膝关节骨关节炎研究进展.ppt

杭州市红十字会医院骨科赖震 膝关节骨性关节炎研究进展 3 22 2020 常见骨性关节炎表现 3 22 2020 骨性关节炎膝内翻 3 22 2020 骨性关节炎膝内翻 3 22 2020 骨关节炎膝外翻 膝关节骨性关节炎 OA 是一种以关节软骨的变性 破坏及骨质增生为特征的慢性关节病 又称增生性膝关节炎 老年性膝关节炎 临床上以中老年发病最常见 女性多于男性 有研究表明 50岁以上约80 60岁以上约90 70岁以上几乎100 罹患该病 特别是近年来随着生活节奏的加快 该病的发生呈日益年轻化的趋势 临床对骨关节炎的认识 以往人们称退行性骨关节病为骨性关节炎 OsteoarthritisOA 退行性关节炎 骨关节病或增生性关节炎 实际上它指的是进行性的关节软骨缺失伴随着关节软骨的异常修复和软骨下骨的重建 许多病例表现为骨赘形成 临床对骨关节炎的认识 3 22 2020 3 22 2020 骨关节炎的危险因素 退行性骨关节病的发展与年龄因素呈明显正相关 1 长期的静力负重或不负重及不活动 如长期关节制动 可导致关节软骨基质降解 最终导致关节降解 2 有些反复性的活动 如反复的登高 搬运重物 不良的工作姿势等持续重复性的运动 显然可加速骨性关节炎的进展 3 22 2020 3 体育运动可使关节处于高压力和扭转负荷下 如美式橄榄球 可增加关节退变的危险 4 在具有解剖异常及功能异常的人 退行性骨关节病的易患性高 疾病发展快 包括关节面的断裂及不平整 关节发育不良 对线不良 关节不稳 关节或肌肉的神经支配障碍 肌力或耐力不足 骨关节炎的危险因素 3 22 2020 骨关节炎的病理改变 骨性关节炎最早可见的特征是大部分关节软骨浅层的纤维变或撕裂 随着疾病的进展 越来越多的关节面变得粗糙不平 纤维化向深层发展直达软骨下骨 随着软骨裂隙的加深 表层纤维化的软骨剥脱形成游离体 软骨变薄 同时基质发生酶解 使软骨体积减少 最后 软骨的进行性丧失使软骨下骨全部暴露 3 22 2020 骨节软骨 关节软骨由细胞外基质和高度有序性的椭圆或圆形软骨细胞组成 厚度约几个毫米 这些薄层软骨具有非常好的低摩擦滑动特性 并可缓冲滑膜关节的负荷 减少了软骨下骨的应力 3 22 2020 关节软骨的结构 3 22 2020 3 22 2020 3 22 2020 胶原网限制基质体积的扩张 3 22 2020 压力下糖胺多糖侧链距离减小 释出水分 体积减小 压力解除后 恢复正常形态 3 22 2020 正常关节及关节面 3 22 2020 早期退行性变 3 22 2020 进展期退行性变 3 22 2020 终末期退行性变 3 22 2020 3 22 2020 膝骨性关节炎的诊断基于病史和体格检查 x光片上的特征性改变可以确立诊断 但临床症状并不总是与x光片所见相吻合 骨扫描 CT和MRI都有助于早期骨性关节炎的发现和察觉关节的微小改变 骨性关节炎的诊断基于病史和体格检查 x光片上的特征性改变可以确立诊断 但临床症状并不总是与x光片所见相吻合 骨扫描 CT和MRI都有助于早期骨性关节炎的发现和察觉关节的微小改变 骨关节炎诊断 3 22 2020 能早期发现软骨退变的方法有 测定软骨蛋白聚糖和存在于关节液 血清和尿液中的胶原碎片的水平以及先进的软骨影像学方法 包括MRI 骨关节炎诊断 3 22 2020 临床表现 疼痛 定位不准确 进行性加重 与活动有关 关节僵硬 早晨或长时间不活动后 通常不超过30分钟 关节畸形关节挛缩肌肉萎缩 3 22 2020 3 22 2020 体格检查 关节活动时可触及骨赘和研磨感 3 22 2020 膝关节骨性关节炎的病因研究 几十年来 医疗界对膝关节骨性关节炎研究虽已取得了很大进步 但对其确切病因仍未明了 按照美国风湿病协会的分类 骨性关节炎可分为原发性和继发性 前者确切原因不清 可能包括年龄 性别 职业 种族等因素 3 22 2020 各种机械性刺激是软骨细胞功能的重要调节因素 它不仅能诱导包括白细胞介素1 一氧化氮和金属蛋白酶等炎症因子的产生 而且能导致蛋白聚糖从软骨组织块中释放 后者可继发于各种关节损伤或疾病 如 半月板损伤 关节内或关节周围骨折 关节韧带损伤 先天畸形或脱位等 各种机械性刺激是软骨细胞功能的重要调节因素 它不仅能诱导包括白细胞介素1 一氧化氮和金属蛋白酶等炎症因子的产生 而且能导致蛋白聚糖从软骨组织块中释放 膝关节骨性关节炎的病因研究 3 22 2020 膝关节骨性关节炎的病因研究 RePo等在体外试验研究中观察到 人膝关节软骨细胞在应力超过4MPa时 便会导致软骨细胞急性死亡 当承载压力为循环压力时诱导软骨细胞死亡的压力阈值明显下调 大3 5MPa和6MPa的循环承载压力可分别造成人髌骨软骨组织块和牛软骨组织块中的细胞明显死亡 Jefrey等观察到 软骨被一次自由落体冲击致伤后 其细胞功能减退 蛋白多糖及胶原合成减少 可出现软骨细胞的急性死亡 软骨细胞受损的程度与冲击创伤的能量大小成正比 ThomPson等在兔实验中也观察到 关节软骨遭受可致骨折的冲击后 软骨损伤难以修复 软骨退变 半年左右即发生病理改变 因软骨无吞噬细胞 软骨细胞凋亡后产生的凋亡小体及囊泡将得不到及时清除 3 22 2020 目前 膝关节骨性关节炎已公认为基因相关性疾病 确定与之相关的易感基因非常重要 通过基因研究深入了解膝关节骨性关节炎的分子生物学发病机制 进而发明新的治疗方法 如目前的热点基因治疗 通过在人群中对易感基因进行筛选 找出高危人群并提供遗传学证据 进而及早干预和进行有效的防治 膝关节骨性关节炎的病因研究 3 22 2020 膝关节骨性关节炎的病因研究 Koshizuka等进行鼠膝关节骨性关节炎模型的基因多态性研究 结果表明鼠胱氨酸蛋白酶抑制剂 CST 10的表达基因与膝关节骨性关节炎相关 CSTl0鼠膝关节骨性关节炎模型可观察到软骨细胞钙化受抑制 3 22 2020 膝关节骨性关节炎的病因研究 膝关节骨性关节炎是遗传和环境等因素共同作用的多因子疾病 因此研究过程中必须考虑到不同个体所处的不同环境因素对膝关节骨性关节炎发生发展的影响 最好能开展一些前瞻性的病例对照研究 不同人群发病的不确定性也是研究的难点之一 膝关节骨性关节炎易感基因的研究已取得不小的进展 但仅仅确定易感基因并无临床意义 应明确不同基因的功能和作用机制 进而找到膝关节骨性关节炎的有效干预手段及治疗方法 浙江省中西医结合医院骨科 骨关节炎的病机研究 正常情况下 关节软骨基质的分解代谢与合成维持着动态平衡 这一过程受体内多种生物活性分子的调控 其中氧自由基等活性分子在关节软骨破坏中起重要作用 在正常生理情况下 由于机体具有强大的自由基防御系统 可将机体代谢所产生的自由基及时清除 但在病理情况下 自由基的生成增加 清除率下降而导致自由基堆积 继而自由基作用于多不饱和脂肪酸 PU FA 而诱发脂质过氧化反应 脂质过氧化物增加 通过多种途径对局部组织产生破坏 浙江省中西医结合医院骨科 骨关节炎的病机研究 研究证实 自由基可在损伤软骨细胞 降解细胞外基质的同时形成自身抗原 破坏机体的耐受性 导致淋巴系统机能异常及自身免疫发生 自由基对软骨细胞的影响可能为抑制核糖核普酸还原酶 导致软骨细胞DNA合成减少 并使核酸亚硝酞化 DNA碱基C脱氨为U 发生碱基错配 DNA双螺旋结构与遗传信息改变导致细胞死亡 自由基干扰软骨细胞能量代谢 攻击线粒体膜 并与含亚铁原叶琳的铁离子结合 形成亚硝酞络合物 损伤线粒体 自由基使蛋白质多肤链交联形成桥键 结构改变后酶活性改变 研究证实 自由基可在损伤软骨细胞 降解细胞外基质的同时形成自身抗原 破坏机体的耐受性 导致淋巴系统机能异常及自身免疫发生 自由基对软骨细胞的影响可能为抑制核糖核普酸还原酶 导致软骨细胞DNA合成减少 并使核酸亚硝酞化 DNA碱基C脱氨为U 发生碱基错配 DNA双螺旋结构与遗传信息改变导致细胞死亡 自由基干扰软骨细胞能量代谢 攻击线粒体膜 并与含亚铁原叶琳的铁离子结合 形成亚硝酞络合物 损伤线粒体 自由基使蛋白质多肤链交联形成桥键 结构改变后酶活性改变 软骨细胞是成熟软骨组织内唯一的细胞类型 它在软骨损伤以及重塑过程中起到维持内环境稳定的作用 既往对膝关节骨性关节炎的研究大多数着重于细胞外基质的变化 近年的研究发现软骨细胞的异常凋亡也起着重要的作用 细胞凋亡是一个正常的生理过程 是一种由基因控制的 主动地去除非需要或损伤细胞的程序性死亡过程 浙江省中西医结合医院骨科 骨关节炎的病机研究 浙江省中西医结合医院骨科 骨关节炎的病机研究 关节软骨细胞凋亡作为膝关节骨性关节炎的发病机制的研究为防治膝关节骨性关节炎提供了一个新的途径 抑制关节软骨细胞过度凋亡 意味着部分软骨细胞得以保存 延缓或减轻对关节软骨破坏 促进损伤的软骨修复 从而缓解关节症状 改善和恢复关节功能 达到治疗膝关节骨性关节炎的目的 中医对骨关节炎的认识 浙江省中西医结合医院骨科 骨关节炎属于祖国医学的腰背痛 痹症的范畴 也称为 鹤膝风 历节病 骨痹 着痹 痛痹 淤血痹 中医认为 膝关节骨性关节炎的发病与肝肾亏虚 气滞血瘀 风寒湿阻等有关 张氏医通 云 膝为筋之府 膝痛无有不因肝肾虚者 虚则风寒湿气袭之 本病实为本虚标实之证 其本是肝肾亏虚 筋骨失养所致 肝肾亏虚是病变的根本 风寒湿痰瘀痹阻经络为标 肝藏血 主筋 肾藏精 主骨 老年肝肾不足或劳损 外伤损伤气血 复受风寒湿 热 邪 邪滞膝部 气滞血瘀 经络闭阻 筋骨失荣为本病的基本病机 故治当以补益肝肾 强筋壮骨为主 活血祛瘀 祛风通络为辅 浙江省中西医结合医院骨科 骨性关节炎中医病因病机 中医将膝关节骨性关节炎纳入 骨痹 范畴 素问 痹论 谓 风寒湿三气杂至 合而为痹也 所谓痹者 各以其时重感于风寒湿之气也 认为年老体虚 跌仆损伤 饮食 药物失当及风寒湿热之邪是导致膝关节骨性关节炎发病的内外因素 中藏经 五痹 谓 骨痹者 乃嗜欲不节 伤于肾也 则邪气妄人 指出邪气闭阻经络 气血不通 脉络绌急是本病的病机所在 日久也可由经络累及脏腑 病理性质属虚实相兼 浙江省中西医结合医院骨科 骨性关节炎中医病因病机 中医对本病多从肝肾亏虚 风寒湿邪外侵 气滞血癖等辨证论治 在实验研究方面取得了很大进步 黄枫等观察了补肾方含药血清对白细胞介数1 IL 1 抑制软骨细胞增殖及诱导软骨细胞产生一氧化氮 NO 作用的影响 郭建刚等运用壮筋活血汤 熟地黄 山药 牛膝 山茱英 土鳖虫 红花等 对实验性家兔的膝骨性关节炎模型进行防治 汪青春等制造小鼠膝关节骨性关节炎模型 观察中药对关节软骨的影响 潘浩等采用补肾壮筋汤治疗早期膝关节骨性关节炎 通过观察其对软骨细胞凋亡及增殖细胞核抗原表达的影响 浙江省中西医结合医院骨科 骨性关节炎的主要治疗手段 1 非药物治疗 包括患者的健康教育 自我训练 减肥 有氧操 关节活动度训练 肌力训练等2 药物治疗 包括各种非甾体类抗炎药 NSAID 氨基葡萄糖和硫酸软骨素以及中医中药治疗3 关节内注射治疗 包括糖皮质激素 透明质酸钠等4 手术治疗 传统手术 关节镜手术5 中医治疗 贯穿于整个疾病治疗过程的始终结合中医的整体观念 辨证论治 综合运用中药 针灸 推拿等多种手段从膝关节局部用药和全身整体出发 内外兼治 动静结合 充分发挥中医药的优势综合治疗 结合西医各种治疗手段为治疗该病行之有效的方法 42 中医治疗骨关节炎主要手段 浙江省中西医结合医院骨科 浙江省中西医结合医院骨科 中医治疗手段 中医外治法在防治膝关节骨性关节炎方面疗效显著 方法较多 目前仍是治疗本病的重要手段 通过对关节周围经络循行部位上筋结的治疗 逐步恢复关节动力学的动态平衡 从而抑制关节液中IL lB IL 6和TNF 水平的异常升高 达到治疗膝骨关节炎的作用 浙江省中西医结合医院骨科 中医治疗手段 熏洗热熨法是利用药物加热后的热能及药物本身的作用 因此具有双重功效 可加速局部血液和淋巴液的循环 促进关节积液吸收 缓解疼痛和肿胀 能明显抑制膝关节滑膜炎症 减轻膝骨关节炎软骨退变 中药熏洗具温通功效 能有效地改善局部血液循环 增加皿流量 促进新陈代谢 促进静脉回流 加快炎性物质吸收 起到祛散风寒 除湿消肿的作用 浙江省中西医结合医院骨科 中医治疗手段 推拿治疗有其独特的优势和良好的效果 能通过疏通病变膝部经络气血 而改善病变膝部关节液 血液及淋巴循环 促进关节炎症渗出的吸收 有效地增强病变膝关节软骨细胞的营养 浙江省中西医结合医院骨科 中西医结合治疗骨性关节炎的治疗优势 一 中西药结合的优势1 克服了单纯西药治疗副作用大的弊端2 拓宽了治疗途径3 中药治疗以中医整体观念为指导 治疗针对关节局部用药的同时兼顾肝 肾 脾等脏器 通过药物提高了相关脏器机能 做到了标本兼治 浙江省中西医结合医院骨科 二 中西医结合非药物治疗骨性关节的优势1 目前治疗包括超短波治疗 干扰电 蜡疗 冰敷 中医手法治疗 及康复治疗 康复体操等 2 中医手法以中医脏腑经纶理论为指导 采取相应的经络腧穴通过点穴舒筋 可以恢复肌力 以改善关节的稳定性和功能状态 通利关节3 促进局部血液循环 加快局部代谢 促进膝关节无菌性炎症的吸收和致痛物质的代谢又能够调理相关脏腑达到通利血脉 壮骨强筋 4 中医针法 灸法等治疗同样以中医脏腑经络理论为指导采用特定腧穴达到蠲痹止痛目的 中西医结合治疗骨性关节炎的治疗优势 浙江省中西医结合医院骨科 膝关节康复练习常规 浙江省中西医结合医院骨科 膝关节康复练习常规 海桐皮汤熏蒸对兔实验性膝骨关节氧自由基代谢和软骨细胞凋亡的影响赖震石仕元费俊等杭州市红十字会医院 实验内容一海桐皮汤熏蒸对兔实验性膝骨关节炎软骨显微结构的影响 材料与方法 1 药物海桐皮汤 海桐皮 透骨草 乳香 没药 当归 防风 红花 川芎 威灵仙 川椒 白芷 桂枝组成 2 主要仪器设备RTZ l0A型台秤 66805电针治疗仪 低温冰箱 BS 812 电子天平 AX 6901 LKB800超薄切片机 德国 JSM 840 OlymPus光学显微镜 日本 3 实验动物45只新西兰大白兔 雌雄不限 体重为 体重2 0 3 5kg 由浙江中医药大学实验中心提供 批号 SYXK 浙 2008 0116 普通级 4 制作熏蒸台熏蒸时将实验兔置于熏蒸台 台下放电饭煲以熏蒸之用 材料与方法 图1实验动物称重图2熏蒸架图3对实验兔进行熏蒸 造模方法 每只动物随机选取右侧膝关节 参考Hulth造模方法 取膝关节内侧纵切口长约4cm 探查关节腔无原发病变后仔细切断前交叉韧带和后交叉韧带 切断内侧副韧带 完整切除内侧半月板 勿损伤关节软骨面 逐层缝合伤口 无菌敷料包扎固定 HuIthALindbergL TelhagH ExPermentalosteoarthritisinrabbitsPreliminaryrePort ActaOrthoPScand 1970 4l 5 522 530 图4实验动物图5对实验兔进行造模 图6手术造模时切除交叉韧带图7手术造模时切除侧半月板 分组与治疗 随机取10只实验兔作为正常对照组 A组 其余35只采用Hulth方法造模 取30只造模后无明显不良反应的实验兔并随机分为模型组 B组 水蒸气熏蒸组 C组 和海桐皮汤熏蒸组 D组 模型组 造模后正常饲养 水蒸气熏蒸组 用自来水熏蒸 将实验兔固定在熏蒸台上 距离熏蒸锅30cm 熏蒸30分钟 每日一次 共4周 海桐皮汤熏蒸组 取海桐皮汤熏蒸 将每副中药在治疗前浸泡半小时后 放入电饭锅通电加热至煮沸冒蒸汽为止 同时熏蒸30分钟 每日一次 共4周 切片的制备及观察 关节蜡块 常规制片 HE染色 由病理专业人员阅片 关节软骨有无破坏或纤维化 根据病变由轻到重的程度 依次半定量为轻微 轻度 中度 重度 无病变组织为阴性 统计学分析 应用SPSS13 0软件进行统计学处理 数据以均数 标准差 S 表示 组间比较时 方差齐性者 采用单因素方差分析 方差不齐者 比较采用非参数检验和Dunnett t检验 组内前后比较时 采用单样本t检验 均以P 0 05作为显著性差异的标准 结果 造模情况在造模过程中出现2只实验兔手术后死亡 手术1周后出现2只实验兔膝关节感染 处死后 解剖右膝关节发现膝关节内有大量脓液及坏死组织 其余实验兔膝关节无明显异常 图8感染实验兔膝关节红肿图9切开感染实验兔膝关节可见大量脓液 大体观察 各组按相应方法处理4周后 膝关节无明显红肿 各组体重无显著差异 见表1 解剖右膝关节后 正常组和海桐皮汤熏蒸组关节软骨无明显区别 色泽正常 均无肉眼可见关节软骨裂隙 软骨下骨裸露和关节周缘骨赘形成 模型组和水蒸气熏蒸组肉眼可见部分关节软骨裂隙 软骨下骨裸露 表1各组治疗前后体重的比较 kg s 注 实验前各组体重均无显著差异P 0 05 实验后各组均无显著差异P 0 05 图10正常组图11模型组 光镜观察 1 正常组 关节面光滑 表面被覆薄层透明软骨 细胞排列整齐 关节骨组织结构清晰 无骨折 坏死 2 模型组 10只中8只有炎症性病变和软骨破坏 滑膜增厚 软骨表面糜烂 细胞成簇排列 其余2只软骨有不同程度的破坏 并且有炎细胞浸润 局部纤维组织增生 骨组织基本正常 3 水蒸气熏蒸组 关节软骨炎性病变较模型组减轻 轻微炎细胞浸润 膝关节软骨细胞数增多 软骨细胞排列较整齐 基质囊变好转 基质纤维变性减轻 4 海桐皮汤熏蒸组 关节软骨炎性病变较模型组减轻 膝关节软骨细胞数增多 软骨细胞排列较整齐 基质囊变好转 基质纤维变性减轻 另1只滑膜组织及关节软骨 骨组织基本正常 见表2 图12 15 图12正常组细胞排列整齐 关节骨组织结构清晰图13模型组软骨有不同程度的破坏 并且有炎细胞浸润 图14水蒸气熏蒸组关节软骨炎性病变较模型组减轻图15海桐皮汤熏蒸关节软骨炎性病变较模型组减轻 各组关节软骨观察情况 实验内容二海桐皮汤熏蒸对兔实验性膝骨关节炎氧自由基代谢的影响 材料与方法 1 主要试剂乳酸林格氏液 0 9 生理盐水 0 3 肝素溶液 无菌蒸馏水 冰醋酸 3 戊巴比妥钠 丙二醛 MDA 测试盒 超氧化物岐化酶 SOD 测试盒2 主要仪器设备家兔手术台 动脉插管 三用恒温水浴箱 LXT II型离心机 计算机及PcLab生物信号处理系统 550nm分光光度计 可调式移液器及枪头 L0ml刻度离心管 比色管3 实验动物与造模方法同实验一4 分组与治疗同实验一 检测方法 血清超氧化物歧化酶 SOD 的测定测定原理 通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶系统产生超氧阴离子自由基 后者氧化轻胺形成亚硝酸盐 在显色剂的作用下呈现紫红色 用可见光分光光度计测其吸光度 当被测样品中含SOD时 则对超氧阴离子自由基有专一性的抑制作用 使形成的亚硝酸盐减少 比色时测定管的吸光度值低于对照管的吸光度值 通过公式计算可求出被测样品中的SOD活力 并定义每ml反应液中SOD抑制率达50 时SOD量为一个活力单位 U 表1血清SOD含量测定操作表 混匀 室温放置10分钟 于波长550nm处 lcm光径比色杯 蒸馏水调零 比色测各管吸光度值 血清中SOD含量计算公式 SOD活力 对照管吸光度一测定管吸光度 对照管吸光度 50 反应体系稀释倍速 样本测试前的稀释倍速 血清丙二醛 MDA 含量的测定 MDA测试原理 过氧化脂质降解产物 LPO 中的丙二醛 MDA 可与硫代巴比妥酸 TBA 缩合 因底物为TBA所以此法称TBA法 形成红色产物 在532nm处有最大吸收峰 用可见光分光光度计测其吸光度 通过公式计算血清中MDA含量 操作方法 取培养上清液 参考八木国夫所描述的脂质过氧化物 LPO 测定的TBA法 以0 5nmol L的1 1 3 3 四甲氧基丙烷为标准品 日立F3000荧光分光光度计测定LPO代谢终产物丙二醛 MDA 的含量 结果以均值 标准差 s 表示 表2血清MDA含量测定操作表 旋涡混匀器混匀 试管口用保鲜薄膜扎紧 用针头刺一小孔 95 水浴40分钟 取出后流水冷却 然后3500 4000转 分 离心10分钟 取上清3m1倒入lcm比色杯中 532nm处 lcm光径 蒸馏水调零 测各管吸光度值 血清中MDA含量计算公式 血清MDA含量 测定管吸光度一测定空白管吸光度 标准管吸光度一标准空白管吸光度 标准品浓度 样本测试前稀释倍速 统计学处理方法 应用SPSS13 0软件进行统计学处理 数据以均数 标准差 S 表示 组间比较时 方差齐性者 采用单因素方差分析 方差不齐者 比较采用非参数检验和Dunnett t检验 组内前后比较时 采用单样本t检验 均以P 0 05 P 0 01作为显著性差异的标准 实验结果 海桐皮汤熏蒸对兔实验性膝骨关节炎SOD活性的影响治疗前各组的SOD值无显著差异 P 0 05 治疗后正常组与治疗前无显著差异 P 0 05 治疗后模型组SOD值降低 与本组治疗前有显著差异 P 0 05 水蒸气熏蒸组 海桐皮汤熏蒸组SOD值均升高 与治疗前均有显著差异 P 0 05 海桐皮汤熏蒸组SOD值升高明显 与水蒸气熏蒸组相比有显著差异 P 0 05 表3各组兔治疗前后血清SOD含量的比较 s 注 与正常组治疗前比较 P 0 05 与本组治疗前比较 P 0 05 与正常组治疗后比较 P 0 05 与水蒸气熏蒸组治疗后比较 P 0 05 海桐皮汤熏蒸对兔实验性膝骨关节炎MDA含量的影响 治疗前各组的MDA值无显著差异 P 0 05 治疗后正常组与治疗前无显著差异 P 0 05 治疗后模型组MDA值升高 与本组治疗前有显著差异 P 0 05 水蒸气熏蒸组 海桐皮汤熏蒸组MDA值均降低 与治疗前均有显著差异 P 0 05 海桐皮汤熏蒸组MDA值降低明显 与水蒸气熏蒸组相比有显著差异 P 0 05 表4血清MDA含量的变化 s nmol L 注 与正常组治疗前比较 P 0 05 与本组治疗前比较 P 0 05 与正常组治疗后比较 P 0 05 与水蒸气熏蒸组治疗后比较 P 0 05 实验内容三海桐皮汤熏蒸对兔实验性膝骨关节炎软骨细胞凋亡的影响 材料与方法 1 主要仪器与试剂流式细胞仪 FACSCalibur 美国 低温冰箱 BS 812 显微镜型号 OlymPusIX51 全温振荡培养箱型号 江苏培英HZQ F160 电子天平 AX 6901 LKB800切片机 德国 移液枪型号 EPPendorf染色缸 湿盒低温高速离心机 北京医用离心机厂 DL 2OG II 高速冷冻离心机HHS11 4 电热恒温水浴箱2 实验动物与造模方法同实验一3 分组与治疗同实验一 4 取材与切片 1 取材 空气栓塞法处死动物后 立即解剖右膝关节 打开膝关节腔 从股骨远端及胫骨近端连同软骨下骨一并切取 2 切片 纵向切取外侧胫骨平台2 3mm厚的薄片 置于4 多聚甲醛PBS缓冲液固定48小时 修整标本 然后置入10 乙烯二胺四乙酸钠脱钙液以低温微波脱钙法脱钙 至脱钙完全 用针刺入组织无阻力感即可 为止 经流水冲洗2h 去除EDTA 按常规石蜡包埋 5 m连续切片 3 软骨细胞分离 外科无菌手术条件下 用眼科刀削取剩余标本关节面的关节软骨 切成1 0 2 0mm大小 移入小瓶用PBS液漂洗后 用眼科剪剪碎 越细越好 将剪细的软骨碎片收集移入试管中 加0 25 胰蛋白酶Sml消化30min 然后吸净消化液并用PBS液漂洗 以除净胰蛋自酶及可能沾染的滑膜细胞 再加入0 20l0II型胶原酶 用20 DMEM配制 Sml 37 下消化4 6h成絮状 然后将消化液用200目不锈钢筛网过滤 1000rPm离心lOmin弃上清 加PBS液摇匀后制备成软骨细胞悬液 2 3 4 检测方法 流式细胞仪检测细胞凋亡方法1 取兔关节软骨组织 PBS清洗干净 0 25 胰酶室温消化十分钟 1000rPm 5min 去除上清液 PBS重悬细胞 重复离心两次 彻底去除胰酶 2 调整待检测细胞浓度为105个 ml 取200ul 1000rPm 5min 3 预冷的PBS1ml润洗两次2 1000rPm 5min 4 将细胞重悬于100ulbindingbuffer 加入2ulAnnexin V FITC 20ug ml 轻轻混匀 避光冰上放置15分钟 5 转至流式检测管 加入400ulPBS 每个样品临上机前加入1ulPI 50ug ml 2分钟后迅速检测 6 同时以不加AnnexinV FITC及PI的一管作为阴性对照 7 结果判断 凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如PI有抗染性 坏死细胞则不能 细胞膜有损伤的细胞的DNA可被PI着染产生红色荧光 而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生 因此 在细胞凋亡的早期PI不会着