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【精品】松花粉计划书 泰山松花粉对鸡兔免疫增强作用的研究与开发计划 一、泰山松花粉采集、处理及其营养成分分析在泰山松花盛开期，采集不同品种泰山松花，晒干，筛选松花粉。 分别对其营养成分，主要包括多糖、蛋白质、氨基酸、脂肪、糖类、有机酸、核酸、维生素、矿质元素、不饱和脂肪酸等进行测定和分析，并分析确定其作为免疫增强剂的有效成分。 （一）蛋白质的提取方法及含量测定试剂与仪器硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸、2硼酸溶液、4NaoH0.05N盐酸标准溶液、凯氏定氮蒸馏装置步骤 （1）样品处理称取样品0.2-2.0g,移入干燥的100ml定氮瓶中，加硫酸铜0.2克，硫酸钾6g及浓硫酸20ml，加玻璃珠数粒，于瓶口放一小漏斗，小心加热。 待内容物全部炭化，泡沫消失后加大火力并保持瓶内液体沸腾消化至液体呈蓝色，澄清透明或再加热0.5小时，制冷后加水20ml，移入100ml容量瓶中，加水至刻度。 （2）蒸馏装好定氮装置，装水至蒸馏瓶2/3处，加甲基红指示剂数滴和数毫升硫酸、数粒玻璃珠，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。 向接受瓶内加硼酸10ml，混合指示剂数滴，使冷凝管下端插入液面下，打开水。 吸取消化液10ml,由小玻杯加入反应室，用10ml水洗小玻杯，后用玻塞塞紧小玻杯。 将10mlNaoH倒入小玻杯后提起玻塞使其慢慢流入反应室后立即塞紧，并用蒸馏水封住。 关紧旋塞，开始蒸馏5分钟后，使冷凝管下端离开接受瓶液面，在蒸馏1分钟冲洗冷凝管下端。 （3）滴定取下接受瓶，用标准酸滴定至终点，同时吸收10ml试剂空白消化液做试剂空白试验。 （4）结果Pro()=(V1-V2)*C*0.014/(m*10/100)*F*100其中V1=滴定样品消耗酸的体积，ml V2=滴定空白消耗酸的体积，ml Pro（）为100g样品中蛋白质的含量（二）脂肪的提取与测定试剂与仪器:索氏提取器、无水乙醚、海砂步骤 （1）样品处理精密称取花粉2-5克，放入研钵中加入等量无水硫酸钠研磨后全部移入事先用乙醚浸泡脱脂处理过的滤纸筒内。 （2）抽提将滤纸筒置于索氏提取器的抽提管内，由抽提管上端加入乙醚至接受瓶2/3处于水浴加热使乙醚不断回流并控制3-5分钟，抽提2小时。 (3)称重将水浴蒸干的脂肪于95-105摄氏度烘箱内干燥2h，取出放入干燥器内，冷却0.5小时后取出称重。 （4）计算脂肪（）=(m1-m0)/m2*100其中m0接受瓶的质量，m1接受瓶和脂肪的质量，m2样品的质量（三）核酸的提取和测定仪器与试剂美国BECKMAN公司产DU一7紫外分光光度计、日本产HITACHI型冷冰离心机、匀浆机、日本产SIM一F121型制冰机、冰箱、恒温箱、分析天平、离心机、容量瓶、紫外分光光度计、吸管、甲醇、乙醇:乙醚(2:l)、0.2M过氯酸（放于冰箱中预冷）、5%6%氨水、钼酸铵-高氯酸试剂（沉淀剂）。 如配制200mL可在193mL蒸馏水中加入7mL70%高氯酸和0.5g钼酸铵。 步骤 （1）提取将经过破壁处理的松花粉2克放在离心管中，并加入2ml冷甲醇。 用冷冻离心机控制低温离心10分钟，弃去上清液，用4ml冷甲醇冼沉淀，每份冼两次，并弃去上清液，用4ml冷0.2M过氯酸抽提甲醇不溶物，抽提2次以除去酸溶性磷酸盐。 将酸沉淀物用4毫升冷乙醇冼2次除去酸及其他可溶物质。 此后即在50下用乙醇:乙醚(2:1)抽提醋类30分钟，离心弃去上清液，然后各加入5毫升0.5MKOll并在37下保温16小时，保温后离心，保留上清液，上清液中含有水解RNA，用1ml0.5MKOH将沉淀洗一次，离心10分钟，上清液并第一次上清液。 然后从沉淀中提取DNA。 用5毫升5%过氯酸与沉淀一起在70下保温40分钟，保温后离心保留上清液，用lml5%HClO4淀，洗液与上次上清液合并，将KOH和HClO4两种水解物的PH调到7并用H2O将体积调到10ml低温下离心以除去KCIO、保留上清液，沉淀弃去。 上清液留待测定。 用DU-7紫外分光光度计测其200nm-300nm紫外吸收值及260nm和280nm下紫外吸收比值。 （2）测定 1、用分析天平准确称取待测的核酸样品（经过破壁处理的松花粉）500mg，加少量蒸馏水调成糊状，再加入少量的水稀释。 然后用5%6%氨水调至pH7，定容到50mL。 2、取2支离心管，向第一支管内加入2mL样品溶液和2mL蒸馏水；向第二支管内加入2mL样品溶液和2mL沉淀剂，以除去大分子核酸作为对照。 混匀。 在冰浴或冰箱中放置30分钟后离心（3000r/min，10分钟）。 从第一管和第二管中分别吸取0.5mL上清液，用蒸馏水定容到50mL。 用光程为1cm的石英比色杯，于260nm波长处测其光吸收值（A1和A2）。 如果已知待测的核酸样品不含酸溶性核苷酸或可透析的低聚多核苷酸，即可将样品配制成一定浓度的溶液（2050kg/mL）在紫外分光光度计上直接测定。 （四）其他成份测定维生素、氨基酸、不饱和脂肪酸，矿物质元素等与食品科学实验室联合测定。 二、松花粉多糖的提取与测定（一）松花粉的破壁选择超微粉碎即球磨机无介质粉碎破壁,各项参数为:每罐填料约30g,共4罐,球料比为710,450r/min下球磨12h。 （二）多糖的提取与测定材料与仪器泰山松花粉;060370胃蛋白酶13000Amresco分装,活力单位30003500u/mg;右旋葡萄糖、AB-8大孔树脂、三氯甲烷、正丁醇、95%乙醇、苯酚、浓硫酸、无水乙醚、无水丙酮，以上药品无特殊说明均为分析纯试剂。 索氏提取器，8002型电子恒温水浴锅,EYELA N-1000旋转蒸发仪,722可见分光光度计，日立高速离心机,SHB-循环水式多用真空泵,OLSB低温冷却液循环泵等。 步骤 （1）提取80%乙醇80回流抽提脂肪85热水(料液比115)浸提4次，每次3h离心,合并上清液AB-8大孔树脂脱色蒸馏水冲洗树脂1%胃蛋白酶酶解3h(pH5.56,温度37，前期浸提阶段加入)加热灭酶减压浓缩Sevage试剂除蛋白4倍量的95%乙醇过夜沉淀离心无水乙醚、丙酮洗涤冷冻干燥松花粉粗多糖DEAE-sephadexA-25离子交换柱层析、sephadexG-75分子筛凝胶柱层析等技术分离纯化得到高纯度多糖。 （2）测定将花粉粗多糖溶解并稀释至适当浓度,取2mL该糖液,加1mL5%苯酚,振摇均匀,迅速加5mL浓硫酸,40水浴平衡15min,测吸光值,按如下公式计算多糖含量:P=2cD1/VD2/210-3/W100%其中c-由标准曲线计算得出糖液的质量浓度(mg/mL);D1-第一次稀释后定容的体积(mL);V-第一次稀释并定容后取糖液量(mL);D2-第二次稀释后定容的体积(mL);W-称取原料松花粉质量（g) 三、松花粉佐剂疫苗的制备各种疫苗每毫升加破壁松花粉佐剂按高、中、低、零剂量组分别为 15、 10、 5、0毫克,尺度一般要大于免疫活性抗原5-10纳米。 泰山松花粉冷冻粉碎提取滤液过滤连续离心除去残渣除去沉淀加疫苗纳米技术处理超滤真空浓缩含破壁松花粉佐剂的人用疫苗冻藏保存。 四、动物实验（一）动物的喂养用正常饲料喂养家兔40-50只，供动物实验之用。 在孵化箱内培养40-50个鸡胚至其孵化后进行动物实验。 （二）佐剂疫苗的注射将家兔40只随机分成A、B、C、D四组，每组10只，分别按松花粉佐剂疫苗高、中、低、零剂量颈下注射。 五、实验结果的测定（一）血液中白细胞含量的测定 1、实验原理血液中血细胞数很多，无法直接计数，需要将血液稀释到一定倍数，然后再用血细胞计数板，在显微镜下计数一定容积的稀释血液中的白细胞数量，最后将之换算成每升血液中所含的白细胞数，或者直接用血细胞分析仪。 2、实验用品 （1）器具显微镜、血细胞计数板（改良Neubauer）、小试管、微量（血红蛋白）采血管、1ml移液管、玻璃棒、刺血针、干棉球等。 （2）实验动物兔 （3）实验试剂哺乳动物白细胞稀释液（冰醋酸1.5ml、1%结晶紫1ml、加蒸馏水至100ml）、蒸馏水、75%酒精、95%酒精、乙醚和1%氨水等。 3、实验方法和步骤采血与血液的稀释 （1）加稀释液用1ml移液管取白细胞稀释液0.19ml加入一小试管中，备用。 （2）采血一般取动物的末梢血（或抗凝静脉血），采血前需进行消毒。 （3）稀释用微量（血红蛋白）采血管吸10l血液，加至有白细胞稀释液试管的底部，并用上清液清洗管内残留血液。 摇动小试管，使稀释液与血液混合，这样使白细胞稀释了20倍。 充池（布血）将盖玻片的一边与计数池的纵线末端接触，然后缓慢放下，使盖玻片平放在计数室两侧的隆起上（这样可以赶走盖玻片下的空气），用微量采血管或蘸有白细胞悬浮液的玻璃棒靠近盖玻片的前方边缘，靠毛细管作用将白细胞悬浮液充入计数池。 室温中平放35min，待细胞下沉后显微镜下计数。 若计数池未被布满或过多以致使盖玻片浮动，或弄到盖玻片外面都需要重新充池（布血）。 计数于高倍镜下计数周围四个大方格内的白细胞数。 如果细胞压线，则按数上不数下，数左不数右原则进行。 如果四周大方格内的白细胞数相差8个以上，则说明血细胞分布不均匀，需振荡稀释液，重新充池（布血）。 计算白细胞数/L=N2010/4=N5式中N4个大方格内数得的白细胞数N/4换算成每个大方格内的白细胞数10将一个大方格内白细胞数换算为1l血液内白细胞数1L=l20血液稀释倍数（二）间接ELISA法测血清中的抗体水平材料包被液、洗涤液、保温液、底物液、终止液；DVH包被抗原、酶标抗抗体、阴性及阳性DVH参考血清；待检鸭血清；ELISA检测仪、加样器、聚苯乙烯微量板。 方法步骤加抗原包被4过夜，洗涤三次、抛干加待检血清372小时，洗涤三次、抛干加酶标抗体372小时，洗涤三次、抛干加底物液3730分钟，加终止液用ELISA检测仪测定OD值，并计算出P/N比值。 结果判定已知阳性血清与已知阴性血清的比值（P/N）2.1，而且已知阳性血清的OD值0.4；在上述条件成立的情况下，如果待检血清与已知阴性血清的比值（P/N）2.1，而且待检血清的OD值0.4，则判为阳性，否则判为阴性。 六、预期研究成果xx.6-xx.12预期发表论文泰山松