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生物物理 陈洪阳 220100906081NF-B的激活蛋白Act1Xiaoxia Li*, Mairead Commane, Huiqin Nie*, Xianxin Hua, Moitreyee Chatterjee-Kishore, David Wald, Michael Haag, and George R. StarkNF-B依赖的选择性标记的应用促进了含有cDNA编码的Act1（一种激活NF-B的蛋白）的细胞系的分离。Act1与IB酶（IKK）相互联系并激活IB酶，使得NF-B从NF-BIB复合体上分离下来。许多使得NF-B释放的信号通路都可以通过Jun 酶（JNK）激活转录激活因子（ATF）和蛋白激活因子1（AP-1）。Act1也能够激活JNK，这表明Act1可能是激活NF-B和JNK的多功能复合体的一部分。Act1在IL-1（白介素1）无应答但是所有已知信号组成都存在的的突变体细胞系中不能够激活NF-B，这表明NF-B是与IL-1信号途径中未知的组分相互作用的。转录因子Rel家族的成员，尤其是NF-B，在免疫和炎症反应、细胞生存，以及许多细胞和病毒基因表达调控方面的压力应答中发挥重要的作用。在许多细胞类型中，NF-B以惰性状态存在于胞质中，这种惰性是通过与IB抑制蛋白相互作用而实现的。在一定的细胞因子激活下（如，白介素1和肿瘤坏死因子【TNF-】）、其他试剂（如佛波酯或双链RNA）刺激下或是脂多糖或其他配体激活Toll受体后的应答过程中，IB蛋白的丝氨酸残基特异型的磷酸化，随后泛素化，很快的降解。NF-B被释放转移至细胞核激活转录。另外，激活p65/p50NF-B异二聚体的亚基p65的转录激活域，用来应答很多或是所有相同的信号，更大程度的加强了转录应答。许多信号可以激活NF-B与高分子量寡聚蛋白丝氨酸特异性的IB酶（IKK）进行聚集。IKK至少由三部分亚基构成：催化亚基IKK和、调节亚基IKK。IKK和含有非常相似的一级结构（52%的一致性），接近N端是蛋白酶区域，接近C端是亮氨酸拉链和螺旋-环-螺旋结构。IKK缺乏酶的位点但是包含一段卷曲螺旋序列，用来构成蛋白-蛋白结合，包括C端亮氨酸拉链结构。IKK是如何参与IKK信号的过程还是未知的，但是这种调节蛋白已经被报道与细胞激活信号的应答的上游组分相互作用。虽然IKK可被有丝分裂激活蛋白激酶(MAP3K)家族的成员激活，包括细胞外信号调节激酶1（MEKK1）和NF-B诱导酶（NIK），但是IKK上游激活者的身份仍然在被确定中。IL-1，TNF-以及其他相关的信号途径也能通过激活Jun酶（JNK）而激活转录激活因子（ATF）和蛋白激活因子1（AP-1）。诱导形成的信号激活JNK可能与NF-B激活在一些适配蛋白（肿瘤坏死因子受体相关因子，TRAFs）方面不同。活化的TRAFs能够激活MEKK1，然后MEKK1依次激活JNK.在这篇文章中，我们提出一个方法：克隆NF-B依赖性信号途径的新的组分。在人肾胚细胞系293中，一个含有NF-B上游区段的人类IL-1-应答基因E-selectin被用来驱动蛋白的表达，它提供了zeocin（Zeo）抗性和对单纯疱疹病毒胸苷激酶（TK）敏感性。293-TK/Zeo细胞，提供了应答IL-1的TK表达的阴性选择，这被用来分离IL-1不应答的突变细胞系。在这里，我们显示了相同的细胞被用来克隆cDNA，cDNA的表达将导致NF-B的激活，用Zeo进行选择。这样的cDNA编码的NF-B激活者1（Act1）就是一种激活NF-B和JNK途径的蛋白。材料和方法生物试剂及细胞培养.重组人IL-1由国家肿瘤协会提供。IKK的单克隆抗体由Tularik（南旧金山，CA）的Dr.Zhaodan Cao惠赠，抗磷酸化-JNK来自新英格兰生物实验室，抗IKK来自Santa Cruz Biotechnology，抗M2来自Sigma。293-TK/Zeo细胞用DMEM培养基培养，供以10%胎牛血清，青霉素G（100ug/ml）,链霉素（100ug/ml）。逆转录病毒cDNA文库和细胞转染HaCaT逆转录病毒cDNA文库从Harvey Lodish(Whitehead Institute, Cambridge,MA; ref. 19)的实验室获得，在Escherichia coli中得到富集，然后引入到包装细胞系Bosc23中以获得高浓度的逆转录病毒cDNA文库。我们用转染的方法提取病毒悬液（上清），在60mm的培养皿中转染大约2*106个Bosc细胞，起初与5g的DNA文库培养24小时。转染48小时后重新获得的悬液上清，立即用来转染或是用干冰忽然冰冻然后贮存在-80. 带有绿色荧光蛋白（pMX-GFP;ref.19）的逆转录病毒在逆转录cDNA文库中被表达，用来转染NIH 3T3 细胞，细胞用来检测GFP的表达。逆转录酶病毒cDNA文库的定量用相应的pMX-GFP逆转录病毒表达量来评估。标准量为2-5*105/ml。含有重组逆转录酶病毒的悬液上清与293-TK/Zeo在含有4g/ml聚季铵盐 (Sigma)的常规培养基中共孵育6-9h。转染9h后悬液上清被移除，细胞在正常培养基中再培养36h。转染细胞用100g/ml的Zeo和100units/ml的IL-1进行选择。选择培养基至少每5天更换一次，大约20天后克隆就可以被筛选出来了。重组质粒Act1 cDNA插入片段从Zeo选择性的克隆中逆转录PCR获得。引物 (5 primer, XH15, GGCATCGCAGCTTGGATACA;3 primer, XH18, GCTAGCTTGCCAAACCTACAGG)来自逆转录酶病毒载体pMX，克隆到pCR 2.1 PCR载体(Invitrogen)中。细胞巨化病毒（CMV）-Act1标记的质粒用Act1 cDNA插入片段（通过PCR获得）构建，构建中5 primer编码了标记物标签（flag-tag）序列Met-Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Lys。这个产物在pRcCMV哺乳动物表达载体(Invitrogen)中被克隆。Act1缺失片段用PCR进行扩增同时克隆到pRcCMV中。NIK显性负变株KK429430AA得到Zhaodan Cao (Tularik)的惠赠。pE-selectin-Luc，一种NF-B依赖性的E-selectin-Luc报告质粒，由Schindler和Baichwal (21)进行描述。转染及报告检测为了达到稳定转染，2*105个细胞被接种到10cm板中，用磷酸钙法（10g表达载体和1g pBabePuro）共转染。48小时候，细胞用1g/ml的嘌呤霉素进行选择直到克隆出现。报告检测中，2*105个细胞以同样的流程用1g pE-selectin-Luc，1g pSV2-牛乳糖和100ng构建的表达来转染。48小时候，细胞在两个35mm板上进行分离，第二天，用IL-1刺激4h，然后收集。荧光素酶和-牛乳糖的激活分别用Promega荧光素酶检测系统及化学发光试剂来检测。凝胶迁移检测从IFN诱导蛋白10（IP-10）基因而来的一个NF-B结合位点(5-GAGCAGAGGGAAATTCCGTAACTT-3)被用作探针。互补的寡核苷酸（末端标记有多核苷酸激酶(Boehringer Mannheim)和 -32PATP）用缓慢的冷却使其退火。每个检测要用大约20000cpm的探针。胞质提取如Kessler et al. (23)所述进行准备。结合反应在室温条件下进行20min，总量为20ul含有20mM的Hepes缓冲液，pH7.0/10mM KCl /0.1% Nonidet P-40/0.5 mM DTT/0.25 mM PMSF/10% 甘油。免疫共沉淀、免疫印迹以及激酶检测免疫共沉淀中，细胞提取物与1l抗IKK多克隆抗体(Zhaodan Cao; Tularik)或是预免疫血清共孵育4小时。然后与50l的蛋白A-琼脂糖珠（预清洗，以1：1的比例重悬在PBS中）共孵育1h。孵育完成后，珠子用裂解缓冲液（24）清洗五次，然后用抗M2抗体（Sigma）进行免疫印迹。IB酶检测中，细胞裂解液与抗IKK抗体进行免疫沉淀，收集到蛋白A-琼脂糖珠上。酶反应在50l 含有20mM的Hepes缓冲液（pH7.0/20mM MgCl /1mMATP/10mCi -32PATP）中30进行30min。酶作用物就是2g的谷胱甘肽S-转移酶（GST）-IB，（1-54a）残基(Joseph DiDonato, Cleveland Clinic Foundation, Cleveland, OH)。样品用10%的SDS/PAGE检测，然后自显影。Northern 分析总RNA用TRIzol试剂(GIBCO BRL)提取。基因特异性探针从随意引物试剂盒(Amersham)中得到。转移到Hybond-N膜的流程遵循Amersham所提供。人组织印迹从CLONTECH获得。结果Act1包含螺旋-环-螺旋结构域TK和Zeo的构建在E-selectin启动子的-730到+52片段中来驱动报告基因表达（18）。E-selectin启动子的诱导主要依赖于B位点（21）。E-selectin-TK和E-selectin-Zeo的构建共转染到293细胞中，克隆的挑选分为在丙氧鸟苷(gancyclovir)中存活的、在gancyclovir中完全死亡的+IL-1、在Zeo中死亡的、在Zeo中存活的+IL-1。先前，由293-TK/Zeo提供的IL-1调节的阴性选择被成功的用来增殖IL-1无应答的突变体（18）。在这里，我们认为在同样的细胞中，Zeo阳性选择的建立可以被用来克隆表达后可以激活NF-B的克隆。我们将来源于人类角化细胞HaCaT细胞的逆转录病毒cDNA文库导入293-TK/Zeo细胞，然后在100g/mlZeo中对转染细胞进行选择。一个2.6-kb的cDNA插入片段用逆转录PCR从一个获得的克隆中重新获得。数据库检索显示cDNA克隆的序列与以前未知功能的部分cDNA克隆相匹配。这个2.6-kb的cDNA插入片段包含一个编码在574aa的ORF。这个60-kDa多肽(Fig. 1A)命名为Act1(NF-B activator 1)。数据库检索显示Act1与从人类预知蛋白序列基因组克隆的PAC 487J7相匹配。Act1缺乏一些已知的催化结构域。通过序列相似性检索（25），我们发现135-190残基与上游激活因子-1（USF-1）的螺旋-环-螺旋域具有显著的同源性。在这个域中，这两个蛋白有35%的同一性和60%的同源性(Fig.1B)。而且，二级结构预测确定135155残基和182190残基是螺旋状的，与USF-1的结晶结构中螺旋-环-螺旋结构域相匹配。USF-1螺旋-环-螺旋域上游有一个基本的结构域 ，用来结合DNA，作为转录因子发挥活性的结构域。这个基本结构域没有在Act1中发现，这表明Act1不是USF-1相似性转录因子。我们还发现用COILS (27)，470-500残基可能形成卷曲螺旋域。Act1在胸腺、肾和胎盘中高表达；在心脏、骨骼肌、结肠、肝脏、肺和小肠中适度表达；在脑部、脾脏和外周血白细胞中表达量很低(Fig. 2)。Act1持续激活NF-B和JNKAct1 cDNA被克隆进了CMV表达载体，并与E-selectin-Luc一起共转染进 293细胞。与只有载体共转染的细胞相比较，在Act1共转染的细胞中，无刺激状况下E-selectin（内皮细胞选择素）启动子活性急速增加（Fig. 7)。凝胶迁移分析显示在CMV-Act1稳定转染的293细胞中NF-B确实持续活化了(Fig. 3 A)。这种持续活化解释了克隆表达Act1 cDNA是如何在Zeo选择下存活的。类似的，当NF-B过度表达时，IL-1、TNF和相关途径的信号元件会持续激活NF-B。因此，Act1有可能参与NF-B的激活途径。一些能够引起NF-B活化的信号途径也可以激活MAP激酶和JNK，后两者接着磷酸化并激活ATF 和 AP-1 (1316)。有趣的是，在CMV-Act1转染的293细胞中JNK也被持续活化了(Fig. 3 B)。Act1可以激活NF-B和JNK，暗示它位于这两个途径分叉点的上游。Act1通过NIK-IKK复合物 来激活NF-B已经知道MAP3K家族成员NIK可以通过形成NIK-IKK复合物直接激活IKK（11和12）。一个激酶惰性的NIK显性负变株能够抑制内皮细胞选择素启动子的Act1诱导，就跟抑制IL-1依赖性的诱导一样有效(Fig. 4 )，这暗示了NIK或某个类似的蛋白参与了Act1介导的NF-B激活途径。参与NF-B激活的很多信号途径都集中于IKK。此酶在CMV-Act1转染的细胞中被激活(Fig. 5 A)，表明Act1活化NF-B可能是通过IKK完成的。为了检测Act1是否直接与IKK形成了复合物，采用抗IKK免疫沉淀flag标签Act1(CMV-Act1-flag)稳定转染的细胞中的IKK复合物，接着用抗flag抗体探针检测（M2）。在IKK 抗体沉淀的IKK复合物中检测到了Act1，强烈的表明它与IKK形成了复合物(Fig. 5 B)。Act1通过它的螺旋-环-螺旋结构活化IKKAct1在它的N末端含有一个螺旋-环-螺旋结构，而在C末端有一个卷曲结构(Fig.6)。为了检测这两个结构区域的功能，就想到了用缺失的办法。打断N末端(d1150)的螺旋-环-螺旋结构彻底消除了Act1激活NF-B的能力。同时这种缺失作用也消除了Act1与IKK复合物之间的相互作用，暗示N末端的结构对于蛋白-蛋白之间的作用来说是很重要的。敲除卷曲结构区域对于Act1诱导的NF-B活化没有影响。进一步敲除C末端(d316573)废除了这个作用，提示316到420之间的残基对于此功能也是很重要的。在IL-1无应答的I4A细胞中Act1无法激活NF-B通过选择性的诱变处理293-TK/Zeo 细胞的IL-1 和丙氧鸟苷（gancyclovir）(18)来得到一些IL-1无应答的细胞系。突变细胞株I1A缺乏IRAK(IL-1受体相关激酶)，突变株I2A和I3A缺乏IRAK上游元件。在这三种突变株中IL-1都不能诱导NF-B和JNK的活化。突变株I4A只是没有IL-1诱导的NF-B活化，却有正常的JNK活化（未公布此资料）。在IL-1信号途径中所有已知的元件组分都在突变株I4A中正常表达，表明它在特定的NF-B活化的未知的组分上是有缺陷的。我们通过与E-selectin-Luc共转染检测了这几种突变株Act1介导的NF-B的活化。有趣的是，在I1A, I2A和I3A细胞中内皮细胞选择素启动子被激活了，而I4A细胞中没有此现象(Fig. 7)，暗示后者中Act1不能激活NF-B。同样Act1和pBabepuro也稳定的共转染进了293-TK/Zeo 和I4A 细胞 。首先转染细胞在嘌呤霉素(1 g/ml)中进行了选择，其次是Zeo (100 g/ml)中的选择。在转染的293-TK/Zeo 和 I4A 细胞中也获得了类似数目的嘌呤霉素抗性克隆，表明两种细胞系的转染效率是差不多的。Western分析显示：来自于转染的293-TK/Zeo或是I4A细胞的嘌呤霉素抗性克隆中都有Act1的表达。尽管Act1转染的293-TK/Zeo细胞中很多嘌呤霉素抗性克隆在Zeo选择下都存活了，但是转染的I4A细胞中这些克隆却是Zeo敏感的。综上，资料清楚地显示Act1不能激活I4A细胞中的NF-B，暗示这些突变株中缺失的蛋白对IL-1诱导的NF-B活化是很重要的，同样也是Act1介导的NF-B活化必需的。讨论 我们报道了NF-B活化蛋白的鉴定以及最初的特征。Act1可能是通过形成NIK-IKK复合物来激活NF-B的，因为NIK显性负性突变蛋白抑制了Act1诱导的NF-B活化。Act1 与IKK免疫共沉淀并活化IKK。有趣的是，在IL-1无应答的突变株I4A中Act1不能介导NF-B的活化，而此突变株缺乏未知的针对于IL-1诱导的NF-B活化的组分，暗示Act1可能参与IL-1信号途径或是相关途径。进一步关于Act1对于包括IL-1、TNF、LPS等在内的促炎症刺激因子应答的生物化学分析以及Act1相互作用蛋白的鉴定有助于揭示Act1介导的途径。Act1特异抗体的存在使得这些研究更容易进行。对Act1敲除鼠的分析研究又可以提供一些它的生理功能的信息。Act1也可以激活JNK。很多能够引起NF-B活化的配体，包括LPS、IL-1和TNF，都可以激活MAP激酶和JNK，而它们接着又磷酸化并激活转录因子ATF和AP-1（13-16）。与每种分类的受体邻近的信号元件都是唯一的。TRAF2、TRAF5和受体相互作用蛋白（RIP）激酶参与TNF途径，而TRAF6和IRAK参与Toll和IL-1途径。这些不同的信号都汇聚于IKK以