非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)的分类

非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)的分类有三种常用的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法：blue native（BN-PAGE），clear native（CN-PAGE），quantitative preparative native continuous（QPNC-PAGE）。在一个典型的 native PAGE 方法中，复合物被 CN-PAGE 或 BN-PAGE 分离。然后可以用其它分离方法如 SDS-PAGE 或等电聚焦做进一步分离。随后切割凝胶，蛋白复合物每一个部分都被分开。蛋白的每个条带可以消化后做肽链指纹图谱或重新测序。这样就可以提供一个蛋白复合物中单个蛋白的重要信息。1. Blue Native PAGEBlue Native PAGE 是最古老的 Native-PAGE 技术。是以考马斯亮蓝作为电泳分离后蛋白质鉴定染料的一种电泳方法。这种方法的缺点是：考马斯亮蓝与蛋白的结合起到了去垢剂的作用，可能导致复合物的分离；并对化学发光或蛋白质辅基的荧光或荧光染料的标记具有潜在的猝灭作用。Blue Native PAGE 在分析蛋白质-蛋白质相互作用以及膜蛋白复合物方面有很大的优势，其分离范围在 100KDa-10MDa。在 Blue native PAGE 过程中，最重要的化合物就是考马斯亮蓝，除了增溶作用以外，蛋白质表面结合了大量的考马斯亮蓝染料而带上负电荷，这会导致即使碱性蛋白在 pH7.5 条件下也会向阴极迁移。但是，蛋白质虽然带有大量的负电荷，然而其分离依据的根本还是根据不连续的凝胶梯度-凝胶孔径的逐渐减小，蛋白质最终迁移到其自身大小与凝胶孔径相近似的位置而停止。并且在分离膜蛋白的过程中，由于带有负电荷，而不会引起蛋白聚合，与酸性染料的结合，膜蛋白也由疏水性变成亲水性，溶解性大大提高。1.2 Clear Native PAGEClear Native PAGE 是通过除染色以的其它方法如 SLS 鉴定蛋白的电泳技术。然而，这种方法最大的应用还是研究蛋白质-蛋白质相互作用，特别是和质谱联用。Clear Native PAGE 是在聚丙烯酰胺凝胶中分离酸性水溶性蛋白和膜蛋白（PI10.0），因此在电场中不是从正极迁移到负极就是从负极迁移到正极。已分离的蛋白分子用特殊的生理洗脱液连续洗脱，并用分部收集器收集。整个分离系统必须在 4冰箱中进行。纯化的，半纯化的和未处理的样品都可以用于 QPNC。样品分离纯化中应该避免类似于蛋白质沉淀等过程以防止蛋白变性。化学稳定的金属蛋白可以用非变性的凝胶渗透层析来进行进一步纯化。1.3.4 定量和鉴定Fe， Cu， Zn， Ni， Mo， Pd， Co， Mn， Pt， Cr， Cd 和其它金属辅因子可以通过ICP-MS（Inductively coupled plasma mass spectroscopy，电感耦合等离子体质谱）来定性和定量。因为 PAGE 条带的高纯度和选择性凝集，相关的结构可以用非变性条件下的NMR 来分析。1.3.5 应用QPNC 的应用对象为分子量 6-200kDa 的酸性、碱性和中性金属蛋白。在测定血液或其它临床样品中独立的金属蛋白结构和功能关系方面具有重要应用，因为不正确的金属陪伴蛋白的折叠。例如超氧化物歧化酶（SOD）的铜陪伴蛋白出现在这些基质中或许预示着神经病变疾病如肌萎侧索硬化病等。QPNC-PAGE，SEC，IC