二章 氨基酸

生 物 化 学,潘继承2006. 秋,主要参考资料：,Lehninger Priciples of Biochemistry, 4  edition Biochemistry, by Stryer, 5 edition生物化学王镜岩主编生命的化学杂志,Voice: 6571620 (Home)            6511613 (Office)            -mail: ,第二章  氨基酸与蛋   白质的一级结构,Amino acid,（一）氨基酸的结构共性,蛋白质水解产生20种“标准” 氨基酸；“标准”氨基酸是因为它们是合成蛋白质的原始构件,是未经过化学修饰的,而且它们都有编码它们的相应遗传密码子。除脯氨酸及其衍生物外，这些氨基酸在结构上的共同特点是与羧基相邻的-碳原子（C）上都有一个氨基，因此称为-氨基酸。连接在-碳原子上的还有一个氢原子和一个可变的侧链，称R基，各种氨基酸的区别在于R基不同。,第一节 氨基酸,氨基酸1,氨基酸2,（二）、氨基酸侧链的性质与分类,组成蛋白质的20种常见氨基酸可以按R基的化学结构或极性大小进行分类。按R基的化学结构20种常见氨基酸可分为具非极性侧链的氨基酸、侧链具极性但不带电荷的氨基酸和侧链带电荷的氨基酸等3类，其中以具非极性侧链的氨基酸最多。,1 、具非极性侧链的氨基酸,2.侧链具极性但不带电荷的氨基酸,在氧化条件下，两个半胱氨酸的侧链巯基形成一个二硫键：氧化的产物为胱氨酸。,3. 侧链带电荷的氨基酸,（三）氨基酸名称的缩写符号,二.“非标准”氨基酸,在少数蛋白质中分离出一些不常见的氨基酸，通常称为不常见蛋白质氨基酸。这些氨基酸都是由相应的基本氨基酸衍生而来的。其中重要的有4-羟基脯氨酸、5-羟基赖氨酸、N-甲基赖氨酸、和3,5-二碘酪氨酸等。这些不常见蛋白质氨基酸的结构如下。,三、氨基酸的旋光性和构型,用温和的方法水解蛋白质分离的氨基酸除甘氨酸外都具有旋光活性，即它们可使偏振光平面发生旋转；氨基酸的这种性质是由它们的结构决定的。当一个碳原子有四个不同的取代基同它连接形成一个不对称分子时，这个碳原子就是一个不对称中心或者称作手性中心。,在蛋白质分子中存在L胱氨酸。,丙氨酸的一对对映体和甘油醛构型之间的立体关系,由于旋光活性分子能使偏振光平面发生旋转方向和旋转角度都是可以测定的。用旋光仪可以定量地测定这类分子地旋光活性：,（一）氨基酸的两性电离性质,依照Bronsted-Lowry的酸碱质子理论，酸是质子（H+）的供体(donor),碱是质子的受体(acceptor)。酸碱的关系如下：,酸                   碱             质子,四、氨基酸的酸碱性质,根据酸碱质子理论，氨基酸在水中的偶极离子既起酸（质子供体）的作用：,也起碱（质子受体）的作用：,因此是一类两性电解质。,氨基酸的氨基， 羧基以及侧链可解离的基团都有一个特征性的电离（或称解离）常数的负对数值（pK）。由于氨基酸的每个可解离基团的电离趋势不同，因而不同氨基酸有不同的pK。pK值可通过氨基酸的酸碱滴定的酸碱滴定曲线来测定。每个可滴定基团的pK相应于氨基酸滴定曲线中的该基团滴定过程的中点。,（二）氨基酸的酸碱滴定曲线,阳离子（A+）                 兼性离子（A0）            阴离子（A-）,氨基酸完全质子化时，可以看成是多元酸，侧链不解离的中性氨基酸可看作二元酸，酸性氨基酸和碱性氨基酸可视为三元酸。现以甘氨酸为例，说明氨基酸的解离情况。甘氨酸盐酸盐是完全质子化的氨基酸，实质上是一个二元酸。,第一步解离：,第二步解离：,解离的最终产物（A-）相当于甘氨酸钠盐。,氨基酸的解离常数可用测定滴定曲线的实验方法得到。滴定可从甘氨酸（或等点电甘氨酸）溶液、甘氨酸盐酸盐或甘氨酸钠溶液开始。当0.1 mol甘氨酸溶于水时，溶液的pH约等于6.0。用标准NaOH溶液滴定，以加入的NaOH的摩尔数对pH作图，测得滴定曲线B段，在pH 9.60处有一个拐点。用标准HCl滴定，以加入的HCl的摩尔数对pH作图，测得滴定曲线A段，在pH 2.34处有一个拐点。,Handerson-Hasselbalch公式,甘氨酸的滴定曲线（解离曲线）,等电点：,当溶液浓度为某一pH值时，氨基酸分子中所含的-NH3+和-COO-数目正好相等，净电荷为0。这一pH值即为氨基酸的等电点(isoelectric point, pI)或等电pH，简称pI。在等电点时，氨基酸既不向正极也不向负极移动，即氨基酸处于两性离子状态。,（三）滴定曲线可以预示氨基酸的电荷变化,侧链不含离解基团的中性氨基酸，其等电点是它的pK1和pK2的算术平均值：pI = (pK1 + pK2 )/2 同样，对于侧链含有可解离基团的氨基酸，其pI值也决定于两性离子两边的pK值的算术平均值。    酸性氨基酸：pI = (pK1 + pKR-COO- )/2    碱性氨基酸：pI = (pK2 + pKR-NH2 )/2,构成蛋白质的20种氨基酸在可见光区都没有光吸收，但在远紫外区(<220nm)均有光吸收。 4="" 257="2.0x102;" 275="1.4x103;" 280="5.6x103;,五、氨基酸的光学活性和光谱性质,（二）氨基酸的光谱性质,用途：用于测定蛋白质的浓度。,Lambert-Beer定律,第二节" v="" q="" .="" vt="" ve="" vo="" vi="" g="" vm="" kd="">1 表明凝胶对溶质有吸附作用。,Kav 可用分配系数。,凝胶床内各种体积之间的关系是：,凝胶过滤法测定相对分子质量,五、蛋白质的配体专一性与亲和层析分离,蛋白质是特定生物功能的分子，在行使功能过程中常和某些特异分子结合，形成复合物。能与某种蛋白质专一结合的分子称为配体。根据蛋白质的配体专一性，建立的一种非常有效的方法。例如：蛋白质A在表现功能的过程中需要和B物质结合，而且这种结合是专一的：                     A    +    B         AB,如果用化学方法先将B物质共价结合到一种不溶性载体（R）上，就可以得到R-B。若偶联到R上的B不失去与A结合的能力，那么将含有A的混合蛋白质通过装有R-B的层析柱时，A将与B非共价地结合，得到R-B.A。其它不能与B结合的杂蛋白将从柱下流出，然后可以用适当的洗脱液将A从层析柱上洗脱下来。,在免疫亲和层析中，将一种蛋白质（抗体）结合到载体上，做成亲和层析柱，然后将含有引起该抗体蛋白产生的蛋白质（抗原，即目标蛋白）的蛋白质混合液通过该亲和层析柱，只有目标蛋白质被专一地结合到柱子上，其它所有杂蛋白都直接从层析柱下流出。被结合的目标蛋白可以用含较高浓度的抗体蛋白洗脱液或不同pH或不同离子强度的溶液淋洗层析柱，目标蛋白即可从柱上洗脱下来。分辨率高。,六、蛋白质电泳,电泳是分离蛋白质和其它可解离物质的一项重要的技术。带电质点在电场中泳动的速度和方向主要取决于它们所带电荷性质、电荷数目、颗粒大小及形状。由于各种蛋白质的等电点不同、分子大小不同，在同一pH下，它们具有不同的解离状态，因而在电场中泳动的方向和速度也各不相同。,蛋白质电泳技术是在区带电泳的基础上发展起来的。目前在蛋白质的研究中，聚丙烯酰胺凝胶电泳是最常使用的技术。聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）的最大有点是凝胶支持物的孔径可以根据需要进行选择。通常使用高pH的缓冲液。,（一）非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,电泳前，被分离的蛋白质样品不作任何变性处理，凝胶和电泳缓冲液中不加入任何变性剂。样品中的各蛋白质组分在电场中根据它们各自的迁移率彼此分离。电泳之后，各被分离的物质保持天然的结构，具有相应的生物活性。,（二）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,在电泳之前，蛋白质样品用SDS处理。SDS能拆散蛋白质的折叠结构，然后沿伸展的多肽链的表面吸附。吸附的多肽链上的SDS使肽链带净负电荷。大小不同的多肽链将具有相同的q/r值。由于聚丙烯酰胺凝胶基质的网状结构具有分子筛效应，所以较小的多肽将比较大的多肽具有相同q/r值的多肽迁移得更快。SDS-PAGE的分辨率高，重复性很好。,SDS-PAGE的用途：,检测蛋白质的纯度；检测蛋白质的亚基组成；检测蛋白质的相对分子质量。,Lane:Crude extractCMCSephadex-150DEAE5. Standard Protein,(三)  双向电泳,虽然SDS-PAGE具有很高的分辨力，但是不能将大小相同、但电荷存在差异的多肽彼此分开。双向电泳是指第一向是等电聚焦，第二向是SDS-PAGE。等电聚焦：根据样品等电点的差异，通过电泳将它们分别聚焦到相应于它们各自等电点pH的凝胶部位。,(四) 毛细管电泳,蛋白质样品的定量；散热性能好，允许使用高电压。上样和分离物检测可以自动化。,（五）电泳后的蛋白质检测,考马斯亮蓝染色；活性染色；免疫印迹或蛋白质印迹。    一种蛋白质（抗原）能与它产生的抗体专一地反应。在电泳之后，欲检测目标蛋白的存在，可以先将凝胶中的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，然后用目标蛋白产生的抗体与之产生抗原抗体反应，再用连接用碱性磷酸酯酶或辣根过氧化酶的第二抗体（通用抗体）与第一抗体反应，最后加入能与第二抗体共接的酶进行反应并能生成有色物质，即可检测到目标蛋白。,第五节 蛋白质一级结构的测定,一、蛋白质结构概述根据对不同类型、不同形状、不同功能的蛋白质结构的研究，蛋白质的结构水平可以分为四级。一级结构：蛋白质多肽链的氨基酸顺序；二级结构：蛋白质多肽链主链在空间的走向，一般呈有规律的空间排列，是主链的构象，不涉及侧链基团在空间上的关系。,三级结构：蛋白质分子中的所有原子的三维空间排列，包括二级结构要素和侧链在空间上的相互关系。四级结构：多体蛋白质分子亚基之间的相互关系和空间位置，每一种亚基有自己的一级、二级、三级结构。蛋白质的二级、三级和四级结构是蛋白质的高级结构，统称为蛋白质的空间结构或空间构象。,二、蛋白质一级结构测定,完成蛋白质的氨基酸序列测定，大致要经过下面几个程序：在获得足量而高纯净的蛋白质样品之后，测定该蛋白质是由几条肽链组成；如果确知蛋白质分子中存在链间的或链内的二硫键，必须拆开二硫键，以获得伸展的肽链。对蛋白质多肽链进行氨基酸组成分析，分析多肽链的氨基酸组成和各种氨基酸的摩尔数。,二、蛋白质一级结构测定,采用两种或两种以上的专一性水解方法，得到两套或两套以上的肽碎片，并对各套碎片进行分离，以获得单一的碎片。测定每个肽碎片的氨基酸顺序。比较两套或两套以上的肽碎片的氨基酸顺序，推导出整个肽链完整的氨基酸顺序。确定二硫键和酰胺基的位置。,（一）末端分析,对末端残基进行鉴定能够确定某蛋白质分子中化学上不同的多肽链数目。在末端分析中，通常采用对N末端进行分析，如有必要亦可对C末端进行分析。N末端分析的原理是利用多肽链N末端残基游离氨基能与某些化学试剂产生特有的化学反应。,二硝基氟苯（DNFB或FDNB）法多肽或蛋白质的游离末端NH2与DNFB（称Sanger试剂）反应后，生成DNP-多肽或DNP-蛋白质。,1、N-末端分析,二硝基氟苯（DNFB或FDNB）法,1、N-末端分析,丹磺酰氯（DNS）法：原理与DNFB相同，只是用DNS代替了DNFB试剂。由于丹磺酰基具有强烈的荧光，灵敏度比DNFB高100倍。,1、N-末端分析,丹磺酰氯（DNS）法：,1、N-末端分析,丹磺酰氯（DNS）法：,1、N-末端分析,苯异硫氰酸酯（PITC）法多肽或蛋白质的末端氨基能与PITC（Edman试剂）作用，生成苯氨基硫甲酰多肽或蛋白质，即PTC-多肽或蛋白质。PTC-多肽或蛋白质在酸性有机溶液中加热时，N-末端的PTC-氨基酸发生环化，生成苯乙内酰硫脲的衍生物并从肽链上掉下来，除去N-末端氨基酸后剩下的肽链是完整的。,1、N-末端分析,苯异硫氰酸酯（PITC）法,1、N-末端分析,苯异硫氰酸酯（PITC）法：,1、N-末端分析,苯异硫氰酸酯（PITC）法,1、N-末端分析,氨肽酶法肽链外切酶或叫外肽酶，能从多肽链的N-末端逐个地向里切。根据不同的反应时间测出酶水解所释放的氨基酸种类和数量，按反应时间和残基释放量作动力学曲线，就能知道该蛋白质的N-末端残基序列。,1、N-末端分析,肼解法测定C-末端残基的最重要的化学方法。蛋白质或多肽与无水肼加热发生肼解，反应中除C-末端氨基酸以游离形式存在外，其它的氨基酸都转变为相应的氨基酸肼化物。,2、C-末端分析,2、C-末端分析,还原法肽链C-末端氨基酸可用硼氢化锂还原成相应的-氨基醇。肽链完全水解后，代表原来C-末端氨基酸的-氨基醇，可用纸层析法鉴别。,2、C-末端分析,羧肽酶法目前测定C-末端最为有效的方法。是一类外切酶，专一地从肽链的C-末端开始逐个降解，释放出游离的氨基酸。被释放的氨基酸数目与种类随反应时间而变化。根据释放的氨基酸量（摩尔数）与反应时间的关系，便可以知道该肽链的C-末端氨基酸的序列。,2、C-末端分析,羧肽酶法,2、C-末端分析,（二）二硫键的拆开,如果多肽链之间或链内存在二硫键，必须使其断开，以获得伸展的肽链；还原法和氧化法均能使二硫键断裂；还原法的试剂是含巯基（-SH）的化合物；氧化法常用过甲酸作为氧化剂，使二硫键氧化断裂，生成半胱璜酸；反应系统加入8 mol/L尿素。,（三）氨基酸组成分析,样品完全水解，用氨基酸分析仪进行测定。酸水解碱水解,（三）氨基酸组成分析,酸水解：   待测样品用6mol/L HCl在110于真空的安培瓶封闭水解24、48和72小时。使肽链断裂，释放出游离的氨基酸。色氨酸被破坏，含羟基的丝氨酸和苏氨酸也会受到不同程度损失，疏水性残基，例如缬氨酸和异亮氨酸缓慢释放。,在酸水解中，难以确定的是谷氨酸和谷氨酰胺以及天冬氨酸和天冬酰胺。在酸水解时，天冬酰胺（Asn）和谷氨酰胺（Gln）的和酰胺基以NH4+的形式释放出来，分别生成相应的天冬氨酸和谷氨酸。酸水解所释放出的NH4+量是代表Asn和Gln释放的总量，而不代表其中任何一种氨基酸。,（三）氨基酸组成分析,碱水解：一般与5 mol/L NaOH共煮1020 h，即可使蛋白质完全水解。碱水解缺点：多数氨基酸遭到不同程度的破坏。产生消旋现象，所得产物是D-和L-氨基酸的混合物，即消旋物。引起精氨酸脱氨，生成鸟氨酸和尿素。碱水解优点：色氨酸稳定。,（四）肽链的部分水解,蛋白质氨基酸顺序分析的策略是将蛋白质多肽链在控制的条件下，进