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中药指纹图谱质量控制技术 1 内容提要 中药指纹图谱的活性标识与实例中药指纹图谱的评价技术中药指纹图谱研究中的关键问题 2 中药指纹图谱的活性标识与实例 指纹图谱将天然产物多种药效指标化学成分表示在一张或多张图谱上 但是目前大部分研究还只是对天然有机成分色谱图谱的化学构建进行研究 目前构建的图谱 只不过是 活性提取物 的色谱指纹图谱 没有与药效活性 合二为一 3 中药指纹图谱的活性标识与实例 那么 问题来了 4 中药指纹图谱的活性标识与实例 能否在研究天然产物有机化学成分指纹图谱的同时 获得这些有机物质的活性作用通路 并同时发现活性先导化合物 构建 有机成分活性指纹图谱 5 中药指纹图谱的活性标识与实例 答案 发展中药指纹图谱的活性标识技术 6 中药指纹图谱的活性标识与实例 实例 丹参药效成分丹酚酸抗氧化活性指纹图谱构建大量药理研究资料分析 丹酚酸最基本的作用是清除自由基 抗脂质过氧化和氧化性损伤 为了证明丹酚酸的抗氧化效果能反映丹参水溶性成分指纹图谱的药理作用 利用丹酚酸的HPLC DPPH自由基在线清除活性指纹标识技术 7 中药指纹图谱的活性标识与实例 丹酚酸HPLC DPPH在线清除自由基活性实验流程 8 中药指纹图谱的活性标识与实例 9 中药指纹图谱的活性标识与实例 10 中药指纹图谱的活性标识与实例 DPPH是一种稳定的自由基 在517nm处有一强吸收 当有自由基清除剂存在时 DPPH的单电子被配对而使其吸收逐渐消失 其褪色程度与其所接受的电子数成量比关系 因而通过测定丹酚酸与DPPH反应体系下517nm处的吸收信号 就可说明其清除能力 290nm SalB的最大吸收波长517nm DPPH自由基的最大吸收波长 11 中药指纹图谱的活性标识与实例 12 中药指纹图谱的评价技术 请大家先观看一段视频 13 中药指纹图谱的评价技术 建立好指纹图谱也只是 万里长征走完了第一步 它还只是实验室的结果 还不能满足生产的需求 不能直接运用在生产中进行真正意义上的质量控制 要想指纹图谱真正运用到工业生产中去 必须要建立一种快速 准确的评价系统对指纹图谱进行分析评价 对生产的药品进行在线质量检测 发现不合格的产品及时排除 从而从根本上保证中药质量的稳定和可控 实现中药现代化 14 中药指纹图谱的评价技术 常见的中药指纹图谱的指标参数评价标准 1 直观对比法2 量化数据对比法3 计算机图谱解析技术 15 中药指纹图谱的评价技术 1 直观对比法直观比较法 用待测样品与标准图谱的特征 此法要求有标准图谱 标准图谱还要有足够的容量即要能涵盖大多数中药的标准谱图 应用较多 16 中药指纹图谱的评价技术 2 量化数据对比法量化数据对比法 引入相对指数 重叠率 八强峰 表观丰度等量化数据进行比较 更客观 准确 面对的难题 如何建立大量的标准数据库 17 中药指纹图谱的评价技术 3 计算机图谱解析技术1 模糊分析法2 人工神经网络法3 聚类分析法 18 中药指纹图谱的评价技术 3 1模糊分析法该法是对模糊事物进行划分 判断和推理的方法 事物的模糊性 客观差异的中介过渡性所引起的划分上的一种不确定性 中介过渡性 指从量变到质变的中间过程 19 中药指纹图谱的评价技术 计算机模糊识别的基本步骤如下 1 特征提取 即从中药的指纹图谱中获取能够反映其品质的数量化特征 2 依照某种方式确定该中药指纹特征对 真模式 假模式 的隶属度 3 用最大从属原则或阈值原则确定该中药样品的真伪 20 中药指纹图谱的评价技术 3 2人工神经网络法该法是模拟人脑功能的全新信息处理方法 其理论是神经网络的数学模型 优点 1 固有的并行结构和并行处理2 采用与人类类似的联想记忆来获得存储的知识3 很强的容错能力 可以从不完善的数据和图形进行学习并做出决定 4 具有很强的自适应能力 综合推理能力和图形识别能力 缺点 不适用与高精度的计算 在时间域顺序处理方面困难 21 中药指纹图谱的评价技术 3 3聚类分析法聚类分析法 利用样本在多维空间的相对位置 将样本分为两个或多个集团的算法 属于无人管理分类方法 过程 1 选取合适的方法去提取药材的特征数据 以多维特征空间表达出来 2 把中成药样本所得数据投影到这个特征空间上 根据点群的分布进行归类 22 中药指纹图谱研究中的关键问题 1 方案设计与思路2 原材料 中间体以及注射剂样品的选择与收集3 原材料 中间体以及注射剂样品的预处理4 指纹图谱及其重要参数的建立5 中药标准特征指纹图谱的建立6 指纹图谱评价指标 23 中药指纹图谱研究中的关键问题 1 方案设计与思路1 1研究对象的确定 1 当研究某个注射剂品种的指纹图谱时 首先必须调研相关的文献 新药申报资料 质量部分和工艺部分 及其它研究结果 尽可能详尽地了解药材 中间体及成品中所含水量成分的种类及其理化性质 经综合分析后找出成品中的药效成分或有效成分 作为成品或中间体指纹图谱的研究对象 即分析检测目标 24 中药指纹图谱研究中的关键问题 如 黄芪含黄酮 皂苷及多糖 黄芪多糖注射液是以黄芪中的多糖为原料 因此对黄芪多糖注射液进行指纹图谱研究时应以多糖作为研究对象 研究其中间体时也应以多糖为研究对象 研究原药材的指纹图谱时应把黄酮 皂苷及多糖作为研究对象 25 中药指纹图谱研究中的关键问题 2 对于复方制剂 应根据 君 臣 佐 使 的原则 以君药 臣药中有效成分作为主要研究对象 佐使药中的成分可采用其它指纹图谱方法进行辅助 补充研究 26 中药指纹图谱研究中的关键问题 1 方案设计与思路1 2研究方法的选择指纹图谱的研究方法很多且各有千秋 在实际运用中要按照需要及不同药物的特点选择 其最终目的是保证方法的准确性 重现性以及可操作性 一个中药制剂指纹图谱应可以同时采用两种或更多种方法进行研究 另 在选择指纹图谱方法时还要考虑药监部门所采用的技术和设备 27 中药指纹图谱研究中的关键问题 1 方案设计与思路1 3研究内容根据国家药品监督管理局下发的 中药注射剂指纹图谱研究的技术要求 暂行 的规定 主要研究内容有原药材 中间体 注射剂的指纹图谱 涉及样品名称 来源 制备 测定方法 指纹图谱及技术参数等研究项 28 中药指纹图谱研究中的关键问题 2 原材料 中间体以及注射剂样品的选择与收集原药材样品的收集应遵循以下原则 药材尽可能固定产地 如道地药材 采收期 炮制方法 对已往生产使用过的药材应结合临床使用情况选择收集样品 对工艺稳定 疗效恒定 临床使用中很少出现异常医疗事故的药材批次应重点选择 另外还应收集不同产地 不同采收期的药材 这些药材虽然含量高低不同 组成比例各异 但当正常使用的药材一旦出现偏差时 可通过这些批次的药材实行合理 勾兑 通过对指纹图谱的研究 可以对 勾兑 过程进行指导 29 中药指纹图谱研究中的关键问题 中间体 注射剂因其生产工艺已经恒定 样品的收集原则也应重点选择工艺稳定 疗效恒定 临床使用中很少出现医疗事故的批次 根据 中药注射剂指纹图谱研究的技术要求 暂行 之规定 原药材 中间体及注射剂样品至少应收集10批次 不可以同一批次的样品分散成数个批次 充当样品 30 中药指纹图谱研究中的关键问题 3 原材料 中间体以及注射剂样品的预处理原药材的供试品制备最为复杂 原药材所含的多种组分混杂在一起 样品制备时 应根据所含成分和物理化学性质 通过萃取 沉淀 吸附或通过化学反应 分离富集样品 31 中药指纹图谱研究中的关键问题 中间体是原药材经过了多步处理而得 已经滤过了大部分成分 样品制备时 可针对有效成分处理 并参照原药材的制备方法 样品富集后 尚需过氧化铝预柱 C18预柱 硅胶预柱 聚酰胺预柱等 以除去色素等杂质 避免干扰或对色谱柱的损耗 注射液中除少数品种添加助溶剂外 所含化学成分均具有较好的水溶解性能 面且研究生产工艺时考虑到色素 生物大分子等因素 生产过程中已通过微孔滤膜 脱色等操作 因此 样品无需特殊处理 可直接分析检测 32 中药指纹图谱研究中的关键问题 4 指纹图谱及其重要参数的建立经过预处理后 就可运用各种指纹图谱的构建方法进行图谱的建立 获得定性和定量的数据后 综合运用 得到一系列重要参数 以色谱指纹图谱为例 33 中药指纹图谱研究中的关键问题 4 1共有峰和重叠率共有峰反映了待鉴药材中有多少成分与标准药材相同 显示二者之间的相似度 重叠率 共有峰数目 2 标准药材峰数目 待鉴定药材峰数目 所有的色谱峰都要被计入重叠率的计算中 包括反映个体特征的峰 使重叠率降低 所以应该对反映个体差异的色谱峰群进行模糊处理 使药材的特征显示出来 得到真实的鉴定结果 34 中药指纹图谱研究中的关键问题 4 2强峰 N N值是按照实际的出峰情况而定 一般占总峰数的1 5 1 3 1 从众多的峰中 按照面积大小选择前N个作为强峰 且其总面积应该占整个面积的70 以上 2 依据N个强峰面积的大小而定 小于70 应适当增加 超过70 应适当减小 3 注意N个强峰中各具体峰在药材中出现的频次和所列的次序 为研究药材的药效和质量标准提供重要的信息和依据 35 中药指纹图谱研究中的关键问题 4 3特征指纹特征指纹是一系列色谱峰所组成的峰群 是生物体所特有的指纹 反映了一种药材与其他药材的不同之处 即主要用来鉴别品种 但是中药作为生物样品 其特征指纹会随着岁月的变迁而改变 尽管都是同一品种 产地相同 采集方式也相同 但是生物体的变异是绝对的 因此 特征指纹要随着时间的推移而同步更新 36 中药指纹图谱研究中的关键问题 5 中药标准特征指纹图谱的建立5 1标准药材的选用标准药材应由权威机构 如中国药品生物制品检定所 相关高校或科研院所所鉴别 但由于中药的复杂性 不可能存在一个包含所有个体差异的标准的药材 因此要对那些个体差异采取模糊措施 形成代表品种特征的特征图谱 以此代替标准药材作为中药鉴定的比较标准 37 中药指纹图谱研究中的关键问题 5 2标准特征指纹图谱的建立1 标准药材的收集 最少不得少于10个批号