蛋白质提取及纯化

蛋白质提取及纯化提取蛋白质的当天早晨去后把高速离心机和超高速离心机都打开冷却1、前一天晚上用 Resuspension Buffer 重悬 4L 菌体，然后离心于 4C 保存，第二天使用。2、用少量预冷的 Resuspension Buffer 重悬细菌，1 protease inhibitor tablets(EDTA Free)，1mM PMSF, 然后用玻璃 Homogenizer 做均一化处理，将总体积调至 80ml；3、High Pressure Homogenizer 破壁，特别注意样品一定要在不加压力的情况下运行一个循环（2min） ；然后 1200bar，6min 三个循环，整个过程冰水冷却；4、DNaseI 处理：加入 2.5mg DNaseI，10mM MgCl 2, 室温处理 30min；5、 11.000rpm，4，15min; then 11.000rpm，4 ，15min；6、 1mM  PMSF, 45.000rpm，4，90min;7、用 Resuspension Buffer 洗两次以除去可溶性的蛋白质，然后预热分光光度计；8、用 3-4ml Binding Buffer 重悬 Membrane pellets，动作一定要轻缓，重悬后的总体积不超过 8ml，取出 300ul 测定 OD800 和 OD850(以 OD850 为准),测定时候是逐步稀释，每次吸光值小于 1；9、调整 OD85030-50，在缓慢搅拌（速度一定要慢）的情况下逐滴加入 30%的 LDAO 使其终浓度达到 0.5%，1mM PMSF，26黑暗条件下重悬 1h，期间注意观察颜色变化；10、45.000rpm, 4, 30min，注意观察颜色的变化以及沉淀是否发生明显的变化。Charge and Equilibrate Resin(1) 用蒸馏水冲洗柱子以除去 20%酒精，注意不要用 buffer，1ml/min ，至紫外吸收和电导稳定；(2) 用 0.1M NiSO4 Charge Resin，1ml/min，10 倍柱体积，尽量使得紫外吸收和电导稳定；(3) 用蒸馏水冲洗，1ml/min，至紫外吸收和电导稳定；(4) 用 binding buffer 洗柱子，1ml/min，至紫外吸收和电导稳定；9、收集上清，0.22um 滤膜过滤，取出 200ul 总蛋白分装保存，10、上样：0.5ml /min （循环上样 2 次） ；11、洗脱： 先用 binding buffer，流速 1ml/min；然后用 Wash Buffer，1ml/min，最大限度地去除杂蛋白，最后用 Elute Buffer 洗目的蛋白，1ml/min。12、超滤：一半直接超滤后用重悬 binding buffer 重悬，液氮速冻后-80C 保存13、strip buffer 螯合，20%酒精，4C 放置。Buffer（1） Resuspension Buffer: 20mM Tris-HCl pH8.0, 100mM NaCl, pass through 0.45um filter（2） Binding Buffer: 20mM Tris-HCl pH8.0, 100mM NaCl, 10mM Imidazole, 0.1% LDAO（3） Wash Buffer: 20mM Tris-HCl pH8.0, 100mM NaCl, 20mM Imidazole, 0.1% LDAO （4） Elution Buffer: 20mM Tris-HCl pH8.0, 100mM NaCl, 500mM Imidazole, 0.1% LDAO （5） Charge Buff