基及酶制剂的pH值 普通实验可使用pH试纸 10 烘箱干燥洗净的玻璃器皿 也可用于干热灭菌和测定干物重 11 摇床振荡培养 12 离心机分离培养基中的细胞以及解离细胞壁后的原生质体 PHS 802中文台式酸度计 通用型或经济型酸度计 全温型恒温培养摇床 多振幅高速轨道摇床 缓冲室 注意门的朝向 工作人员在此换上工作服 拖鞋 戴上口罩功能减少人体从外界带入的尘埃等污染物 要求缓冲间需3 5平方米 应保持清洁无菌 有清洁的实验用拖鞋 已灭菌过的工作服 1 2盏紫外灯定时照射 对衣物及空间进行灭菌 无菌操作室 接种室 功能外植体消毒 接种 培养物的转移 试管苗的继代 原生质体的制备等要求环境干爽 清洁 居于上风位空间宜小不宜大地面 天花板及四壁密闭光滑 无卫生死角室内物品越少越好 尽可能减少空气流动维护方法定期消毒 紫外线照射 气雾熏蒸 药品喷洒 及时维护 干燥 洁净 接种室主要设备及用具 接种箱主体为玻璃箱罩 入口有袖罩超净工作台操作台面半开放 方便 操作舒适 通过过滤的空气连续不断吹出 大于0 03um直径的微生物很难在工作台的操作空间停留解剖镜分离微茎尖 转基因等无菌操作用的器具酒精灯 镊子 解剖刀 解剖刀片 剪刀 培养瓶 刀剪架等 培养室 功能接种的材料进行培养生长的场所 其设计以充分利用空间和节省能源为原则 要求 能控制光照和温度保持相对的无菌环境有排风窗和换气扇等培养室的换气装置有适宜的培养架 日光灯照明 主要设备培养架 培养箱 空调机 除湿机 换气扇 臭氧发生器等 小型臭氧发生器 二 培养器皿及用具 1 培养器皿 包括玻璃器皿和塑料器皿 各种规格的培养皿 三角瓶 试管 培养瓶 2 微孔过滤器 细菌过滤器 0 45微米 抽滤灭菌用 如激素3 器械用具镊子 剪刀 解剖刀 接种针 铲 等 思考题 1 一个正规的组织培养实验室应具备哪些房间 2 组织培养常用的设备有哪些 各有何用途 第二节培养基及其配制 定义 培养基 culturemedium 根据植物生长所需营养成分 配制成的供植物生长的人工制作的营养物质 是植物组织培养的重要基质 不同植物的组织对营养有不同的要求 甚至同一种植物不同部位的组织对营养的要求也不相同没有一种培养基能够适合一切类型的植物组织或器官找到一合适的培养基 是培养成功的基础 一 培养基成分 主要为 水无机盐有机化合物生长调节物质培养体的支持材料 水 水是植物体的重要组成成分 是一切代谢过程的介质和溶媒 是生命活动过程中不可缺少的物质 培养基大部分是水 固体培养基约75 80 天然水或自来水不能直接用于培养基配制原生质体培养 细胞培养及分生组织培养一般应用双蒸水或超纯水 大批量快速繁殖培养 可用单蒸水或纯净水 保持母液及培养基成分的精确性防止贮藏过程发霉变质 无机盐类 inorganicelement 离体组织生长发育的基本成分 根据植物对必需元素需要的量 可以分为 大量元素微量元素 大量元素指植物所需元素的浓度大于0 5mmol L的元素 有C H O N P K Ca Mg S 除C H O外 其它矿质元素通常以一定浓度的无机化合物形式 按一定比例配制而成 溶于水中以离子态被吸收N有硝态氮KNO3和铵态氮 NH4 2SO4两种形式 一般NH4 N对植物生长较为有利 微量元素 浓度小于0 5mmol L的元素 有Fe Cu Zn等 铁盐在合成叶绿素中起重要作用 缺铁影响到胚的发育 阻碍子叶变绿 3 有机化合物 organiccompound 基本培养基 只含有大量和微量元素 为使培养物的生长更好 还需添加各种有机成分 糖类 维生素 醇类 嘌呤 氨基酸等 糖类 碳水化合物 碳源 维持培养基的渗透压在1 5 4 1MPa 多使用蔗糖 不同浓度会影响细胞的增殖分化 试管苗生长与繁殖浓度2 3 幼胚培养4 6 某些特殊培养中用8 10 细胞和原生质体培养还用麦芽糖 葡萄糖 果糖 维生素明显的促进离体培养物的生长 盐酸硫胺素 VB1 盐酸吡哆醇 VB6 烟酸 生物素 抗坏血酸 Vc等 一般用量为0 1 1 0mg L 肌醇 环己六醇 促进胚状体和芽的形成 用量一般50 100mg L 氨基酸常用甘氨酸和多种氨基酸混合物 水解酪蛋白 水解乳蛋白 用量在10 1000mg L之间 营养丰富 极易引起污染 如在培养中无特别需要 以不用为宜 天然复合物 包括部分蛋白质水解物 其成分比较复杂 大多含氨基酸 激素 酶等一些复杂化合物 对细胞和组织的增殖与分化有明显的促进作用 但对器官的分化作用不明显 成分大多不清楚 一般尽量避免使用 椰乳使用最多 效果最大 用量为10 20 愈伤 细胞培养 香蕉汁用量为150 200ml L 缓冲pH值 兰花组培 马铃薯用量为150 200g L 缓冲pH值 其他酵母提取液 麦芽提取液 苹果和番茄的果汁等 遇热较稳定 大多在培养困难时使用 有时有效 生长调节物质 植物激素 植物激素 hormone 是植物新陈代谢中产生的天然化合物 能以极微小的量影响到植物的细胞分化 分裂 发育 影响到植物的形态建成 开花 结实 成熟 脱落 衰老和休眠以及萌发等多种生理生化活动 是培养基的关键物质 主要包括 生长素 细胞分裂素 赤霉素 生长素0 05 5mg L细胞分裂素0 05 10mg L 生长素类 auxin 生长素主要被用于诱导愈伤组织形成 促进细胞脱分化 诱导根的分化和促进细胞伸长生长 天然的生长素热稳定性差 高温高压或受光条件易被破坏 在植物体内也易受到体内酶的分解 组织培养中常用人工合成的生长素类物质常用IAA IBA NAA 2 4 D配成1mg ml的溶液贮于冰箱中 IAA 天然生长素 亦可人工合成 其活力较低 是生长素中活力最弱的激素 对器官形成的副作用小 高温高压易被破坏 受光也易分解NAA 启动能力比IAA高出3 4倍 可大批量人工合成 耐高温高压 不易被分解破坏 应用较普遍IBA 促进发根能力较强NAA和IBA广泛用于生根 并与细胞分裂素互作促进芽的增殖和生长 2 4 D 启动能力比IAA高10倍 特别是促进愈伤组织的形成 同时强烈抑制芽的形成 影响器官的发育 适宜的用量范围较狭窄 过量常有毒效应 腺嘌吟的衍生物 包括6 BA Kt Zt等 其中Zt活性最强 但非常昂贵 常用的是6 BA 作用 诱导芽的分化促进侧芽萌发生长促进细胞分裂与扩大 茎增粗 抑制根的分化 延缓衰老多用于诱导不定芽的分化 芽的增殖 细胞分裂素类 cytokinin CTK 赤霉素 gibberellicacid 有20多种 培养基中添加的是GA3 一般极少使用作用促进幼苗茎的伸长生长促进胚发育成小植株 离体培养下 还与生长素协调作用对形成层分化有影响当生长素 赤霉素比值高 木质部分化 比值低 韧皮部分化 打破休眠 促进种子 块茎 鳞茎等提前萌发 在器官形成后 添加赤霉素有时可促进器官或胚状体的生长 激素配比模式 生长素 细胞分裂素的比值决定分化发育的方向 是愈伤组织 长根还是长芽 生长素与细胞分裂素同时使用有协调作用 同时其在培养基中的绝对值也会影响外植体分化发育的方向 Growthmediumisoptimisedforregenerationofplantlets Nosucrose 0 Sucrosereducedto1 Sucroseincreasedto5 Theexplantiscompletelycoveredwithgreenshoots androotsaredevelopingonthelowersurface Veryfewshootshavedevelopedontheexplant Norootsandnocallus Shootsdevelopedonedgesofuppersurface andsomerootdevelopmenthasoccured Shootshavedevelopedoverthesurfaceoftheexplant alongwithrootsfromthelowersurface Theresultiscomparablewiththecontrolmedium tissuecultureintheAfricanViolet No6 BA 6 BAreducedto0 1mg l 1 NoNAA Poorshootdevelopmentandnoroots Extensivecallusgeneration Poorshootdevelopmentandnoroots NAAreducedto0 1mg l 1 Morebalanceddevelopmentofrootsandshoots However undifferentiatedcallusisdevelopingattheedgesoftheexplant Profusedevelopmentofrootsandareducednumberofshoots Undifferentiatedcallusisdevelopingattheedgesoftheexplant NAAincreasedto5 0mg l 1Profusedevelopmentofrootsovertheexplantupperandlowersurface andfewshoots Somecallus NoMSsaltsNosignofregenerationfromexplantatall MSsaltsreducedto0 47g l 1Somerootgrowthbutreduceddevelopmentofshoots MSsaltsincreasedto9 52g l 1Shootsdevelopedonuppersurfaceofexplant Norootsorcallus 其它附加成分 琼脂 agar 是一种由海藻中提取的高分子碳水化合物 本身并不提供任何营养 组织培养中最常用作凝固剂 是最方便 最好的凝固剂和支持物 常用量6 10g L 不是培养基必需成分 活性炭 activecarbon 常用的吸附剂 某些培养类型中 可以吸附培养过程中产生的一些有毒物质 有利于培养物的生长 常用浓度0 5 左右 其吸附作用选择性较差 常受温度影响 低温吸附效果好 高温吸附能力降低甚至解吸附 二 常用培养基的种类 配方及特点 培养基种类根据作用分 诱导培养基 诱导外植体启动生长 增殖培养基 诱导离体培养苗扩大繁殖 生根培养基 诱导离体培养苗生根 根据营养水平分 基本培养基 包含无机盐等基本营养成分 完全培养基 包含使植物离体生长全面营养 培养基的种类 1681 出现由无机盐组成的Sacks和Knop溶液 至今仍在作为基本的无机盐培养基40年代多用White培养基60年代至今大多采用MS等高浓度培养基 可以保证培养材料对营养的需要 由于浓度高 在配制 消毒过程中某些成分有些出入 也不致影响培养基的离子平衡 培养基的名称 多以发明人的名字来命名 也有对某些成分进行改良称作改良培养基 MS培养基无机盐和离子浓度较高 硝酸盐含量较其他培养基为高 B5培养基含有较低的铵 双子叶植物特别是木本植物许多都适于用B5 White培养基1963年又作了改良 称作White改良培养基 无机机盐数量较低 适于生根培养 N6培养基成分较简单 KNO3和 NH4 2SO4含量高 广泛应用于小麦 水稻及其他植物的花药培养和其他组织培养 KM 8P培养基有机成分较复杂 它包括了所有的单糖和维生素 广泛用于原生质融合的培养 三 培养基的配制 母液的配制和保存母液是欲配制液的浓缩液保证各物质成分的准确性 减少微量元素用药称量误差配制时能快速移取 减少称药麻烦便于低温保藏 一般母液配成比所需浓度高10 100倍 注意事项 浓度高耐贮存 但准确度低 浓度过低不耐贮避免不恰当混合引起沉淀母液保存在5 冰箱中 出现沉淀 霉变的不能使用母液浓缩倍数 称取药物的量 1000ml 每升培养基需药物量 母液体积 大量元素可以混在一起配制成10 100倍液 常用50倍 高浓度的Ca2 和Mg2 会与磷酸盐混合 产生不溶性沉淀 应单独配制 或者单独配制CaCl2也可 微量元素可配成50 1000倍 常用100 200倍 混合母液 KI可单独配 铁盐硫酸亚铁和EDTA钠盐易沉淀 需单独配制 配成100 200倍鳌合剂不易沉淀 有机化合物维生素 肌醇 氨基酸等一起配成100或200倍液 也可分别配制 激素每种单独配成母液储于冰箱 浓度一般为0 5 1mg ml 一般一次只配50ml或100ml 激素难溶于水 配制母液时用95 酒精或1NHCl 1NNaOH溶解后再定容 生长素类用NaOH 细胞分裂素用HCl溶解 6 有机附加物椰乳液体胚乳 纱布滤渣 80 水浴滤液 20分钟 过滤 去蛋白 高温高压灭菌 冰箱保存酵母提取液酵母粉 加水煮沸30分钟 过滤去渣 消毒 培养基的配制及灭菌培养基配制程序 取适量蒸馏水放入容器将母液取出混合将琼脂和糖加入容器蒸馏水定容至所需体积调整p 分装培养瓶培养基的灭菌 湿热灭菌法 灭菌15 20min某些遇热不稳定的物质如IAA ZT等进行过 抽 滤灭菌 第三节外植体的选择与培养 植物细胞组织培养的成败除与培养基的组分有关外 另一个重要因素就是外植体本身 为了使外植体适于在离体培养条件下生长 使组织培养工作顺利进行 有必要对外植体进行选择与处理 一 外植体的选择 有代表性的主要植物优良的种质 特殊的基因型在植株生长的最适时期取材 花药培养在单核期取材 大小一般在0 5 1 0cm之间 胚胎培养或脱毒在0 5cm以下 材料太大易污染 材料太小难于成活 从生长健壮的无病虫害的植株上选取发育正常的器官和组织 最好采用茎尖 后代性状较稳定 携带细菌较少 二 外植体的灭菌 外植体选取流水冲洗 转入超净工作台 70 酒精表面消毒20 60s无菌水冲洗消毒剂处理无菌水充分洗净备用三 外植体的接种 无菌操作 外植体的接种是把经过表面灭菌后的植物材料切碎或分离出器官 组织 细胞 转放到无菌培养基上的全部操作过程 整个过程均需无菌操作 1 借助接种用工具将材料切割分离 2 将培养基放入超净工作台内 火焰灼烧培养基瓶口 然后打开培养瓶口 置培养瓶为斜角 避免灰尘杂菌落入瓶中 3 迅速将切割分离下的所需组织 细胞 器官 放入培养基上 及时盖上瓶盖 4 工具用后应及时灭菌 避免交叉污染 5 工作人员操作时禁止不必要的谈话 四 外植体的培养 主要因素 光照 温度 湿度 氧气 光照光照强度 光质以及光照时间 对细胞的增殖 器官的分化都有很大影响 除特殊要求外 一般都采用日光灯作光源 光照强度1000 5000Lx 根据不同植物或器官需要 可以每天连续光照12 16小时 也可每天光照16小时 8小时黑暗 温度大所数植物最适温度在23 32 之间 培养室温度是25 2 湿度培养瓶内相对湿度常是100 培养室一般要求相对湿度保持在70 80 相对湿度过低影响培养物生长和分化 应向室内喷洒水 以提高湿度 过高杂菌滋生 大量污染 应及时地通风除湿 氧气接种时要有部分组织和空气接触 振荡培养是解决通气的良好办法 固体培养中 如瓶塞不透气 培养物也不能生长 要选择通气性好的培养瓶盖 增加可利用的氧气 迅速除去释放出来的CO2 有利于外植体外层细胞开始分裂 pH值不同的植物对培养基最适pH值的要求也是不同的 大多在5 6 5左右 一般培养基皆要求5 8 这基本能适应大多植物培养的需要 五 外植体的成苗途径 外植体的成苗途径有三种 一 外植体 愈伤组织 完整植株同时长芽和根 植株芽 根 植株根 芽 植株 二 外植体 胚状体 植株器官上愈伤组织游离单细胞小孢子诱导胚状体比诱导芽数量多 速度快 结构完整 三 外植体 直接形成根与芽 植株 六 培养中常见问题 一 污染病原菌 细菌 真菌 细菌污染 菌斑呈黏液状 接种后1 2天发现 污染途径 外植体带菌 培养基及器皿灭菌不彻底操作人员未遵守操作规程 真菌污染 污染部分长有不同颜色的霉菌 接种后3 10天发现 污染途径 周围环境不清洁 超净工作台过滤装置失效 培养瓶的口径过大 在组织培养过程中培养基和培养材料滋生杂菌 导致培养失败的现象 2 污染的预防措施 6点 防止材料带菌的措施茎尖作外植体时 进行预培养 无糖 或暗培养 以新抽嫩枝作外植体 晴天取材 下午取材 经日晒可杀死部分细菌或真菌接种时除去外部韧皮组织 只接内部的分生组织 2 外植体的灭菌多次灭菌法 次氯酸钠 无菌水 次氯酸钠多药剂交替法 肥皂水 酒精 次氯酸钠 无菌水 器皿与金属器械的灭菌玻璃器皿可采用湿热灭菌或干热灭菌金属器皿一般火焰灭菌 也可干热灭菌 135 140摄氏度灭菌3 5h 160 170摄氏度灭菌2 4h 180 200摄氏度灭菌0 5 1h 布质制品的灭菌湿热灭菌 无菌操作室的灭菌2 新洁尔灭或70 酒精擦拭 喷雾 紫外灯照射 定期甲醛和高锰酸钾熏蒸 严格按照无菌操作程序进行 在干燥环境 如火焰或干热空气 进行灭菌的技术 二 褐变 基因型外植体的生理状态幼年的材料 分生组织含醌类物质较少培养基的成分无机盐浓度过高生长调节物质使用不当 BA过多培养条件不适宜 温度过高或光照过强材料转移时间时间过长引起材料褐变 外植体体内的多酚氧化酶被激活 使细胞内的酚类物质氧化成棕褐色的醌类物质 这种致死的褐变物向外扩散致使培养基逐渐变成褐色 抑制其它酶的活性 影响外植体的分化 最后变褐死亡的现象 1 影响因素 选择适宜的外植体及最佳培养基 提高转管率 加抗氧化剂 抗坏血酸 PVP 牛血清白蛋白等 加活性炭0 1 0 5 活性炭 2 褐变的防止措施 三 玻璃化 Vitrification 组培苗外观形态呈半透明状的生长异常现象 叶 嫩梢呈水晶透明或半透明水浸状 矮小肿胀失绿 叶片皱缩卷曲 脆弱易碎叶表几无角质层蜡质 没有功能性气孔 不具有栅栏组织 仅有海绵组织体内含水量高 干物质低 光合能力和酶活性降低 组织畸形 器官功能不全 分化能力降低生根困难 很难继续培养和移栽成活 激素 CTK浓度 比例过高 继代次数太多 琼脂 琼脂浓度低 培养基太 稀 温度 低温 光照时间 光照太多 太强 通风条件 气体交换不良 6 离子水平 无机离子种类及比例不当 主要原因 提高蔗糖和琼脂浓度 提高渗透势 适当降低细胞分裂素和赤霉素浓度 增加生长素比例适当增加Ca Mg Mn K P Fe Cu 降低N 铵态氮 和Cl 重选或改良培养基配方 增加自然光照 1000 1800lx 控制光照时间8 12h 适温生长 热击处理使用透气性好的封口膜培养基中加入青霉素 间苯三酚 根皮苷或多效唑等 预防措施 第四节试管苗的驯化与移栽 一 试管苗的特点1 试管苗的生态环境 高 恒温试管苗整个生长过程中采用的是恒温培养 温差很小 并且温度一般控制在25 2 甚至更高 外界环境条件温度不断变化 其调节由太阳辐射决定 温差很大 季节 日夜 而且一般不会达到25 2 组织培养出来的苗通称试管苗或组培苗 高湿试管瓶内水分移动途径有两条