蛋白质的化学下

蛋白质的化学（下）,本章主要内容第一节 蛋白质是生命的物质基础第二节 蛋白质的化学组成第三节 蛋白质的分子结构第四节 蛋白质的结构和功能第五节 蛋白质的性质第六节 蛋白质分离纯化的基本原理,第四节 蛋白质的结构与功能,一、蛋白质一级结构与功能的关系二、蛋白质的空间构象与功能的关系三、蛋白质的结构与生物进化,蛋白质复杂的组成和结构是其多种多样生物学功能的基础；而蛋白质独特的性质和功能则是其结构的反映。蛋白质一级结构包含了其分子的所有信息，并决定其高级结构，高级结构和其功能密切相关。,蛋白质结构与功能关系的一般原则,每一种蛋白质都具有特定的结构，也具有特定的功能。一旦结构（特别是高级结构）破坏，其功能随之丧失。蛋白质的高级结构决定蛋白质的功能。蛋白质的一级结构决定其高级结构，因此，最终决定了蛋白质的功能。一级结构相似的蛋白质具有相似的功能。功能相似的蛋白往往能显示它们在进化上的亲缘关系，这是研究分子进化的基础。许多疾病是蛋白质三维结构异常引起，属于构象病。（例如囊性纤维变性，镰状红细胞贫血和疯牛病）,一、蛋白质一级结构与功能的关系,一级结构决定高级结构，也决定蛋白质的功能,1、一级结构不同，生物学功能各异 实例：加压素和催产素2、一级结构中“关键”部分相同，其功能也相同 实例：促肾上腺皮质激素（ACTH）3、蛋白质一级结构的变异与分子病 实例：血红蛋白质异常病变镰刀型贫血病,1、一级结构不同，生物学功能各异 实例：加压素和催产素（垂体后叶分泌的九肽激素）,加压素：促进血管收缩，升高血压及促进肾小管对水的重吸收，抗利尿作用；催产素：刺激平滑肌引起子宫收缩，催产作用。,2、一级结构中“关键”部分相同，其功能也相同 实例：促肾上腺皮质激素（ACTH）,不同动物来源的ACTH，其氨基酸顺序差异主要在25-33位，而1-24位的氨基酸顺序相同表现出相同的生化功能。,1.24 2533.39 活性必需部分 种属特异性,若N端1位丝氨酸被乙酰化，活性显著降低，仅为原活性的3.5；若切去25-39片段仍具有全部活性。,来源 31 32 人 ser glu 猪 leu glu 牛 ser gln,3、蛋白质一级结构的变异与分子病 实例：血红蛋白质异常病变镰刀型贫血病,血红蛋白共有4条多肽链，574个氨基酸，仅有一个氨基酸残基发生变化，就导致这种严重的结果。,glu,val,一级结构“关键”部分的变化，其生物活性也改变 近年来应用蛋白质工程技术，如选择性的基因突变或化学修饰等，定向改造多肽中一些“关键”的氨基酸，可得到自然界不存在而功能更优的多肽或蛋白质，这对研究多肽类新药具有重要意义。,二、蛋白质的空间构象与功能的关系,高级构象决定蛋白质的功能,1 、蛋白质前体的激活与高级结构 实例：胰岛素原的激活、消化酶原的激活2 、蛋白质在表现生物功能时，构象发生一定变化（变构效应） 实例：血红蛋白的变构效应和输氧功能3、蛋白质高级构象破坏，功能丧失 实例：核糖核酸酶的变性与复性,1 、蛋白质前体的激活与高级结构 实例：胰岛素原的激活,胰岛素原其活性仅为胰岛素活性的5-10,实例：消化酶原的激活,蛋白质的变构现象 allosteric effect,在生物体内，当某种物质特异地与蛋白质分子的某个部位结合，触发该蛋白质的构象发生一定变化，从而导致其生物学功能的变化，这种现象称为蛋白质的变构效应。,2 、蛋白质在表现生物功能时，构象发生一定变化（变构效应）,1、一级结构不变化2、是调节蛋白质生物学功能普遍而有效的方式具有四级结构的多聚体酶或蛋白质常处于某些代谢通路的关键部位，所以具有调节整个反应过程的作用，它们常是通过多聚体的变构作用而实现的。组成蛋白质的各个亚基共同控制着蛋白质分子完整的生物活性，并对信息(变构效应物)做出反应，信息与一个亚基的结合可传递到整个蛋白质分子，这个传递是通过亚基构象的改变而实现的。,实例：血红蛋白的变构效应和输氧功能,血红蛋白的与氧气结合前后的构象变化,血红蛋白分子中的一个亚基结合O2后，可以导致其构象的变化，并引起其他三个亚基的构象相继发生变化，使得其他亚基对O2的亲和力突然增强。,3、蛋白质高级构象破坏，功能丧失 实例：核糖核酸酶的变性与复性,三、蛋白质的结构与生物进化,一般来说，对细胞来说非常重要的蛋白质分子变化较少且慢，如细胞色素C、核糖体蛋白、泛素等。因此，细胞色素C常常用来当作研究分子进化的研究对象。,生物在长期进化和发展过程中，不断分化出结构与功能相适应的蛋白质。因此，生物的变异不仅表现在生物的外部形态上，也必然要反映在蛋白质的结构上。,实例：细胞色素,不同生物与人的Cytc的AA差异数目,生物 与人不同的AA数目黑猩猩 0恒河猴 1兔 9袋鼠 10牛、猪、羊、狗 11马 12鸡、火鸡 13响尾蛇 14海龟 15金枪鱼 21角饺 23小蝇 25蛾 31小麦 35粗早链孢霉 43酵母 44,第五节 蛋白质的性质,一、蛋白质分子的大小、形状及分子量的测定二、蛋白质的变性与复性三、蛋白质的两性电离与等电点四、蛋白质的胶体性质五、蛋白质的沉淀反应六、蛋白质的颜色反应 七、蛋白质的免疫学性质,一、蛋白质分子大小、形状及分子量测定,(一) 蛋白质分子的大小分子量低于1万 多肽 高于1万 蛋白质,10000d=10kd,(二) 蛋白质的分子形状,根据扩散系数、黏度或其他物理方法等可以推算出蛋白质的不对称常数,1 分子呈球形 1 分子呈椭球形 1 分子呈纤维状,蛋白质是一类高分子化合物，其在溶液中的形状可根据不对称常数分为球形、椭圆形、纤维状等。,(三) 蛋白质分子量的测定,Western blot,二、蛋白质的变性与复性,变性,复性,变性 ：某些物理的和化学的因素使蛋白质分子的空间构象发生改变或破坏，导致其生物活性的丧失和一些理化性质的改变。,复性：蛋白质的变性作用如果不过于剧烈，则是一种可逆过程，变性蛋白质通常在除去变性因素后，可缓慢地重新自发折叠成原来的构象，恢复原有的理化性质和生物活性。,蛋白质变性的学说最早由我国生化学家吴宪(1931)提出，他认为天然蛋白质分子受环境因素的影响，从有规则的紧密结构变为无规则的松散状态，即变性作用。,变性的本质 蛋白质结构内部的次级键受到破坏，从而导致蛋白质分子空间构象的改变或破坏，而不涉及一级结构的改变或肽键的断裂。,变性的特征 (1)生物活性的丧失(2)某些理化性质的改变 ： 溶解度；结晶能力；黏度；不对称性；易水解,变性的因素和程度,物理因素：高温、紫外线、X-射线、超声波和剧烈振荡等；化学因素：强酸、强碱、尿素、去污剂、重金属(Hg2+、As+、Pb2+)、三氯醋酸、浓乙醇等,如除去变性因素后，蛋白质构象可恢复者称可逆变性；构象不能恢复者称不可逆变性。,变性的应用,eg.酒精、紫外线消毒，高温、高压灭菌等是使细菌蛋白变性而失去活性； 中草药有效成分的提取或其注射液的制备也常用变性的方法(加热、浓乙醇等)除去杂蛋白； 在制备有生物活性的酶,蛋白质, 激素或其他生物制品(疫苗、抗毒素等)时，要求所需成分不变性，而不需要的杂蛋白应使其变性或沉淀除去。此时，应选用适当的方法，严格控制操作条件，尽量减少所需蛋白质变性。有时还可加些保护剂、抑制剂等以增强蛋白质的抗变性能力,三、蛋白质的两性电离与等电点,蛋白质与氨基酸一样在纯水溶液和结晶状态中都以两性离子的形式存在，即同一分子中可带有正负两种电荷，羧基带负电而氨基带正电。,使蛋白质所带正负电荷相等，净电荷为零时溶液的pH，称为蛋白质的等电点。,四、蛋白质的胶体性质,蛋白质具有如布朗运动、光散射现象、不能透过半透膜以及具有吸附能力等胶体溶液的一般特征。,水化层,蛋白质水溶液是一种比较稳定的亲水胶体。蛋白质形成亲水胶体有两个基本的稳定因素：1、表面具有水化层 2、表面具有同性电荷 。,,Company Logo,蛋白质胶体性质的应用,透析法:利用蛋白质不能透过半透膜的的性质，将含有小分子杂质的蛋白质溶液放入透析袋再置于流水中，小分子杂质被透析出，大分子蛋白质留在袋中，以达到纯化蛋白质的目的。这种方法称为透析（dialysis）。盐析法:在蛋白质溶液中加入高浓度的硫酸铵、氯化钠等中性盐，可有效地破坏蛋白质颗粒的水化层。同时又中和了蛋白质表面的电荷，从而使蛋白质颗粒集聚而生成沉淀，这种现象称为盐析（salting out）。 盐溶: 加入少量中性盐可增大蛋白质溶解度的现象。,五、蛋白质的沉淀反应,1. 盐析 (高浓度中性盐，不变性) 2. 有机溶剂沉淀 3. 加热变性沉淀 4. 重金属盐沉淀 5. 生物碱试剂沉淀 (或某些酸类),沉淀= or 变性？,蛋白质变性有时可表现为沉淀，亦可表现为溶解状态；同样，蛋白质沉淀有时可以是变性，亦可以不是变性，这取决于沉淀的方法和条件以及是否对蛋白质空间构象有无破坏而定。,六、蛋白质的颜色反应,蛋白质的颜色反应是其氨基酸一些基团以及肽键等与一定的试剂所产生的化学反应，并非是蛋白质的特异反应。,双缩脲反应,双缩脲反应 蛋白质在碱性溶液中可与Cu2+产生紫红色反应。这是蛋白质分子中肽键的反应，肽键越多反应颜色越深。,七、蛋白质的免疫学性质,凡能刺激机体免疫系统产生免疫应答，并能与相应的抗体和(或)致敏淋巴细胞受体发生特异性结合的物质，统称为抗原（antigen）。 抗原刺激机体产生能与相应抗原特异结合并具有免疫功能的免疫球蛋白，称为抗体（antibody）。,近年来随着对抗体理化性质、结构及免疫化学的深入研究，将具有抗体活性以及化学结构与抗体相似的球蛋白统称免疫球蛋白(immunoslobulin，Ig),抗原与抗体结合所引起反应，称为免疫反应。免疫反应是人类对疾病具有抵抗力的重要标志。,各抗原分子具有许多抗原决定簇。因此，由它免疫动物所产生的抗血清实际上是多种抗体的混合物，称为多克隆抗体(polyclonalantibodies)。用这种传统的方法制备抗体，其效价不稳定而产量有限，要想将这些不同抗体分离纯化是极其困难的。,单克隆抗体(monoclonal antibody，McAb)是针对一个抗原决定簇、又是由单一的B淋巴细胞克隆产生的抗体。它是结构和特异性完全相同的高纯度抗体。,蛋白质免疫性质的应用 疾病的预防、诊断和治疗； 免疫分析：RIA 和EIA 分离纯化：亲和层析,第六节 蛋白质的分离与纯化的基本原理,蛋白质的提取蛋白质的分离与纯化蛋白质的纯度鉴定和含量测定,蛋白质的提取,材料的选择选择合适的原材料组织细胞的粉碎采用适当方法将细胞破碎目的蛋白的提取利用缓冲液将细胞内的成分溶解出来,超声破碎仪,手持匀浆机,细胞裂解液,,Company Logo,蛋白质的分离与纯化,根据溶解度不同分离； 等电点沉淀；盐析；低温有机溶剂沉淀根据分子大小不同分离； 透析和超滤；分子排阻层析；密度梯度离心根据电离性质不同分离； 电泳；离子交换层析根据配基特异性不同分离 亲和层析,透析(dialysis)法是利用蛋白质大分子对半透膜的不可透过性而与其他小分子物质分开。此法简便，常用于蛋白质的脱盐，但需时间较长。,超滤法(ultrafiltration) 是利用超滤膜在一定的压力或离心力的作用下，大分子物质被截留而小分子物质则滤过排出。 此法的优点是可选择性地分离所需分子量的蛋白质、超滤过程无相态变化、条件温和、蛋白质不易变性，常用于蛋白质溶液的浓缩、脱盐、分级纯化等。,凝胶过滤 ： 简便而有效的生化分离方法之一。其原理是利用蛋白质分子量的差异，通过具有分子筛性质的凝胶而被分离。,分子排阻层析,离子交换层析,利用蛋白质是两性化合物的特点对蛋白质进行分离纯化。,阴离子交换介质,上样,淋洗,洗脱,在不溶性惰性载体上共价连接正电荷基团，吸附和交换周围环境中的阴离子(带负电荷的蛋白)。,亲和层析法 affinity chromatography,根据具有特异亲和力的化合物之间能可逆结合与解离的性质建立的层析方法，称为亲和层析。,亲和基团配体,eg.抗原和抗体；protein A与 抗体；酶与底物/抑制剂,,Company Logo,蛋白质的纯度鉴定和含量测定,纯度鉴定方法 层析法(HPLC) 电